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Les méthodes de production de nanoparticules lipidiques (LNP) à base de microfluidique ont attiré l’attention dans les systèmes d’administration de médicaments (DDS), y compris l’administration d’ARN. Ce protocole décrit les processus de fabrication, de production de LNP (LNP chargé de siRNA) et d’évaluation LNP à l’aide de notre dispositif microfluidique original nommé iLiNP.
Le développement de nanoparticules lipidiques fonctionnelles (LNP) est l’un des défis majeurs dans le domaine des systèmes d’administration de médicaments (DDS). Récemment, les systèmes d’administration d’ARN basés sur LNP, à savoir les LNP chargés d’ARN, ont attiré l’attention pour la thérapie par ARN. En particulier, les vaccins LNP chargés d’ARNm ont été approuvés pour prévenir la COVID-19, ce qui a conduit au changement de paradigme vers le développement de nanomédicaments de nouvelle génération. Pour les nanomédicaments à base de LNP, la taille du LNP est un facteur important dans le contrôle de la biodistribution LNP et des performances LNP. Par conséquent, une technique précise de contrôle de la taille du LNP est indispensable pour le processus de production du LNP. Ici, nous rapportons un protocole pour la production de LNP à taille contrôlée à l’aide d’un dispositif microfluidique, nommé iLiNP. Les LNP chargés en siRNA sont également produits à l’aide du dispositif iLiNP et évalués par expérience in vitro . Des résultats représentatifs sont présentés pour la taille du LNP, y compris les LNP chargés en siRNA, le potentiel Z, l’efficacité de l’encapsulation du siRNA, la cytotoxicité et l’activité de silençage du gène cible.
La nanoparticule lipidique (LNP) est l’un des nanotransporteurs les plus utilisés pour les systèmes d’administration d’ARN. Récemment, les LNP chargés d’ARNm ont été approuvés comme vaccins pour la prévention de la COVID-191,2,3. En général, la taille du LNP joue un rôle crucial dans la performance des systèmes de biodistribution et d’administration de médicaments (DDS), y compris le silençage génique ou l’expression des protéines4,5,6. Par conséquent, une méthode précise de contrôle de la taille du LNP est nécessaire pour le processus de production du LNP.
Pour la production de LNP à taille contrôlée, les dispositifs microfluidiques ont attiré l’attention au fil des ans7. En 2018, le premier LNP chargé de siRNA approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) (par exemple, Onpattro) a été développé à l’aide du dispositif microfluidique8,9. Dans la méthode de production de LNP à base de microfluidique, une solution lipidique et une solution aqueuse sont introduites séparément dans le dispositif microfluidique, puis mélangées dans le microcanal. Pour améliorer l’efficacité du mélange, le mélangeur chaotique a été utilisé pour la production LNP10,11,12. Le mélangeur chaotique permet de produire des LNP de taille spécifique.
Un dispositif microfluidique simple, appelé production invasive de nanoparticules lipidiques (iLiNP), équipé de structures de déflecteurs, a été développé pour contrôler la taille du LNP avec précision13,14. En comparaison avec le mélangeur chaotique, le dispositif iLiNP était capable de contrôler la taille LNP allant de 20 à 100 nm à des intervalles de 10 nm. En outre, le dispositif iLiNP a produit des LNP6 chargés en siRNA, des LNP15 chargés en ARNm, des LNP16 chargés en ribonucléoprotéines16 et des LNP de type exosome17. L’objectif de cet article est d’introduire le processus de fabrication et de production de LNP chargé d’ARN du dispositif iLiNP et de décrire le processus d’évaluation du LNP produit par le dispositif iLiNP.
1. Fabrication de l’appareil iLiNP
REMARQUE: Le dispositif iLiNP est fabriqué à l’aide de la méthode de lithographie logicielle standard18. Le protocole de fabrication détaillé a été signalé précédemment10,13.
2. Préparation de solutions lipidiques
3. Préparation de solutions aqueuses
4. Préparation de la solution siRNA/tampon
5. Configuration de l’appareil iLiNP et production de LNP
REMARQUE : Voir la figure 1 pour les schémas.
6. Dialyse de la suspension LNP et mesure de la taille LNP
7. Mesure du potentiel Z du LNP
REMARQUE: Pour la mesure du potentiel Z, un analyseur de particules (voir tableau des matériaux) a été utilisé conformément aux instructions du fabricant.
8. Efficacité de l’encapsulation du siRNA par le test RiboGreen
REMARQUE: Le test Ribogreen est effectué pour évaluer l’encapsulation du siRNA dans les LNP19. Le test Ribogreen peut mesurer la quantité d’ARN à l’intérieur et à l’extérieur des SNP avec / sans tensioactif (par exemple, TritonX-100).
