Quantification de l’impact potentiel des produits à base de glyphosate sur les microbiomes

Résumé

Les produits à base de glyphosate (GBP) sont les herbicides à large spectre les plus courants dans le monde. Dans cet article, nous présentons des lignes directrices générales pour quantifier l’effet de la GBP sur les microbiomes, des expériences sur le terrain aux analyses bioinformatiques.

Résumé

Les produits à base de glyphosate (GBP) sont les herbicides à large spectre les plus courants dans le monde. La cible du glyphosate est l’enzyme 5-énolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) dans la voie shikimate, qui est pratiquement universelle chez les plantes. L’inhibition de l’enzyme arrête la production de trois acides aminés essentiels: la phénylalanine, la tyrosine et le tryptophane. L’EPSPS est également présent chez les champignons et les procaryotes, tels que les archées et les bactéries; ainsi, l’utilisation de GBP peut avoir un impact sur la composition du microbiome des sols, des plantes, des herbivores et des consommateurs secondaires. Cet article vise à présenter des lignes directrices générales pour évaluer l’effet de la GBP sur les microbiomes, des expériences sur le terrain aux analyses bioinformatiques, et à fournir quelques hypothèses testables. Deux expériences sur le terrain sont présentées pour tester le GBP sur des organismes non ciblés. Tout d’abord, les microbes associés aux plantes provenant de 10 placettes de contrôle répliquées et de traitement GBP simulant des cultures sans labour sont échantillonnés et analysés. Dans la deuxième expérience, des échantillons de parcelles expérimentales fertilisées par du fumier de volaille contenant des résidus de glyphosate ou du fumier témoin non traité ont été obtenus. L’analyse bioinformatique des séquences de protéines EPSPS est utilisée pour déterminer la sensibilité potentielle des microbes au glyphosate. La première étape de l’estimation de l’effet de la GBP sur les microbiomes consiste à déterminer leur sensibilité potentielle à l’enzyme cible (EPSPS). Les séquences microbiennes peuvent être obtenues soit à partir de dépôts publics, soit au moyen d’une amplification par PCR. Cependant, dans la majorité des études sur le terrain, la composition du microbiome a été déterminée sur la base de marqueurs d’ADN universels tels que l’ARNr 16S et l’espaceur transcrit interne (ITS). Dans ces cas, la sensibilité au glyphosate ne peut être estimée que par une analyse probabiliste des séquences EPSPS utilisant des espèces étroitement apparentées. La quantification de la sensibilité potentielle des organismes au glyphosate, basée sur l’enzyme EPSPS, fournit une approche robuste pour d’autres expériences visant à étudier les mécanismes résistants cibles et non ciblés.

Introduction

L’utilisation intensive de pesticides dans l’agriculture moderne est clairement un contributeur majeur au déclin de la biodiversité¹. Cet article se concentre sur le glyphosate parce que les produits à base de glyphosate (GBP) sont devenus les pesticides les plus utilisés dans le monde en raison de leur efficacité et de leur prix abordable ^2,3. En plus de tuer les mauvaises herbes dans les champs agricoles, les GBP sont couramment utilisés dans la sylviculture, les environnements urbains et les jardins familiaux; en outre, ils ont été proclamés non toxiques pour les organismes non ciblés s’ils sont utilisés conformément aux instructions du fabricant. Cependant, un nombre croissant d’études récentes ont révélé que les résidus de glyphosate et de ses produits de dégradation peuvent être retenus et transportés dans les sols, ayant ainsi des effets en cascade sur les organismes non ciblés 4,5,6,7,8 . Les effets du glyphosate ne se limitent pas seulement aux plantes - la voie shikimate est également présente chez de nombreux champignons et procaryotes. Le glyphosate cible l’enzyme 5-énolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) dans la voie shikimate, également connue sous le nom d’aroA⁹. Cette enzyme est au centre de la voie shikimate dans la synthèse des trois acides aminés aromatiques essentiels (phénylalanine, tyrosine et tryptophane), et elle est présente chez la plupart des procaryotes, des plantes et des champignons^10,11. Certaines espèces microbiennes ont développé une résistance partielle ou absolue au glyphosate au moyen de plusieurs mécanismes, dont des mutations dans les séquences EPSPS. Ainsi, il a été suggéré que l’utilisation des GBP pourrait avoir un effet direct sur les microbiomes végétaux et animaux, y compris le microbiome intestinal humain 12,13,14. Néanmoins, l’utilisation de la GBP peut avoir un impact négatif sur pratiquement toutes les fonctions et services de l’écosystème reposant sur des microbes et des processus facilités par les microbes. Les menaces qui en découlent peuvent concerner les processus biochimiques du sol, la biologie de la pollinisation et le bien-être animal et humain. Cela nécessite une compréhension plus complète de la façon dont le glyphosate affecte les voies et les méthodes du shikimate pour évaluer la sensibilité des microbes au glyphosate.

Dans ce protocole, nous présentons un pipeline pour tester l’effet du glyphosate et du GBP sur le microbiome, des expériences sur le terrain aux analyses bioinformatiques. Nous décrivons en détail une méthode bioinformatique récemment publiée qui peut être utilisée pour déterminer la sensibilité potentielle des organismes au glyphosate¹². À la connaissance des chercheurs, il s’agit du premier et jusqu’à présent, du seul outil bioinformatique permettant d’évaluer la sensibilité intrinsèque de l’enzyme EPSPS au composant actif des GBP. Cette méthode bioinformatique est basée sur la détection de marqueurs d’acides aminés connus dans l’enzyme cible du glyphosate (EPSPS)¹². Le pipeline est divisé en cinq phases de travail principales (Figure 1) : 1) une brève introduction à deux expériences sur le terrain pour tester l’effet des GBP, 2) un bref résumé des analyses du microbiome (gène 16S aRNr, ITS et EPSPS ), 3) la collecte de séquences EPSPS à partir de dépôts publics, 4) la détermination de la sensibilité potentielle des organismes au glyphosate et 5) l’évaluation de la classe EPSPS à partir de marqueurs microbiens universels (ARNr 16S et STI).

