글리포세이트 기반 제품이 마이크로바이옴에 미치는 잠재적 영향의 정량화

요약

글리포세이트 기반 제품(GBP)은 전 세계적으로 가장 일반적인 광범위한 스펙트럼 제초제입니다. 이 기사에서는 현장 실험에서 생물 정보학 분석에 이르기까지 GBP가 미생물에 미치는 영향을 정량화하기위한 일반적인 지침을 소개합니다.

초록

글리포세이트 기반 제품(GBP)은 전 세계적으로 가장 일반적인 광범위한 스펙트럼 제초제입니다. 글리포세이트의 표적은 시키메이트 경로에서 효소 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소(EPSPS)이며, 이는 식물에서 거의 보편적이다. 효소의 억제는 세 가지 필수 아미노산의 생산을 중지: 페닐알라닌, 티로신, 트립토판. EPSPS는 또한 진균 및 원핵생물, 예컨대 고세균 및 박테리아에 존재하고; 따라서, GBP의 사용은 토양, 식물, 초식 동물 및 이차 소비자의 미생물 조성에 영향을 미칠 수 있다. 이 기사는 현장 실험에서 생물 정보학 분석에 이르기까지 미생물에 대한 GBP의 영향을 평가하고 몇 가지 테스트 가능한 가설을 제공하기위한 일반적인 지침을 제시하는 것을 목표로합니다. 비표적 유기체에 대한 GBP를 시험하기 위해 두 가지 현장 실험이 제시된다. 첫째, 10개의 복제된 대조군으로부터의 식물 관련 미생물 및 작물 재배를 시뮬레이션하는 GBP 처리 플롯이 샘플링되고 분석된다. 두 번째 실험에서, 글리포세이트 잔류물을 함유하는 가금류 분뇨 또는 처리되지 않은 대조군 분뇨에 의해 수정된 실험 플롯으로부터의 샘플이 수득되었다. EPSPS 단백질 서열의 생물정보학 분석은 글리포세이트에 대한 미생물의 잠재적 감수성을 결정하는데 이용된다. 미생물에 대한 GBP의 효과를 추정하는 첫 번째 단계는 표적 효소 (EPSPS)에 대한 잠재적 인 민감성을 결정하는 것입니다. 미생물 서열은 공개 저장소로부터 또는 PCR 증폭을 통해 수득될 수 있다. 그러나, 대부분의 현장 연구에서, 마이크로바이옴 조성은 16S rRNA 및 내부 전사된 스페이서(ITS)와 같은 범용 DNA 마커에 기초하여 결정되었다. 이러한 경우, 글리포세이트에 대한 민감성은 밀접하게 관련된 종을 사용하는 EPSPS 서열의 확률적 분석을 통해서만 추정될 수 있다. EPSPS 효소를 기반으로 글리포세이트에 대한 유기체의 잠재적 감수성의 정량화는 표적 및 비표적 내성 메카니즘을 연구하기 위한 추가 실험을 위한 강력한 접근법을 제공한다.

서문

현대 농업에서 살충제의 과도한 사용은 분명히 생물 다양성의 쇠퇴에 주요 기여를합니다¹. 이 논문은 글리포세이트 기반 제품 (GBPs)이 효율성과 저렴한 가격 ^2,3으로 인해 전 세계적으로 가장 널리 사용되는 살충제가되기 때문에 글리포세이트에 중점을 둡니다. 농업 분야에서 잡초를 죽이는 것 외에도 GBP는 일반적으로 실비 컬쳐, 도시 환경 및 가정 정원에서 사용됩니다. 또한, 그들은 제조업체의 지침에 따라 사용되는 경우 비 표적 유기체에 대해 무독성으로 선언되었습니다. 그러나, 점점 더 많은 최근의 연구들이 글리포세이트의 잔류물 및 그의 분해 생성물이 토양에서 유지되고 수송될 수 있고, 그럼으로써 비표적 유기체에 계단식 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다^4,5,6,7,8. 글리포세이트의 효과는 식물에만 국한되지 않으며, 시키메이트 경로는 많은 진균 및 원핵생물에도 존재한다. 글리포세이트는 aroA⁹로도 알려진 시키메이트 경로에서 효소 5-올피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소(EPSPS)를 표적으로 한다. 이 효소는 세 가지 필수 방향족 아미노산 (페닐알라닌, 티로신 및 트립토판)의 합성에서 시키메이트 경로의 중심에 있으며 대부분의 원핵생물, 식물 및 곰팡이^10,11에 ^{존재합니다.} 일부 미생물 종은 EPSPS 서열의 돌연변이를 포함한 몇 가지 메카니즘을 통해 글리포세이트에 대한 부분적 또는 절대적 내성을 발전시켰다. 따라서, GBPs의 사용은 인간 장내 미생물^12,13,14를 포함하는 식물 및 동물 마이크로바이옴에 직접적인 영향을 미칠 수 있다는 것이 제안되었다. 그럼에도 불구하고 GBP의 사용은 미생물 및 미생물 촉진 과정에 의존하는 거의 모든 생태계 기능 및 서비스에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 결과적으로 위협은 생화학 적 토양 과정, 수분 생물학 및 동물 및 인간 복지와 관련 될 수 있습니다. 이것은 글리포세이트가 시키메이트 경로에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 보다 포괄적인 이해와 글리포세이트에 대한 미생물의 민감성을 평가하는 방법을 요구한다.