9. Culture cellulaire
10. Essai de viabilité cellulaire
11. Test d’élimination du gène de la luciférase
La figure 2A,B montre la distribution de la taille du PNL POPC produite dans différentes conditions d’écoulement. La méthode de préparation de LNP à base de microfluidique peut contrôler la taille des LNP par les conditions d’écoulement telles que le débit total (TFR) et le FRR. Par rapport aux dispositifs microfluidiques typiques, y compris le mélangeur chaotique et le dispositif microfluidique focalisant le flux, le dispositif iLiNP a permis un contrôle précis de la taille du LNP allant de 20 à 100 nm (Figure 2). Des LNP de petite taille se sont formés dans des conditions de débit total élevé. De plus, les tailles de LNP formées au FRR de 5 étaient plus petites que celles du FRR de 3, quel que soit le débit total13.
Les LNP chargés en siRNA ont également été préparés à l’aide du dispositif iLiNP (Figure 3A). Pour la préparation de LNP chargée de siRNA, DOTAP, un lipide cationique, a été utilisé pour encapsuler efficacement le siRNA dans les LNP. Le dispositif iLiNP a produit des LNP cationiques chargés en siRNA de taille 90 nm avec une distribution étroite (Figure 3A,B). L’efficacité d’encapsulation du siRNA était de 95 % en raison de l’interaction électrostatique entre le lipide cationique et les siRNA chargés négativement (Figure 3C).
La cytotoxicité et l’activité de silençage génique des SNP chargés en siRNA de taille 90 nm ont été évaluées, comme le montrent les figures 4 et 5. Les LNP chargés de siRNA ont montré une cytotoxicité à une dose de 10 et 100 nM siRNA. Nous avons également confirmé que le niveau d’expression de la luciférase était diminué en fonction de la concentration de siRNA. Les LNP chargés de siRNA ont supprimé l’expression de la luciférase à 80% à une dose de 100 nM siRNA. L’effet de la taille de la LNP sur l’activité de silençage génique a été rapporté précédemment6,13,17.
Figure 1 : (A) Illustration schématique et (B) photographie du dispositif iLiNP. Le dispositif iLiNP comprend des substrats PDMS et en verre. L’appareil iLiNP est connecté aux capillaires PEEK avec une supercolle. Les solutions lipidiques et siRNA/tampon sont introduites séparément dans le dispositif iLiNP à l’aide de pompes à seringues. La suspension LNP est collectée dans un microtube. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Distributions de taille LNP POPC produites par le dispositif iLiNP aux différents rapports de débit (FRR). La taille du LNP POPC est mesurée par diffusion dynamique de la lumière (DLS). Les SNP POPC sont préparés en modifiant le débit total et le FRR: (A) 3 FRR et (B) 5 FRR. Les LNP de petite taille sont formés dans des conditions de débit total élevé. De plus, les tailles de LNP formées au FRR de 5 étaient plus petites que celles du FRR de 3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Caractérisation des SNP chargés en siRNA. (A) Distribution granulométrique des LNP chargés en siRNA. Les siRNA (siGL4) sont encapsulés dans les LNP par interaction électrostatique entre le lipide cationique (DOTAP) et les siRNA chargés négativement. (B) Potentiel Z des LNP chargés en siRNA. La suspension LNP a été diluée avec un tampon HEPES de 10 mM (pH 7,4) avant la mesure. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± et de développement durable (écart-type). n = 3. (C) efficacité d’encapsulation du siRNA des LNP à base de DOTAP. L’efficacité d’encapsulation a été déterminée par le test RiboGreen. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± SD. n = 3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Cytotoxicité des LNP chargés en siRNA. Les LNP chargés de siRNA ont été dilués avec du DMEM (FBS (-)) pour obtenir les concentrations de siGL4 de 10 et 100 nM. Les suspensions LNP sont ajoutées aux cellules HeLa-dLuc et incubées pendant 4 h à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2. N.T. : Non traité (D-PBS(-)). Les données sont représentées comme la moyenne ± ET. n = 3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Activité d’élimination du gène de la luciférase traitée avec des LNP chargés de siRNA. Les LNP chargés de siRNA sont préparés de la même manière que le test de viabilité cellulaire. Le niveau d’expression de la luciférase est mesuré à l’aide du système de dosage de la luciférase Dual-Glo. N.T. : Non traité (D-PBS(-)). Les données sont représentées comme moyenne ± ET N= 3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
La taille du LNP affecte la biodistribution du LNP, l’effet anti-tumoral et les performances de silençage génique. Par conséquent, la méthode de contrôle de la taille LNP est une technique importante pour la production de nanomédicaments DDS, y compris les systèmes d’administration d’ARN. L’objectif de cet article est de présenter le dispositif iLiNP pour un réglage précis de la taille des LNP et son application à la production de LNP chargés de siRNA. L’appareil iLiNP était capable de contrôler la taille LNP comprise entre 20 et 100 nm (Figure 2)13. Lorsque les conditions d’écoulement, telles que le débit total et le FRR, sont modifiées pour contrôler la taille du LNP, la suspension LNP doit être collectée après environ 5 à 10 s pour stabiliser le débit de la solution. La suspension LNP recueillie à la sortie du dispositif iLiNP a été dialysée immédiatement contre la solution tampon pour éliminer l’éthanol et empêcher l’agrégation de LNP.