Protocole

1. Deux expériences sur le terrain pour tester l’effet des GBP

REMARQUE: Ce protocole présente deux exemples de plans expérimentaux sur le terrain pour tester l’effet des GBP sur les microbes associés aux plantes. Les deux expériences ont été menées dans des champs mis en jachère sans antécédents d’herbicides ou d’utilisations agricoles au Jardin botanique Ruissalo de l’Université de Turku en Finlande (60º26'N, 22º10'E). Le sol est argileux sableux avec une forte proportion de matière organique.

1. Expérience 1
   REMARQUE: Cette expérience a été conçue pour simuler les pratiques agricoles générales de l’agriculture sans labour avec des applications GBP avant et après la saison de croissance pour lutter contre les mauvaises herbes.
   1. Diviser le champ expérimental en 10 placettes de contrôle et de traitement GBP répliquées (23 m x 1,5 m) avec des bandes tampons de végétation entre les parcelles (dans cette étude du printemps 2014¹⁵) (Figure 2).
   2. Assurez-vous que les parcelles sont labourées avec une motobineuse rotative à une profondeur de 5 cm et traitées deux fois par an. Ici, les parcelles ont été traitées au début (mai) et à la fin (octobre) de la saison de croissance.
   3. Traiter les placettes témoins avec de l’eau du robinet (5 L/parcelle) et les placettes GBP avec des GBP commerciales (concentration de glyphosate 450 g· ^L-1, taux d’application de 6,4 L·^ha-1 sur 5 L d’eau du robinet par parcelle) pour imiter la dose maximale autorisée de glyphosate dans les pratiques agricoles (3 kg·^ha-1).
   4. Appliquez les traitements avec un réservoir sous pression actionné à la main et doté d’un pulvérisateur manuel. Deux semaines après la demande de GBP, semez de l’avoine (Avena sativa), des fèves (Vicia faba), du colza de navet (Brassica rapa subsp. oleifera) et plantez des pommes de terre (Solanum tuberosum) dans les parcelles selon les pratiques agricoles.
   5. Pendant la saison de croissance, désherbez à la main les parcelles pour que la concurrence végétale et la structure du sol soient aussi similaires que possible dans les parcelles de contrôle et traitées en GBP.
   6. Échantillonnez le microbiote à partir de plantes expérimentales. Dans cette étude, le microbiote a été échantillonné consécutivement de 2017 à 2020 dans les parcelles de traitement traitées par GBP et de traitement témoin une fois par saison de croissance au cours de l’étude.
   7. Prélever dix répliques des échantillons de plantes (racines et feuilles) sur le terrain, les placer immédiatement sur de la glace et les apporter au laboratoire pour un traitement ultérieur, comme décrit à la section 2.1.
2. Expérience 2
   NOTE: Cette expérience a été conçue pour tester les risques associés à l’économie alimentaire circulaire; plus précisément, il a été conçu pour examiner les conséquences des résidus de GBP dans le fumier appliqué comme engrais aux plantes cultivées² (Figure 3).
   1. Recueillir les litières, y compris les copeaux de bois, les excréments et certains aliments renversés, des cailles nourries avec des aliments contaminés par gbp ou des aliments de contrôle dans une volière de 12 mois^16,17.
      NOTE: Les aliments contaminés par GBP étaient constitués d’aliments biologiques pour poulets pondeurs combinés à un équivalent de 160 mg de glyphosate / kg, ce qui correspond à un apport quotidien de 12 à 20 mg de glyphosate par kilogramme de masse corporelle chez les cailles japonaises adultes^16,17.
   2. Pour validation, envoyez les échantillons à un laboratoire accrédité pour des mesures de concentration de glyphosate dans six lots d’aliments.
   3. De plus, mesurez les résidus de glyphosate dans les échantillons d’excréments de caille après 12 mois d’exposition. Le groupe témoin a reçu le même aliment biologique sans ajout de^{GBP 16,17}.
   4. Pendant l’expérience de la volière, changez les draps toutes les deux semaines. Recueillir régulièrement les litières usagées de 8 à 12 mois d’exposition à partir du traitement et des contrôles GBP, piscine par traitement, et stocker dans des récipients fermés dans une pièce de stockage sèche et sombre à 6 ° C avant de les utiliser comme engrais.
   5. Étalez manuellement 12 L des litières sur chacune des parcelles de contrôle de 18 GBP et 18 (taille 1 m x 1 m) dans une grille d’échiquier 6 x 6 dans le champ expérimental à deux points temporels. Dans cette étude, les litières ont été éparpillées en août 2018 et en mai 2019.
   6. Envoyez les échantillons de litière à un laboratoire accrédité pour les mesures de concentration de glyphosate directement après sa propagation (dans cette étude en mai 2019).
   7. Plantez des graminées vivaces et des fraisiers dans chaque parcelle pour étudier leur microbiote racinaire et foliaire.
      NOTE: Dans cette étude, quatre plantes herbacées vivaces (Festuca pratensis) et deux fraisiers (Fragaria x vescana) ont été plantés sur chaque parcelle et étudiés pour leur microbiote racinaire et foliaire.

2. Analyses du microbiome (ARNr 16S, gène ITS et EPSPS )

REMARQUE: La plupart des études sur le microbiome sont basées sur l’analyse du gène de l’ARNr 16S pour les régions bactériennes et internes transcrites (ITS) pour les communautés fongiques à l’aide de technologies de séquençage de nouvelle génération. Ainsi, le document ne contient pas d’informations sur le type d’EPSPS. Les séquences EPSPS de milliers d’espèces sont disponibles dans des dépôts publics (section 3 du Protocole) (Figure 4).