이 프로토콜에서는 현장 실험에서 생물 정보학 분석에 이르기까지 글리포세이트와 GBP가 미생물에 미치는 영향을 테스트하기위한 파이프 라인을 제시합니다. 우리는 글리포세이트¹²에 대한 유기체의 잠재적 감수성을 결정하는데 사용될 수 있는 최근에 발표된 생물정보학 방법을 상세히 기술한다. 연구원의 지식에 따르면, 이것은 GBP의 활성 성분에 대한 효소 EPSPS의 고유 감도를 평가하는 최초의 생물 정보학 도구입니다. 이러한 생물정보학 방법은 글리포세이트 표적 효소(EPSPS)¹²에서 공지된 아미노산 마커의 검출에 기초한다. 파이프라인은 다섯 가지 주요 작업 단계(그림 1)로 나뉩니다: 1) GBP의 효과를 테스트하기 위한 두 가지 현장 실험에 대한 간략한 소개, 2) 마이크로바이옴 분석(16S rRNA, ITS 및 EPSPS 유전자)에 대한 간략한 요약, 3) 공용 저장소에서 EPSPS 서열 수집, 4) 글리포세이트에 대한 유기체의 잠재적 민감도 결정, 5) 범용 미생물 마커(16S rRNA 및 ITS)로부터 EPSPS 클래스 평가.

프로토콜

1. GBP의 효과를 테스트하기위한 두 가지 현장 실험

참고: 이 프로토콜은 식물 관련 미생물에 대한 GBP의 효과를 테스트하기 위한 현장 실험 설계의 두 가지 예를 제시합니다. 두 실험 모두 핀란드의 Turku Ruissalo 식물원 대학 (60º26'N, 22º10'E)에서 제초제 또는 농업 용도의 이전 역사가없는 세트 어사이드 필드에서 수행되었습니다. 토양은 유기물의 비율이 높은 모래 점토입니다.