Le contrôle de la taille du LNP est l’un des défis majeurs dans le domaine de la DDS. Généralement, le processus de production LNP conventionnel, tel que la méthode d’hydratation du film lipidique, nécessite un processus de réglage de la taille après la production LNP20. D’autre part, la méthode de production de LNP à base de microfluidique peut produire les LNP à taille contrôlée en introduisant les solutions lipidiques et aqueuses dans le dispositif microfluidique6,11,13. Bien que le processus de dialyse soit nécessaire pour éliminer l’éthanol de la suspension LNP, un processus continu par le dispositif microfluidique couplé au système de flux tangentiel promet l’automatisation du processus de production LNP14. Selon la littérature, les tailles POPC LNP étaient de 50-60 nm et 30-60 nm, respectivement pour le dispositif microfluidique focalisant le débit21 et le dispositif mélangeur chaotique10. Comparé à d’autres dispositifs microfluidiques, le dispositif iLiNP permet le contrôle de la taille du POPC LNP dans une large plage de 20 à 100 nm.
Le processus de fabrication du dispositif iLiNP utilisé était la lithographie douce standard. Ainsi, le dispositif iLiNP peut être produit en série par une technique de prototypage rapide et prévenir la contamination croisée des solutions à l’aide d’un dispositif jetable. Le dispositif iLiNP peut produire des LNP chargés en siRNA de la même manière que la méthode de production POPC LNP. Pour la méthode de production LNP utilisant le périphérique iLiNP, l’utilisateur n’a pas besoin de procédures compliquées. Pour ces raisons, la méthode de production LNP à base microfluidique, y compris le dispositif iLiNP, devrait être utilisée comme méthode de production LNP standard. Le protocole de cet article peut être adapté à d’autres dispositifs microfluidiques pour la production de LNP. En outre, la production de LNP chargés d’ARNm est également activée en changeant la solution siRNA/tampon en une solution tampon contenant des ARNm.
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Ce travail a été soutenu par JST, CREST Grant Number JPMJCR17H1, Japon, JST, PRESTO Grant Number JPMJPR19K8, Japon, JST, SCORE, Japon, les dépenses d’éducation spéciale et de recherche du ministère de l’Éducation, de la Culture, des Sports, des Sciences et de la Technologie, JSPS KAKENHI Grant Number JP19KK0140 et Iketani Science and Technology Foundation.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | NOF Corp. | MC-6081 | |
1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (DMG-PEG2K) | NOF Corp. | GM-020 | |
1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium propane (DOTAP) | NOF Corp. | CL-8181TA | |
1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholinev (DSPC) | NOF Corp. | MC-8080 | |
10 x D-PBS (-) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. | 048-29805 | |
Acetic acid | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. | 017-00251 | |
CellTiter-Blue Cell Viability Assay | Promega | G8081 | |
cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667-5G | |
Desktop maskless lithography system | NEOARK CORPORATION | DDB-701-DL4 | |
Dialysis membrane | Repligen | 132697 | |
Dual-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2940 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | Lot: 42G6587K | |
G418 | Nacalai Tesque | 08973-14 | |
Glass substrate | Matsunami Glass Ind., Ltd. | S1111 | |
Glass syringe | Hamilton | GASSTIGHT 1002 | |
HeLa cell | HeLa-dluc cells were provided from Dr. Yusuke Sato at Hokkaido University | ||
HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. | 342-01375 | |
Low-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D6046-500ML | |
Oxygen plasma cleaner | Femto Science | CUTE-1MP/R | |
Penicillin–streptomycin, trypsin (2.5%) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Quant-iT RiboGreen RNA Reagent | Thermo Fisher Scientific | R11491 | |
siGL4 | Hokkaido System Science Co., Ltd | The sense and antisense strand sequences of siGL4 are 5'-CCGUCGUAUUCGUGAGCAATsT -3' and 5'-UUGCUCACGAAUACGACGGTsT -3', respectively. | |
Silicon wafer | GTC | ||
SILPOT 184 W/C (PDMS) | Dow Corning Toray Co., Ltd. | silicone base and curing agent are included | |
Sodium acetate | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. | 192-01075 | |
Sodium chloride | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. | 191-01665 | |
SU-8 3050 | Nippon Kyaku Co., Ltd. | ||
Syringe connector | Institute of microchemical Technology Co., Ltd. | ISC-011 | |
Syringe pump | Chemyx | CX07200 | |
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
TritonX-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977015 | |
Zetasizer Nano ZS | Malvern Instruments | ZEN3600 |
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