1. Gène de l’ARNr 16S
   1. À partir des échantillons de feuilles et de racines détachées prélevés dans les expériences décrites ci-dessus, identifiez les microbes endophytes (c.-à-d. les microbes vivant à l’intérieur des tissus végétaux).
   2. Lavez les échantillons de plantes avec de l’eau du robinet, puis stérilisez-les pour éliminer les microbes épiphytes (c.-à-d. les microbes à la surface des tissus végétaux). Stériliser à l’aide d’eau de Javel à 3 % pendant 3 min, suivi d’une solution d’éthanol à 70 % pendant 1 min, et laver trois fois avec de l’eau ultrapure autoclavée pendant 1 min chacune.
   3. Congeler les échantillons à -80 °C jusqu’à l’extraction de l’ADN génomique.
   4. Effectuer une extraction d’ADN génomique à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN végétal disponible dans le commerce en suivant le protocole du fabricant.
   5. Ciblez les régions variables V6-V8 du gène de l’ARNr 16S à partir d’échantillons d’ADN extraits en utilisant une approche imbriquée avec des amorces discriminantes qui se lient spécifiquement à l’ADN bactérien¹⁸, minimisant ainsi l’amplification de l’ADN de la plante hôte.
   6. Après trois cycles de réaction en chaîne par polymérase (PCR), marquez le gène cible avec des séquences de code-barres et d’adaptateur pour le préparer comme modèle de séquençage. Suivez les étapes 2.1.7 à 2.1.11 pour l’amplification PCR
   7. Préparer le mélange maître pcR pour le nombre requis d’échantillons afin que chaque réaction ait un volume total de 30 μL et se compose de 30 ng d’ADN, de 1x tampon PCR, de 0,2 mM de dNTP, de 0,3 μM de chaque amorce et de 2000 U/mL d’ADN polymérase. Suivez la même étape pour les deuxième et troisième cycles de PCR.
   8. Pour la première série de PCR, utilisez les amorces 799F¹⁹ et 1492R (modifiées à partir de²⁰) (tableau 1). Configurer le profil d’amplification sur le thermocycleur (dénaturation initiale de 3 min à 95 °C, suivie de 35 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 45 s, recuit à 54 °C pendant 45 s et extension à 72 °C pendant 1 min). Effectuer l’extension finale à 72 °C pendant 5 min.
   9. Comme modèle pour la deuxième série de PCR, vérifier l’amplification par électrophorèse (5 μL des produits PCR sur gel d’agarose à 1,5%), puis diluer le reste 25 μL du produit PCR dans de l’eau ultrapure autoclavée dans un rapport de 1:10.
   10. Répétez la PCR avec les gabarits et amorces de PCR dilués uni-1062F²¹ et uni-1390R²² (Tableau 1). Maintenir les mêmes conditions de réaction PCR et le même profil d’amplification (étape 2.1.8), sauf en réduisant le nombre de cycles à 25.
   11. Diluer les produits PCR obtenus dans de l’eau ultrapure autoclavée dans un rapport de 1:1. Effectuez le troisième tour de PCR pour étiqueter les produits avec les codes-barres et la séquence d’adaptateur P1 avec 8 cycles du même profil PCR que celui mentionné à l’étape 2.1.8.
2. Préparation de la bibliothèque
   1. Vérifier la concentration et la qualité des produits de PCR sur un bioanalyseur et regrouper les volumes constituant 30 ng d’ADN de chaque échantillon dans un tube de 1,5 mL pour préparer une bibliothèque équimolaire.
   2. Sélectionnez les amplicons de taille 350-550 bp par fractionnement de taille à l’aide d’un système automatisé de sélection de la taille de l’ADN sur une cassette de gel d’agarose. Notez que cela élimine également les amplicons non spécifiques et les réactifs PCR de la bibliothèque. Recueillir l’élute constitué d’amplicons de la taille spécifiée dans un flacon dans la cassette, ce qui donne une bibliothèque de gènes d’ARNr 16S purifiée.
   3. Pipeter l’éluat dans un tube de 1,5 mL et vérifier la pureté et la concentration sur le bioanalyseur. Diluer la bibliothèque d’ADN à l’aide d’eau ultrapure autoclavée jusqu’à une concentration finale de 26 pM; l’échantillon est prêt pour le séquençage.
3. SON
   REMARQUE : La région ITS est amplifiée à l’aide d’amorces spécifiques aux STI (tableau 1), et le produit PCR obtenu est étiqueté avec des codes-barres et une séquence d’adaptateur P1 pour le séquençage.
   1. Préparer le mélange maître PCR selon le même protocole que celui mentionné à la section 2.1 avec des amorces ITS .
   2. Définissez le profil d’amplification sur le thermocycleur comme une dénaturation initiale de 5 minutes à 95 °C suivie de 35 cycles de dénaturation, de recuit et d’extension à 95 °C pendant 30 s, 55 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 1 min, respectivement, et l’extension finale 72 °C pendant 7 min.
   3. Analyser 5 μL du produit PCR sur du gel d’agarose à 1,5 % et diluer les 25 μL restants à 1:10 à l’aide d’eau ultrapure autoclavée. Utilisez le produit PCR dilué comme modèle pour la deuxième série de PCR.
   4. Préparez le mélange maître PCR pour le nombre requis d’échantillons (reportez-vous à l’étape 2.1.6) avec des amorces avant marquées par code-barres et des amorces inverses marquées par adaptateur P1. Amplifier avec le même profil d’amplification qu’à l’étape 2.3.2, sauf en utilisant 8 cycles.
   5. Préparer les produits PCR résultants pour le séquençage conformément aux protocoles mentionnés à la section 2.2.
4. Gène EPSPS
   1. Séquencer et analyser les gènes EPSPS des microbes.
      REMARQUE: Dans l’intérêt de déterminer si l’exposition à la GBP a modifié la composition des microbes sensibles et résistants au glyphosate dans la communauté, les gènes EPSPS des microbes doivent être séquencés et analysés. Ainsi, 353 séquences de gènes EPSPS provenant d’une vaste collection de taxons microbiens dans la base de données ATGC (Alignable Tight Genomic Clusters) ont été recueillies, et toutes les séquences de protéines ont été alignées²². Ces alignements sont disponibles dans la base de données^{ATGC 23} et peuvent être utilisés pour générer des amorces à partir de régions conservées. Un outil de bioinformatique facile à utiliser est conçu pour identifier les régions conservées à partir d’un alignement de séquences multiples, et il est disponible à la page^{de recherche 24} de Pere Puigbo. Cependant, il n’entre pas dans le cadre de cette publication de fournir une description détaillée de ce serveur Web. Néanmoins, un protocole prospectif pour utiliser ces amorces pour l’amplification du gène EPSPS afin de trouver la sensibilité du microbiome au glyphosate est fourni dans la figure 4.