1. 실험 1
   참고 :이 실험은 잡초와 싸우기 위해 성장기 전후에 GBP 응용 프로그램을 사용하여 노틸 농업의 일반적인 농업 관행을 시뮬레이션하기 위해 고안되었습니다.
   1. 실험 필드를 10개의 복제된 대조군과 GBP 처리 플롯(23 m x 1.5 m)으로 나누고, 플롯 사이에 식물의 버퍼 스트립을 사용합니다(2014년 봄 이 연구에서¹⁵).
   2. 플롯을 회전식 타일러로 5cm 깊이까지 경작하고 일년에 두 번 처리해야합니다. 여기서, 플롯은 성장기의 시작(May)과 끝(October)에서 처리되었다.
   3. 대조군 플롯을 수돗물 (5 L / 플롯)으로 처리하고 GBP 플롯을 상업용 GBP (글리포세이트 농도 450 g · ^L-1, 플롯 당 수돗물 5 L에서 적용 속도 6.4 L·ha-1)은 농업 관행에서 허용되는 최대 글리포세이트 복용량 (3 kg · ^ha-1)을 모방합니다.
   4. 수동 분무기가있는 손으로 작동하는 압력 탱크로 트리트먼트를 적용하십시오. GBP 적용 후 두 주 후, 농업 관행에 따라 귀리 (Avena sativa), 파바 콩 (Vicia faba), 순무 강간 (Brassica rapa subsp. oleifera) 및 식물 감자 (Solanum tuberosum)를 밭에 뿌립니다.
   5. 성장기 동안, 식물 경쟁과 토양 구조를 대조군 및 GBP 처리 플롯에서 가능한 한 유사하게 유지하기 위해 플롯을 손으로 잡초를 뽑습니다.
   6. 실험 식물에서 미생물을 샘플링하십시오. 이 연구에서, microbiota는 연구 과정에서 성장기에 한 번 GBP 처리 및 대조 처리 플롯 모두에서 2017 년부터 2020 년까지 연속적으로 샘플링되었습니다.
   7. 현장에서 식물 샘플 (뿌리 및 잎)의 10 번의 복제물을 수집하여 즉시 얼음 위에 놓고 섹션 2.1에 설명 된대로 추가 처리를 위해 실험실로 가져 오십시오.
2. 실험 2
   참고 :이 실험은 순환 식품 경제와 관련된 위험을 테스트하기 위해 고안되었습니다. 보다 정확하게는, 작물 식물² 에 비료로서 적용된 분뇨에서의 GBP 잔류물의 결과를 조사하도록 설계되었다(도 3).
   1. 12 개월 조류 실험^16,17에서 GBP로 오염 된 또는 통제 사료를 먹은 메추라기에서 나무 부스러기^, 대변 및 일부 유출 된 사료를 포함한 침구를 수집하십시오.
      참고 : GBP로 오염 된 사료는 성인 일본 메추라기 ^16,17에서 킬로그램 체질량 당 12-20mg 글리포세이트의 일일 섭취량에 해당하는^160mg 글리포세이트 / kg과 결합 된 닭을 낳기위한 유기농 사료로 구성되었습니다.
   2. 검증을 위해, 샘플을 여섯 개의 사료 배치로 글리포세이트 농도 측정을 위해 공인 실험실로 보내라.
   3. 또한, 메추라기 배설물 샘플에서 글리포세이트 잔류물을 노출 12개월 후에 측정한다. 대조군은 GBP 첨가 없이 동일한 유기 사료를^16,17 첨가하였다.
   4. 조류 사육장 실험 중에 격주로 침구를 바꿉니다. GBP 처리 및 제어, 처리 당 수영장에서 8-12 개월 노출에서 정기적으로 사용 된 침구를 수집하고 비료로 사용하기 전에 6 °C의 건조하고 어두운 창고의 밀폐 된 용기에 보관하십시오.
   5. 12 L의 침구를 실험 필드의 6 x 6 체스 보드 그리드에서 18 GBP 및 18 개의 제어 플롯 (크기 1 m x 1 m) 각각에 수동으로 두 시점에서 퍼뜨립니다. 이 연구에서 침구는 2018 년 8 월과 2019 년 5 월에 퍼졌습니다.
   6. 침구 샘플을 확산 직후 글리포세이트 농도 측정을 위해 공인 실험실로 보내십시오 (이 연구에서 2019 년 5 월).
   7. 다년생 풀과 딸기 식물을 각 플롯에 심어 뿌리와 잎 미생물을 연구하십시오.
      참고 :이 연구에서 네 개의 다년생 잔디 식물 (Festuca pratensis)과 두 개의 딸기 식물 (Fragaria x vescana)을 각 플롯에 심고 뿌리와 잎 미생물을 연구했습니다.

2. 마이크로바이옴 분석 (16S rRNA, ITS 및 EPSPS 유전자)

참고: 대부분의 마이크로바이옴 연구는 차세대 시퀀싱 기술을 사용하여 곰팡이 군집의 박테리아 및 내부 전사 스페이서(ITS) 영역에 대한 16S rRNA 유전자 분석을 기반으로 합니다. 따라서, 논문은 EPSPS의 유형에 대한 정보를 갖지 않는다. 수천 종의 EPSPS 서열은 공용 저장소에서 사용할 수 있습니다 (프로토콜 섹션 3) (그림 4).