3. Collecte de séquences de protéines EPSPS à partir de dépôts publics

1. Séquences EPSPS à utiliser dans les études de macroévolution
   1. Recueillir des protéines EPSPS à partir de dépôts publics tels que PFAM²³ (une base de données des familles de protéines²⁵), GenBank²⁴ (une base de données de gènes, de génomes et de protéines²⁶ ), COG²⁵ (Clusters of Orthologous Groups²⁷; une base de données de protéines orthologues d’archées et de bactéries); et PDB²⁶ (Protein Data Bank²⁸; une base de données sur les structures protéiques).
      NOTE: Une étude récente menée par les chercheurs a montré que ces protéines pourraient être utilisées pour effectuer des analyses microévolutives et comparatives de l’effet potentiel du glyphosate sur les organismes ayant la voie shikimate¹². Les auteurs ont développé un site Web convivial qui rassemble des informations sur des dizaines de milliers de séquences de protéines EPSPS²⁹, y compris un ensemble de données organisé manuellement de protéines du microbiome intestinal humain¹². Les informations contenues dans ces ensembles de données précalculés comprennent la classification actuelle de l’EPSPS en supposé sensible et résistant au glyphosate, des informations taxonomiques sur les espèces, des annotations du site actif de l’EPSPS et des liens vers les bases de données PDB et NCBI. De plus, le serveur web comprend les codes d’identification de l’EPSPS et des liens vers plusieurs bases de données externes (tableau 2).
2. Séquences EPSPS à utiliser dans les études de microévolution ATGC
   REMARQUE: Les dépôts généraux de séquences de protéines sont utiles pour mener des études comparatives parmi des organismes relativement éloignés; cependant, l’effet potentiel du glyphosate est relativement récent d’un point de vue évolutif. Ainsi, dans certaines études, il est nécessaire de comparer des espèces étroitement apparentées (par exemple, différentes souches de la même espèce bactérienne) pour déterminer l’effet du glyphosate¹⁴. Dans ces cas, la base de données alignable Tight Genomic Clusters (ATGC)³⁰, qui contient une liste complète de génomes archéaux et bactériens étroitement liés, est une ressource plus appropriée. La base de données ATGC contient des informations sur plusieurs millions de protéines provenant de milliers de génomes organisés en centaines de clusters³⁰. Chaque groupe de génomes est alignable (les génomes partagent la synténie sur ≥85% de leurs longueurs) et serré (ayant un taux de substitution synonyme inférieur à la saturation). Les chercheurs ont utilisé l’ensemble de données ATGC dans une étude récente pour analyser les changements microévolutifs dans les protéines EPSPS¹⁴. Les étapes suivantes sont nécessaires pour identifier la séquence de protéines EPSPS dans l’ATGC :
   1. Téléchargez toute la base de données des ATGC à partir du lien³¹ et toutes les protéines du COG0128 (code correspondant aux protéines EPSPS dans la base de données)³² dans un projet local.
      REMARQUE: Si les chercheurs / expérimentateurs sont basés en Finlande, le CSC-IT Center for Science³³ fournit des installations de stockage et de logiciels. Il est important de rassembler toutes les séquences au format FASTA.
   2. Construit une base de données de blast du COG0128 qui contient des orthologues de la protéine EPSPS dans un ensemble représentatif d’espèces de procaryotes. Le CSC a le programme blast³⁴ préinstallé, permettant l’utilisation de la commande makeblastdb -in COG0128.fa -dbtype prot pour créer une base de données de référence de séquences EPSPS.
   3. Mappez la base de données ATGC sur le COG0128.fa (protéines EPSPS) à l’aide d’une recherche itérative blast avec la commande blastp -query [ATGC_X.fa] -db [COG0128.fa] -max_target_seqs 1 -outfmt 6 -out tmpfile -evalue 1e-150.
   4. En conséquence, il crée un ensemble de données de séquences de protéines EPSPS dans chacune. Un ensemble de données précalculées de séquences de protéines EPSPS étroitement liées de la base de données ATGC est disponible²⁹.

4. Algorithme pour déterminer la sensibilité potentielle des organismes au glyphosate (serveur Web EPSPSClass: entrées, traitement et sorties)

REMARQUE: Les chercheurs ont mis en œuvre un serveur facile à utiliser qui est disponible gratuitement à ²⁹ pour déterminer la classe de séquences de protéines EPSPS^12,35. Le serveur ne nécessite qu’une entrée de séquence protéique au format FASTA pour déterminer le pourcentage d’identité de chacune des classes EPSPS et leur sensibilité potentielle au glyphosate. De plus, les utilisateurs peuvent utiliser le serveur Web pour tester leurs propres séquences de référence et marqueurs d’acides aminés. Tout d’abord, l’algorithme (Figure 5) aligne les séquences de requête et les séquences de référence à l’aide d’un programme d’alignement de séquences multiples³⁵ pour déterminer les positions des acides aminés. Ensuite, il recherche la présence de marqueurs d’acides aminés pour identifier la classe EPSPS (I, II, III ou IV) de la séquence de requête.

1. Introduisez une séquence de protéines EPSPS au format FASTA dans la zone de texte de saisie pour identifier la classe de l’enzyme (Figure 6A), puis appuyez sur Envoyer.
2. Évaluer la sensibilité potentielle de la séquence de requêtes au glyphosate (Figure 6B-E) à partir des résultats fournis par le serveur :
   Sortie 1 : Fraction des marqueurs d’acides aminés (c.-à-d. identité) présents dans les séquences de requête (classe I, II et IV) et nombre de motifs (classe III).
   Résultat 2 : Alignements des séquences de requête et de référence en fonction des résidus de marqueurs.
   Sortie 3 : Alignements complets par paires des séquences de requête et de référence.
   Sortie 4 : Séquences de référence EPSPS : Vibrio cholerae(vcEPSPS, classe I), Coxiella burnetii(cbEPSPS, classe II), Brevundimonas vesicularis(bvEPSPS, classe III), Streptomyces davawensis(sdEPSPS, classe IV).
3. À la fin de la page de sortie, recherchez des liens vers des outils externes tels que blastp et des domaines conservés pour analyser plus en détail la séquence EPSPS de requête (Figure 6F).

5. Évaluation de la classe EPSPS à partir de marqueurs microbiens universels (ARNr 16S et STI )

REMARQUE: La plupart des études sur le microbiome sont basées sur l’analyse de l’ARNr 16S et / ou de l’ITS³⁶. Dans de tels cas, il n’est pas possible d’effectuer une analyse directe de la séquence EPSPS. Ainsi, une approche probabiliste pour estimer la sensibilité potentielle des organismes au glyphosate est nécessaire. Cette analyse est simple et fournit une estimation raisonnable du type de séquences EPSPS dans un projet de microbiome. Le processus est divisé en 3 étapes (Figure 7 et Figure 8) :

1. Identifiez les séquences EPSPS à partir de référentiels publics. La classe EPSPS d’un ensemble complet de séquences représentatives a été compilée et précalculée à partir de PFAM³⁷, GenBank³⁸, COG³⁹, PDB⁴⁰, ATGC³⁰. Accédez à ces ensembles de données à partir de la page principale du serveur EPSPSClass, contenant des informations taxonomiques et la classe EPSPS de plus de 50 000 séquences (Figure 7).
2. Mesurez la hauteur des plantes expérimentales toutes les deux semaines pendant la saison de croissance et pesez la biomasse aérienne des plantes à la fin de la saison sur le terrain pour comparer la croissance des plantes dans les parcelles GBP et de contrôle.
   NOTE: Les analyses du microbiote issues des expériences sur le terrain n’ont pas encore été entièrement analysées.
3. Utilisez une feuille de calcul pour cartographier les OTU bactériens (basés sur l’ARNr 16S ou ITS) des expériences de microbiome dans des ensembles de données pré-calculés.
   NOTE: Des études antérieures ont montré que la classe EPSPS (c’est-à-dire la sensibilité intrinsèque au glyphosate) est hautement conservée dans un groupe phylogénétique¹⁴. Ainsi, il est relativement prudent de supposer que des espèces étroitement apparentées provenant de taxons hautement conservés peuvent avoir des réponses EPSPS similaires au glyphosate (figure 8).
4. Dans la même feuille de calcul, calculez la sensibilité intrinsèque au glyphosate, sur la base d’un score probabiliste (S = s / (s + r + u) où S: score de sensibilité; s: nombre de séquences potentiellement sensibles; r: nombre de séquences potentiellement résistantes; u: nombre de séquences non classifiées) calculé à partir de séquences EPSPS connues dans des bases de données publiques.
   NOTE : Ce score varie de 0 (aucune séquence EPSPS sensible n’est trouvée dans un taxon) à 1 (toutes les séquences d’un taxon sont sensibles au glyphosate) (Figure 8). De plus, il existe des valeurs intermédiaires, c’est-à-dire des espèces dont les souches sont sensibles, résistantes ou inconnues.

Résultats

L’objectif de ce protocole est de fournir un pipeline général, des expériences sur le terrain aux analyses bioinformatiques, qui quantifie la sensibilité potentielle des organismes à l’herbicide glyphosate. Dans l’expérience 2, la concentration moyenne de glyphosate dans l’alimentation des cailles était de 164 mg / kg et la concentration moyenne de glyphosate des échantillons d’excréments (urine et matières fécales combinées) était de 199 mg / kg. Les litières prélevées sur des cailles nourries avec des aliments contaminés par la GBP contenaient, en moyenne, 158 mg/kg et les litières témoins mesuraient 0,17 mg/kg de glyphosate (tableau 3). Dans les expériences sur le terrain, les espèces végétales ont réagi différemment aux résidus de glyphosate dans les sols (section 1). La biomasse de l’avoine et du colza était plus importante dans les sols témoins que dans les sols traités au GBP. Cependant, les fèves et les pommes de terre semblaient bénéficier d’un traitement GBP à la fin de la saison de croissance¹⁵. Le glyphosate dans le fumier de volaille a diminué la croissance des plantes dans l’herbe (Festuca pratensis) et la fraise (Fragaria x vescana) (section 1). Les analyses du microbiote issues des expériences sur le terrain n’ont pas encore été entièrement analysées et ne sont pas présentées ici (section 2). Les résultats de ce protocole, lorsqu’ils sont lus directement (comme indiqué aux rubriques 3 et 4) ou indirectement (section 5), fournissent une mesure de la proportion d’organismes potentiellement sensibles et résistants au glyphosate dans un ensemble de données (Figure 9). L’utilisation de cette méthode a été testée avec une collection de séquences de protéines EPSPS provenant d’espèces microbiennes du microbiome intestinal humain de base qui ont été obtenues à partir de dépôts publics¹². Dans l’étude, 890 souches des 101 espèces bactériennes les plus abondantes ont été analysées avec la méthode EPSPSClass pour quantifier la proportion de bactéries sensibles et résistantes. Les résultats ont montré que 54% des espèces du microbiome intestinal humain central sont potentiellement sensibles au glyphosate¹². Cette tendance est également observée dans la plupart des pays procaryotes; de plus, chez les eucaryotes (principalement les plantes et les champignons), la proportion d’espèces potentiellement sensibles est encore plus élevée¹². De plus, nous avons utilisé cette méthode pour quantifier les changements de sensibilité de la protéine EPSPS à un niveau microévolutif (Figure 10)¹⁴. Nous avons identifié des changements dans l’état de sensibilité dans 12 des 32 groupes étroitement apparentés de procaryotes analysés (tableau 4)¹⁴. Ainsi, l’utilisation continue des GBP peut produire une dysbiose microbienne (c’est-à-dire un déséquilibre des espèces bactériennes sensibles et résistantes) dans les microbiomes des plantes, des animaux et du sol. De plus, on a émis l’hypothèse qu’une augmentation des bactéries résistantes au glyphosate pourrait favoriser les microbiomes multirésistants 14,41,42. Ainsi, ce protocole éclaire l’interprétation de tous ces scénarios, puisque la méthode de classification EPSPS fournit une estimation directe de la sensibilité intrinsèque des microbiomes au glyphosate. En raison de la sensibilité intrinsèque de la protéine EPSPS au glyphosate conservée phylogénétiquement¹⁴, il est possible d’extrapoler les résultats des ensembles de données existants dans des microbiomes inconnus (Figure 8).