1. 16S rRNA 유전자
   1. 상기 기술된 실험에서 수집된 분리된 잎 및 뿌리 샘플로부터, 내피 미생물(즉, 식물 조직 내부에 사는 미생물)을 동정한다.
   2. 식물 샘플을 수돗물로 씻은 다음 멸균하여 epiphytic 미생물 (즉, 식물 조직 표면의 미생물)을 제거하십시오. 3분 동안 3% 표백제를 사용하여 멸균하고, 이어서 70% 에탄올 용액을 1분 동안 사용하고, 각각 1분 동안 오토클레이브된 초순수로 3회 세척한다.
   3. 게놈 DNA 추출이 이루어질 때까지 샘플을 -80°C에서 동결시킨다.
   4. 제조업체의 프로토콜에 따라 시판되는 식물 DNA 추출 키트를 사용하여 게놈 DNA 추출을 수행합니다.
   5. 박테리아 DNA 18에 특이적으로 결합하는 판별 프라이머를 사용한 중첩된 접근법을 사용하여 추출된 DNA 샘플로부터 16S rRNA 유전자의 가변 영역 V6-V8을 표적화하여, 숙주 식물 DNA로부터의 증폭을 최소화한다.
   6. 중합효소 연쇄반응(PCR)의 세 라운드가 끝난 후, 표적 유전자를 바코드 및 어댑터 서열로 태그하여 시퀀싱을 위한 주형으로 제조하였다. PCR 증폭을 위한 단계 2.1.7- 2.1.11을 따르십시오.
   7. 각 반응의 총 부피가 30 μL이고 30 ng의 DNA, 1x PCR 버퍼, 0.2 mM dNTPs, 각 프라이머의 0.3 μM 및 2000 U/mL DNA 중합효소로 구성되도록 필요한 샘플 수에 대해 PCR 마스터 믹스를 준비하십시오. PCR의 두 번째 및 세 번째 라운드에 대해 동일한 단계를 수행하십시오.
   8. PCR의 첫 번째 라운드의 경우, 프라이머 799F¹⁹ 및 1492R (²⁰에서 변형)을 사용하십시오 (표 1). 증폭 프로파일을 열순환기 상에 설정한다(95°C에서 3분 초기 변성, 이어서 95°C에서 45초 동안 변성, 54°C에서 45초 동안 어닐링, 72°C에서 1분 동안 연장하는 35 사이클). 최종 연장을 72°C에서 5분 동안 수행한다.
   9. PCR의 두 번째 라운드를 위한 주형으로서, 전기영동(1.5% 아가로스 겔 상의 PCR 산물 5 μL)에 의한 증폭을 확인한 다음, 나머지 25 μL의 PCR 산물을 오토클레이브된 초순수에 1:10의 비율로 희석한다.
   10. 희석된 PCR 주형 및 프라이머 uni-1062F21 및 uni-1390R22로 PCR^을 반복한다(표 1). 사이클 수를 25개로 줄이는 것을 제외하고는 증폭 프로파일과 동일한 PCR 반응 조건(단계 2.1.8)을 유지한다.
   11. 생성된 PCR 산물을 오토클레이브된 초순수에 1:1의 비율로 희석한다. PCR의 세 번째 라운드를 수행하여 2.1.8단계에서 언급한 것과 동일한 PCR 프로파일의 8 사이클을 사용하여 바코드 및 P1 어댑터 시퀀스로 제품에 태그를 지정합니다.
2. 도서관 준비
   1. 바이오분석기 상에서 PCR 산물의 농도 및 품질을 검증하고, 각 시료의 30 ng의 DNA를 구성하는 부피를 1.5 mL 튜브에 풀링하여 등몰 라이브러리를 제조하였다.