Figure 1 : Pipeline général Il s’agit d’un pipeline général pour analyser la sensibilité à la GBP, des expériences sur le terrain à l’analyse bioinformatique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Expérience sur le terrain 1 pour tester les effets des résidus de GBP sur les microbes associés aux plantes cultivées. Le champ expérimental se compose d’une alternance de 10 placettes témoins et de 10 placettes de traitement GBP (23 m x 1,5 m) avec des bandes tampons de 1,5 m entre les parcelles. Deux fois par an depuis 2014, les parcelles GBP ont été traitées avec du GBP commercial (concentration de glyphosate 450 g L-1, taux d’application 6,4 L ha-1 dans 5 L d’eau du robinet par parcelle) et les parcelles témoins avec la même quantité d’eau du robinet sans glyphosate. Les traitements ont été appliqués avec un réservoir sous pression actionné à la main à l’aide d’une hotte en plastique dans la pointe de l’arroseur pour empêcher les GPP de se propager à l’extérieur des parcelles de traitement. Après une période de sécurité de deux semaines suivant la demande de GBP, de l’avoine (Avena sativa), des fèves (Vicia faba) et du colza de navet (Brassica rapa subsp. oleifera) ont été semés et des pommes de terre (Solanum tuberosum) ont été plantées dans les parcelles. Des échantillons de microbiote provenant des plantes cultivées, des feuilles et des racines étudiées, ont été prélevés à plusieurs reprises depuis le début de l’expérience en 2014. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : L’expérience sur le terrain 2 a testé les conséquences des résidus de GBP dans les engrais à fumier pour deux cultures pérennes et leur microbiote associé. Les litières recueillies lors d’une expérience de volière de 12 mois avec des cailles japonaises nourries avec des aliments témoins ou contaminés par gbp ont été utilisées comme engrais à fumier dans une expérience sur le terrain. Le champ expérimental se composait de 18 parcelles de contrôle et de 18 tranches GBP (1 m x 1 m) disposées dans une grille d’échiquier de 6 x 6. Les litières ont été étalées sur le terrain expérimental à deux reprises, en août 2018 et mai 2019 (25 L/parcelle). Les placettes témoins ont été fertilisées avec des litières prélevées sur des cailles nourries avec des aliments témoins et des placettes GBP avec des litières de cailles nourries avec des aliments contaminés par gbp. Les résidus de glyphosate dans les litières témoins étaient de 0,17 mg/kg de glyphosate et dans la litière GBP, la quantité était de 158 mg/kg de glyphosate. Deux endophytes-symbiotiques (E+), deux Festuca pratensis sans endophytes (E-) et deux Fragaria x vescana ont été plantés par parcelle en septembre 2018, environ un mois après la propagation des premières litières. Des mesures de la performance et de la condition physique des plantes ainsi que des échantillons pour le microbiote associé aux racines et aux feuilles ont été effectués au cours de deux saisons de croissance consécutives (2019 et 2020). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Analyse des taxons microbiens à l’aide du gène de l’ARNr 16S/région ITS et sensibilité des microbiomes au glyphosate à l’aide du gène EPSPS. (A) Analyse des séquences d’ARNr 16S ou des STI pour identifier les taxons microbiens. (B) Analyse des séquences EPSPS pour identifier la sensibilité des microbes au glyphosate (GS-glyphosate sensitive/GR-glyphosate resistant) Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5 : Algorithme permettant d’identifier la classe des séquences de protéines EPSPS. L’entrée est une séquence de protéines EPSPS au format FASTA. L’algorithme effectue des comparaisons avec des marqueurs d’acides aminés connus dans des séquences de protéines de référence qui déterminent la sensibilité potentielle au glyphosate. L’algorithme a été implémenté sur le serveur Web librement accessible EPSPSClass²⁹. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Entrées et sorties de base du serveur Web EPSPSClass. (A) Entrée : séquence protéique EPSPS au format FASTA. (B) Sortie 1 - identité : fraction des marqueurs d’acides aminés présents dans les séquences de requête (classes I à IV) et les motifs (classe III). (C) Sortie 2 - identité : alignements des séquences de requête et de référence. (D) Sortie 3 - alignements par paires des séquences de requête et de référence. (E) Séquences EPSPS de référence: Vibrio cholerae (vcEPSPS, classe I), Coxiella burnetii (cbEPSPS, classe II), Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS, classe III), Streptomyces davawensis (sdEPSPS, classe IV). (F) Liens pour effectuer des recherches de blastp supplémentaires et l’identification des domaines conservés Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7 : Accès aux ensembles de données précalculés des séquences EPSPS. Suivez les indications de la figure pour accéder à l’ensemble de données précalculé des séquences EPSPS. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Exemple d’estimation de la sensibilité potentielle dans les projets de microbiome sans séquences EPSPS. L’exemple utilise des valeurs de la base de données alignable Tight Genomic Clusters³⁰, qui contient des séquences d’espèces procaryotes. Les espèces hypothétiques d’un projet de microbiome sont Staphylococcus aureus, Corynebacterium diphtheriae, Campylobacter jejuni, Chlamydia psittaci et Sulfolobus islandicus. Le score de sensibilité au glyphosate est calculé en Number_Sensitive_Sequences/Total_Number_Of_Sequences. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9 : Schéma de l’interprétation des résultats de ce protocole et scénarios d’évolution hypothétiques. (A) Dans un microbiome, la proportion de bactéries potentielles de sensibilité (en vert) et de résistance (en rouge) est d’environ 50:50. Les points noirs désignent des espèces microbiennes non classées; ainsi, leur sensibilité au glyphosate est inconnue. Dans certains microbiomes, la proportion de bactéries sensibles est légèrement plus élevée, comme dans le microbiome intestinal humain¹². (B) Au fil du temps, l’utilisation du glyphosate peut entraîner une dysbiose microbienne (c.-à-d. un déséquilibre dans la proportion de bactéries sensibles et résistantes) conduisant à différents scénarios hypothétiques. (C) Cas hypothétique 1 (pas de sélection) : L’utilisation du glyphosate n’influence pas le microbiome ; ainsi, la proportion de bactéries sensibles et résistantes reste constante. (D) Cas hypothétique 2 : L’utilisation du glyphosate élimine de la population les bactéries sensibles au glyphosate. Nous supposons que ce scénario pourrait dépendre de la dose. (E) Cas hypothétique 3 : La pression de sélection de l’utilisation du glyphosate améliore les mutations du gène EPSPS qui modifient l’état de sensibilité des bactéries. Ainsi, toute la population microbienne devient résistante au glyphosate. De plus, dans ce scénario, il pourrait y avoir une augmentation des bactéries multirésistantes. (F) Cas hypothétique 4 : l’utilisation du glyphosate modifie la composition de certaines espèces bactériennes, produisant un déséquilibre vers les bactéries résistantes, alors que certaines espèces bactériennes restent inchangées, peut-être en raison de mécanismes résistants supplémentaires tels que les pompes d’efflux ou par surexpression du gène EPSPS ¹³. Ce scénario peut également entraîner une augmentation des bactéries résistantes au glyphosate, ainsi qu’une augmentation de la résistance bactérienne à d’autres antibiotiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 10 : Répartition de la sensibilité prévue au glyphosate dans l’arbre de l’espèce. Les diagrammes circulaires indiquent la proportion d’espèces qui sont supposément sensibles (vert) ou résistantes (rouge) au glyphosate, et non classées (noir). Cette figure a été adaptée avec la permission de Rainio et ^al.14. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 11 : Entrées et sorties du serveur Web EPSPSClass pour tester la séquence de référence de l’utilisateur. (A) Entrée 1 : séquence de requête. (B) Entrée 2: séquence de référence. (C) Entrée 3: marqueurs d’acides aminés dans les séquences de référence. (D) Sortie: identité: fraction des marqueurs d’acides aminés dans les séquences de requête (classe I-IV et séquences de référence propres à l’utilisateur). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Liste des amorces pour l’amplification par PCR du gène de l’ARNr 16S et de la région ITS dans l’analyse du microbiome Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Codes de l’enzyme 5-énolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) dans différentes bases de données Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3 : Concentration moyenne de glyphosate Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 4 : Tableau récapitulatif du pourcentage d’espèces sensibles/résistantes au glyphosate. Ce tableau a été adapté avec la permission de Rainio et ^al.14. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 5 : Positions des marqueurs d’acides aminés dans les séquences de référence Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

Ce protocole fournit des conseils généraux sur la façon de quantifier l’effet de la GBP sur les microbiomes sur la base de l’analyse de la protéine EPSPS. Le protocole comporte trois grandes étapes critiques : (i) Quantification de la protéine EPSPS à partir des données du microbiome. Cette étape est essentielle car l’EPSPS est l’enzyme cible directe de l’herbicide. Ainsi, les espèces qui ont une copie du gène EPSPS peuvent être touchées par l’utilisation de GBP. Néanmoins, même les espèces qui n’ont pas de copie du gène EPSPS peuvent être touchées par l’herbicide par d’autres mécanismes non ciblés ^43,44. (ii) Si l’analyse du gène EPSPS n’est pas incluse dans la conception de l’étude, il est possible d’obtenir une bonne estimation en analysant l’ARNr 16S (bactéries) ou l’ITS (champignons). Dans ce cas, il est essentiel de s’appuyer sur un tableau de référence complet (p. ex., la base de données ATGC fournit des séquences de la protéine EPSPS de plusieurs espèces étroitement apparentées). (iii) La protéine EPSPS est divisée en protéines potentiellement sensibles ou résistantes au glyphosate en fonction de certains résidus d’acides aminés du site actif de l’EPSPS. Cependant, des mutations affectant un seul acide aminé peuvent modifier cette classification⁴⁵ et des transitions entre les classes peuvent se produire dans un laps de temps relativement court¹⁴.

La sensibilité potentielle des organismes au glyphosate peut être déterminée par des génomes de référence, des marqueurs d’acides aminés et des alignements de séquences. i) Génomes de référence : L’enzyme EPSPS peut être classée comme potentiellement sensible (classe I [alpha ou bêta]^46,47) ou résistante (classes II^48,49, III⁵⁰ et IV⁵¹) au glyphosate en raison de la présence de marqueurs et de motifs d’acides aminés (dans le cas de la classe III). Ces marqueurs et motifs d’acides aminés sont basés sur l’emplacement des résidus d’acides aminés dans la protéine EPSPS de Vibrio cholerae (vcEPSPS, classe I), Coxiella burnetii (cbEPSPS, classe II), Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS, classe III) et Streptomyces davawensis (sdEPSPS, classe IV). (ii) Marqueurs d’acides aminés : Le glyphosate interagit avec l’enzyme EPSPS et entre en concurrence avec le phosphoénolpyruvate (PEP, le deuxième substrat de l’enzyme EPSPS)^52,53. Chez certaines espèces, de petits changements d’acides aminés dans la séquence EPSPS fournissent une affinité plus élevée pour la PPE et une résistance au glyphosate 12,14,52,54,55. Dans d’autres séquences, le glyphosate lie la séquence EPSPS dans une conformation non inhibitrice ⁴⁵. Bien que de nombreuses séquences résistantes au glyphosate ^{12,14,48,49,52,54,55} et tolérantes à ^56,57 EPSP aient été décrites, le système de classification actuel de l’EPSPS est divisé en quatre classes principales (I-IV)¹² (Tableau 5 ). (iii) Alignements de séquences : Afin de classer une enzyme EPSPS, nous avons effectué des alignements par paires, avec un programme d’alignement de séquences multiples - paramètres par défaut³⁵ -, de la séquence de requête par rapport à chacune des séquences de référence (vcEPSPS, cbEPSPS, bvEPSPS et sdEPSPS). Ces alignements sont nécessaires pour identifier les positions des marqueurs d’acides aminés dans la séquence de requête. En conséquence, une enzyme est classée comme décrite dans les classes^I, II et/ou IV décrites en fonction de la présence de marqueurs d’acides aminés et de marqueurs de motifs à base de classe III.