   2. 아가로스 겔 카세트 상에서 자동화된 DNA 크기 선택 시스템을 사용하여 크기 분별에 의해 크기 350-550 bp 크기의 앰플리콘을 선택하십시오. 이것은 또한 라이브러리에서 비특이적 앰플리콘 및 PCR 시약을 제거한다는 점에 유의하십시오. 지정된 크기의 앰플리콘으로 구성된 용출액을 카세트에 바이알로 수집하여 정제된 16S rRNA 유전자 라이브러리를 생성한다.
   3. 용출액을 1.5 mL 튜브 내로 피펫팅하고 바이오분석기 상의 순도 및 농도를 검증하였다. 오토클레이브된 초순수를 사용하여 DNA 라이브러리를 26 pM의 최종 농도로 희석하고; 샘플이 시퀀싱할 준비가 되었습니다.
3. 그것의
   참고: ITS 영역은 ITS 특이적 프라이머(표 1)를 사용하여 증폭되며, 생성된 PCR 산물은 시퀀싱을 위한 바코드 및 P1 어댑터 서열로 표지됩니다.
   1. ITS 프라이머로 섹션 2.1에서 언급된 것과 동일한 프로토콜에 따라 PCR 마스터 믹스를 제조한다.
   2. 열순환기 상의 증폭 프로파일을 95°C에서 5분 초기 변성으로 설정한 다음, 95°C에서 30초 동안 변성, 어닐링 및 연장의 35 사이클, 30초 동안 55°C, 1분 동안 72°C, 및 7분 동안 최종 연장 72°C로 설정한다.
   3. PCR 산물 5 μL를 1.5% 아가로스 겔에서 분석하고, 오토클레이브 초순수를 사용하여 나머지 25 μL를 1:10으로 희석하였다. 희석된 PCR 산물을 PCR의 두 번째 라운드를 위한 주형으로 사용한다.
   4. 바코드 태그가 지정된 정방향 프라이머 및 P1 어댑터 태그가 지정된 역방향 프라이머를 사용하여 필요한 수의 샘플(단계 2.1.6 참조)에 대해 PCR 마스터 믹스를 준비합니다. 8 사이클을 사용한 것을 제외하고는 단계 2.3.2에서와 동일한 증폭 프로파일로 증폭한다.
   5. 섹션 2.2에 언급된 프로토콜에 따라 시퀀싱을 위해 생성된 PCR 산물을 준비합니다.
4. EPSPS 유전자
   1. 미생물의 서열을 분석하고 EPSPS 유전자를 분석한다.
      참고 : GBP 노출이 지역 사회에서 글리포세이트에 민감하고 내성이있는 미생물의 조성을 변화 시켰는지 여부를 발견하기 위해 미생물의 EPSPS 유전자를 시퀀싱하고 분석해야합니다. 따라서, 정렬가능한 타이트 게놈 클러스터(ATGC) 데이터베이스에서 미생물 탁사의 광범위한 컬렉션으로부터 EPSPS 유전자의 353개 서열이 수집되었고, 모든 단백질 서열이²²개 정렬되었다. 이들 정렬은 ATGC 데이터베이스⁽²³ )에서 이용가능하며, 보존된 영역으로부터 프라이머를 생성하는데 이용가능하다. 사용하기 쉬운 생물 정보학 도구는 다중 서열 정렬에서 보존 된 영역을 식별하도록 설계되었으며 Pere Puigbo 연구 페이지²⁴에서 사용할 수 있습니다. 그러나 이 웹 서버에 대한 자세한 설명을 제공하는 것은 이 간행물의 범위를 벗어납니다. 그럼에도 불구하고, 글리포세이트에 대한 마이크로바이옴의 민감도를 찾기 위해 EPSPS 유전자의 증폭을 위해 이들 프라이머를 활용하기 위한 장래의 프로토콜이 도 4에 제공된다.