Le protocole est basé sur quatre types connus d’EPSPS : un type est sensible, les trois autres sont résistants). Cependant, environ 10 % des séquences d’EPSPS chez les procaryotes ne sont pas encore classées (16 % chez les archées et 8 % chez les bactéries)¹². Ainsi, d’autres recherches devraient analyser ces séquences pour déterminer la sensibilité au glyphosate. Le serveur EPSPSClass offre une option pour tester de nouveaux marqueurs génétiques. L’identification des classes connues de l’EPSPS est simple, comme indiqué à la section 4.4. et la figure 5. En outre, dans les cas où les utilisateurs souhaitent comparer leurs propres protéines de requête et de référence, le serveur offre la possibilité d’inclure manuellement une séquence de référence et un ensemble de marqueurs d’acides aminés (Figure 11). Cette option peut être utilisée pour identifier de nouvelles classes de l’EPSPS, ainsi que pour tester d’autres herbicides et séquences cibles.

L’analyse de la classe EPSPS est déterminée par l’analyse de séquence et la présence/absence de marqueurs d’acides aminés. Il s’agit d’une estimation préliminaire qui peut être utilisée pour tester des hypothèses sur le terrain. Les marqueurs d’acides aminés ont été déterminés dans la littérature sur la base d’études empiriques et observationnelles ^{46,47,48,49,50,51}. Cependant, les séquences protéiques de référence pour déterminer la classe EPSPS n’ont été testées que chez un nombre limité d’espèces et peuvent parfois ne pas expliquer la résistance au glyphosate. L’effet des mutations compensatoires et des domaines associés à l’EPSPS (principalement chez les champignons) peut également affecter la sensibilité au glyphosate⁵⁸. L’analyse de cet article est basée sur quatre classes EPSPS. Une étude des bactéries dans le microbiome intestinal humain a montré qu’environ 30% d’entre elles n’étaient pas classées (c’est-à-dire que les protéines EPSPS de ces espèces n’appartiennent à aucune des classes connues), et des études supplémentaires sont nécessaires pour identifier d’autres classes EPSPS. En outre, il convient de noter que la séquence protéique EPSPS chez les bactéries et les plantes est unidomaine, tandis que les protéines fongiques EPSPS contiennent plusieurs domaines⁵⁹. Ainsi, un repliement protéique chez les champignons peut conduire à une réponse différente de l’enzyme EPSPS au glyphosate. De plus, d’autres mécanismes non ciblés de résistance (p. ex., pompes d’efflux et surexpression du gène EPSPS ¹³) ou de sensibilité au glyphosate (p. ex., l’effet du glyphosate sur la chaîne de transport mitochondriale¹²) ne sont pas pris en compte.

Bien que les GBP existent en tant qu’herbicide depuis 1974 et soient largement utilisés depuis 1991, il s’agit de la première méthode bioinformatique permettant de déterminer la sensibilité potentielle des organismes au glyphosate. La méthode est basée sur l’identification de résidus d’acides aminés connus dans la séquence cible. Ainsi, notre méthode fournit une estimation de base de l’effet potentiel du glyphosate sur l’espèce. Dans un avenir proche, de nouvelles méthodes bioinformatiques devraient inclure des classes supplémentaires de la protéine EPSPS pour déterminer la sensibilité potentielle au glyphosate des séquences non classifiées 12,54,55. En outre, étant donné que le comportement exact de l’enzyme EPSPS peut varier en fonction des changements d’acides aminés 12,14,52,54,55, d’autres expériences in silico devraient prendre en compte de petites variations dans le repliement de la protéine EPSPS, ainsi que l’effet des domaines associés à EPSPS sur la structure protéique chez les champignons ⁵⁸ . De plus, il a été démontré que la tolérance au glyphosate peut être produite par surexpression de la protéine EPSPS^56,57 ; ainsi, des analyses bioinformatiques basées sur l’amélioration de l’utilisation du codon⁶⁰ peuvent être utilisées pour identifier de nouvelles séquences EPSPS qui maximisent ou minimisent l’expression des gènes.

Les agriculteurs, les politiciens et les décideurs ont besoin de toute urgence d’une compréhension approfondie des risques associés à l’utilisation intensive de pesticides. Ainsi, des outils bioinformatiques révélant la sensibilité potentielle des organismes aux pesticides et des études expérimentales bien répliquées, randomisées et réalistes sur le terrain menées dans différents environnements sont nécessaires. La méthode bioinformatique présentée conçue pour examiner la sensibilité des organismes au glyphosate peut être modulée pour d’autres pesticides. De même, les méthodes de l’écologie expérimentale peuvent être appliquées pour étudier toutes les questions écologiques connexes. Ensemble, les méthodes peuvent être utilisées pour démontrer les pertes entre les observations sur le terrain, les données génomiques et l’utilisation de pesticides. Toutes les méthodes présentées sont inestimables pour l’évaluation des risques. Les méthodes bioinformatiques peuvent être utilisées, par exemple, pour surveiller les adaptations microbiennes aux produits agrochimiques et pour fournir une méthode quantitative pour tester les autres risques potentiels associés, tels qu’une augmentation de la résistance des agents pathogènes aux produits agrochimiques, des effets négatifs sur les microbes utilisés comme agents de lutte biologique dans la lutte intégrée contre les ravageurs (IPM) et la résistance aux antibiotiques chez les bactéries.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2100 Bioanalyzer Instrument	INVITEK Molecular	1037100300	Genomic DNA extraction from plant tissues
dNTP mix (10 mM each)	BIO-RAD	1852196	For PCR reactions
GoTaq G2 DNA Polymerase kit	Promega	M7848	PCR buffer and DNA Polymerase for PCR amplification
Invisorb Spin Plant Mini Kit	Agilent	G2939B	To check the concentration and quality of PCR products
Ion Chip Minifuge	sage science	PIP0001	For size fractionation of PCR amplicons
Ion PGM System	ThermoFisher Scientific	4462921	For targeted sequencing of microbial PCR products
Ion PGM Torrent Server	ThermoFisher Scientific	4483643	For targeted sequencing of microbial PCR products
Pippinprep	ThermoFisher Scientific	4479672	For targeted sequencing of microbial PCR products
Pressure tank	Berthoud	102140	For sprayin glyphosate based products in field
Primers	ThermoFisher Scientific	R0192	For PCR amplification
Rotary tiller	Grillo	984511	For tilling the soil in experimental plots
S1000 ThermalCycler	Sigma-Aldrich	Custom-made	For PCR amplification