3. 공공 저장소에서 EPSPS 단백질 서열 수집

1. 대진화 연구에 사용되는 EPSPS 서열
   1. PFAM²³ (단백질 패밀리 데이터베이스 25), GenBank 24 (유전자, 게놈 및 단백질^{데이터베이스 26}), COG²⁵ (정형 그룹^{클러스터 27}; 고세균 및 박테리아의 정통 단백질 데이터베이스)와 같은 공공 저장소에서 EPSPS 단백질을 수집합니다. 및 PDB²⁶ (단백질 데이터 뱅크²⁸; 단백질 구조의 데이터베이스).
      참고 : 연구원들이 수행 한 최근 연구에 따르면이 단백질은 시키 메이트 경로¹²를 갖는 유기체에 대한 글리포세이트의 잠재적 효과에 대한 미세 진화 및 비교 분석을 수행하는 데 활용 될 수 있음을 보여주었습니다. 저자들은 인간 장내 마이크로바이옴(¹²)으로부터 단백질의 수동으로 큐레이팅된 데이터 세트를 포함하여 수만 개의 EPSPS 단백질 서열(²⁹)에 대한 정보를 수집하는 사용자 친화적인 웹사이트를 개발하였다. 이러한 사전 계산된 데이터 세트의 정보에는 글리포세이트에 대한 민감하고 내성이 있는 추정적인 EPSPS 분류, 종에 대한 분류 정보, EPSPS 활성 사이트의 주석, PDB 및 NCBI 데이터베이스에 대한 링크가 포함됩니다. 또한 웹 서버에는 EPSPS의 ID 코드와 여러 외부 데이터베이스에 대한 링크가 포함되어 있습니다 (표 2).
2. ATGC 미세진화 연구에 사용되는 EPSPS 서열
   참고: 단백질 서열의 일반적인 저장소는 비교적 먼 유기체들 사이에서 비교 연구를 수행하는데 유용하다; 그러나, 글리포세이트의 잠재적 효과는 진화론적 관점에서 비교적 최근이다. 따라서, 일부 연구에서, 글리포세이트¹⁴의 효과를 결정하기 위해 밀접하게 관련된 종(예를 들어, 동일한 박테리아 종으로부터의 상이한 균주)을 비교하는 것이 필요하다. 이러한 경우, 밀접하게 관련된 고세균 및 박테리아 게놈의 포괄적 인 목록을 포함하는 정렬 가능한 타이트 게놈 클러스터 (ATGC) ³⁰의 데이터베이스가 더 적합한 자원입니다. ATGC 데이터베이스는 수백 개의 클러스터⁽³⁰)로 조직된 수천 개의 게놈으로부터 수백만 개의 단백질에 대한 정보를 포함한다. 각 게놈 클러스터는 정렬 가능하고(게놈은 길이의 ≥85% 이상 동의어를 공유함) 타이트하며(포화 이하의 동의어 치환율을 가짐). 연구자들은 EPSPS 단백질¹⁴의 미세 진화 변화를 분석하기 위해 최근 연구에서 ATGC 데이터 세트를 사용했습니다. ATGC에서 EPSPS 단백질 서열을 확인하기 위해서는 다음 단계가 필요합니다.
   1. 링크(³¹ )로부터 ATGC의 전체 데이터베이스와 COG0128의 모든 단백질(데이터베이스의 EPSPS 단백질에 대응하는 코드)³² 를 로컬 프로젝트로 다운로드한다.
      참고: 연구원/실험자가 핀란드에 기반을 둔 경우, CSC-IT 과학 센터^33은 스토리지 및 소프트웨어 시설을 제공합니다. 모든 시퀀스를 FASTA 형식으로 수집하는 것이 중요합니다.
   2. 대표적인 원핵생물 종 세트에 EPSPS 단백질의 오르토로그를 포함하는 COG0128의 폭발 데이터베이스를 구축했습니다. CSC에는 블라스트 프로그램(³⁴ )이 사전 설치되어 있어, makeblastdb-in COG0128.fa -dbtype prot 명령을 사용하여 EPSPS 시퀀스의 참조 데이터베이스를 생성할 수 있다.
   3. blastp -query [ATGC_X.fa] -db [COG0128.fa] -max_target_seqs 1 -outfmt 6 -out tmpfile -evalue 1e-150 명령을 사용하여 반복 블라스트 검색을 사용하여 ATGC 데이터베이스를 COG0128.fa (EPSPS 단백질)에 매핑합니다.
   4. 그 결과, 각 내에서 EPSPS 단백질 서열의 데이터 세트를 생성한다. ATGC 데이터베이스로부터 밀접하게 관련된 EPSPS 단백질 서열의 미리 계산된 데이터세트가 이용가능하다⁽²⁹).

4. 글리포세이트에 대한 유기체의 잠재적 민감도를 결정하는 알고리즘 (EPSPSClass 웹 서버 : 입력, 처리 및 출력)

참고: 연구진은 EPSPS 단백질 서열 ^12,35의 부류를 결정하기 위해 ²⁹에서 자유롭게 사용할 수 있는 사용하기 쉬운 서버를 구현했습니다. 서버는 각 EPSPS 클래스에 대한 동일성 백분율 및 글리포세이트에 대한 그들의 잠재적 민감도를 결정하기 위해 FASTA 포맷의 단백질 서열의 입력만을 필요로 한다. 또한 사용자는 웹 서버를 사용하여 자신의 참조 서열 및 아미노산 마커를 테스트 할 수 있습니다. 먼저, 알고리즘(도 5)은 아미노산 위치를 결정하기 위해 다중 서열 정렬 프로그램(³⁵)을 사용하여 질의 서열 및 참조 서열을 정렬한다. 이어서, 질의 서열의 EPSPS 클래스 (I, II, III, 또는 IV)를 확인하기 위해 아미노산 마커의 존재를 검색한다.

1. 효소의 클래스를 확인하기 위해 입력 텍스트 상자에 FASTA 형식의 EPSPS 단백질 서열을 도입하고(그림 6A), Send를 누릅니다.
2. 제공된 서버에서 glyphosate에 대한 쿼리 시퀀스의 잠재적 민감도를 평가합니다(그림 6B-E).
   출력 1: 질의 서열 (클래스 I, II, 및 IV)에 존재하는 아미노산 마커 (즉, 동일성) 및 모티프의 수 (클래스 III)의 분획.
   출력 2: 마커 잔기에 기초한 질의 및 참조 서열의 정렬.
   출력 3: 쿼리 및 참조 시퀀스의 전체 쌍 정렬.
   출력 4: EPSPS 참조 서열: 비브리오 콜레라(vcEPSPS, 클래스 I), 콕시엘라 버네티(cbEPSPS, 클래스 II), 브레분디모나스 수포(bvEPSPS, 클래스 III), 스트렙토마이세스 다바웬시스(sdEPSPS, 클래스 IV).
3. 출력 페이지의 끝에서 blastp 및 보존된 도메인과 같은 외부 도구에 대한 링크를 찾아 쿼리 EPSPS 시퀀스를 추가로 분석합니다(그림 6F).

5. 범용 미생물 마커 (16S rRNA 및 ITS )로부터 EPSPS 클래스 평가

참고 : 대부분의 미생물 연구는 16S rRNA 및 / 또는 ITS³⁶의 분석을 기반으로합니다. 이러한 경우, EPSPS 서열의 직접적인 분석을 수행할 수 없다. 따라서, 글리포세이트에 대한 유기체의 잠재적 감수성을 추정하기 위한 확률적 접근법이 필요하다. 이 분석은 간단하며 마이크로바이옴 프로젝트에서 EPSPS 서열의 유형에 대한 합리적인 추정치를 제공합니다. 이 프로세스는 3단계로 나뉩니다(그림 7 및 그림 8).

1. 공용 저장소에서 EPSPS 시퀀스를 식별합니다. 대표 서열의 포괄적인 데이터 세트의 EPSPS 클래스는 PFAM 37, GenBank³⁸, COG³⁹, PDB 40, ATGC ³⁰으로부터 컴파일되고 사전 계산되었다. 분류 정보와 50,000개 이상의 시퀀스의 EPSPS 클래스가 포함된 EPSPSClass 서버의 기본 페이지에서 이러한 데이터 세트에 액세스합니다(그림 7).
2. 성장기 동안 격주로 실험 식물의 높이를 측정하고, 필드 시즌의 끝에서 식물의 지상 바이오매스를 칭량하여 GBP에서의 식물의 생장을 비교하고 대조군 플롯을 비교한다.
   참고 : 현장 실험의 미생물 분석은 아직 완전히 분석되지 않았습니다.
3. 스프레드시트를 사용하여 마이크로바이옴 실험의 박테리아 OTU(16S rRNA 또는 ITS 기반)를 미리 계산된 데이터 세트로 매핑합니다.
   참고: 이전의 연구들은 EPSPS 부류(즉, 글리포세이트에 대한 내재적 감수성)가 계통발생 그룹⁽¹⁴) 내에서 고도로 보존된다는 것을 보여주었다. 따라서, 고도로 보존된 분류로부터 밀접하게 관련된 종들이 글리포세이트에 대해 유사한 EPSPS 반응을 가질 수 있다고 가정하는 것이 비교적 안전하다(도 8).
4. 동일한 스프레드시트에서, 확률적 점수(S = s/(s+r+u)에 기초하여, 글리포세이트에 대한 내재적 민감도를 계산하고, 여기서 S: 민감도 점수; s: 잠재적으로 민감한 서열의 수; r: 잠재적으로 내성인 서열의 수; u: 분류되지 않은 서열의 수)는 공개 데이터베이스에서 공지된 EPSPS 서열로부터 계산된다.
   참고: 이 점수의 범위는 0(탁손에서 민감한 EPSPS 서열이 발견되지 않음)에서 1(탁손의 모든 서열은 글리포세이트에 민감함)(그림 8)까지입니다. 더욱이, 값 사이에 - 즉, 민감성, 내성 또는 알려지지 않은 균주를 가진 종들이 있습니다.

결과

이 프로토콜의 목적은 현장 실험에서 생물 정보학 분석에 이르기까지 제초제 글리포세이트에 대한 유기체의 잠재적 민감도를 정량화하는 일반적인 파이프 라인을 제공하는 것입니다. 실험 2에서 메추라기 사료의 평균 글리포세이트 농도는 164mg/kg이었고, 배설물 시료(소변과 분변 물질이 합쳐진)의 평균 글리포세이트 농도는 199mg/kg이었다. GBP로 오염 된 사료를 먹인 메추라기에서 수집 된 침구는 평균 158 mg / kg이었고 0.17 mg / kg의 글리포세이트를 측정하는 대조 침구를 가졌습니다 (표 3). 현장 실험에서 식물 종은 토양의 글리포세이트 잔류 물에 다르게 반응했습니다 (섹션 1). 귀리와 순무 강간의 바이오 매스는 GBP 처리 토양에 비해 통제 토양에서 더 컸다. 그러나 파바 콩과 감자는 성장기¹⁵ 시즌이 끝날 때 GBP 처리로 이익을 얻는 것으로 나타났습니다. 가금류 분뇨의 글리포세이트는 잔디 (Festuca pratensis)와 딸기 (Fragaria x vescana) (섹션 1)의 식물 성장을 감소시켰다. 현장 실험의 미생물 분석은 아직 완전히 분석되지 않았으며 여기에 제시되지 않았습니다 (섹션 2). 이 프로토콜의 결과는 직접 (섹션 3 및 4에 표시된대로) 또는 간접적으로 (섹션 5) 읽을 때 데이터 세트에서 글리포세이트에 대한 잠재적으로 민감하고 내성이 강한 유기체의 비율을 측정합니다 (그림 9). 이 방법의 사용은 공공 저장소¹²로부터 수득된 코어 인간 장내 미생물 미생물의 미생물 종으로부터의 EPSPS 단백질 서열의 수집으로 시험되었다. 이 연구에서, 가장 풍부한 박테리아 종 101 종 중 890 균주를 EPSPSClass 방법으로 분석하여 민감하고 내성 박테리아의 비율을 정량화했습니다. 결과는 핵심 인간 장내 미생물 군집의 종의 54 %가 글리포세이트¹²에 잠재적으로 민감하다는 것을 보여주었습니다. 이러한 경향은 또한 원핵 세계의 대부분에서 관찰된다; 또한, 진핵 생물 (주로 식물과 곰팡이)에서 잠재적으로 민감한 종의 비율은 훨씬 더 높습니다¹². 또한, 우리는 이 방법을 이용하여 미진화 수준에서 EPSPS 단백질의 민감도 변화를 정량화하였다(도 10)¹⁴. 분석한 원핵생물의 32개 그룹 중 12개에서 민감도 상태의 변화를 확인했다(표 4)¹⁴. 따라서, GBPs의 지속적인 사용은 식물, 동물 및 토양 미생물에서 미생물 dysbiosis (즉, 민감하고 내성인 박테리아 종의 불균형)를 생성할 수 있다. 더욱이, 글리포세이트 내성 박테리아의 증가는 다제내성 미생물 ^14,41,42를 촉진시킬 수 있다는 가설이 제기되었다. 따라서, 이 프로토콜은 EPSPS 분류 방법이 글리포세이트에 대한 마이크로바이옴의 내재적 감수성의 직접적인 추정치를 제공하기 때문에 이러한 모든 시나리오의 해석에 대해 조명한다. 글리포세이트에 대한 EPSPS 단백질의 내재적 민감성으로 인해 계통유전학적으로 보존되고(¹⁴), 기존 데이터세트로부터의 결과를 알려지지 않은 마이크로바이옴으로 추정할 수 있다(도 8).

그림 1 : 일반 파이프 라인 현장 실험에서 생물 정보학 분석에 이르기까지 GBP에 대한 민감도를 분석하는 일반적인 파이프 라인입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 2: 작물 식물 관련 미생물에 대한 GBP 잔류물의 효과를 시험하기 위한 현장 실험 1. 실험 필드는 플롯 사이에 1.5m 버퍼 스트립이있는 10 개의 대조군 플롯과 10 GBP 처리 플롯 (23 m x 1.5 m)을 번갈아 가며 구성됩니다. 2014년 이후 1년에 2회, GBP 플롯을 상용 GBP(글리포세이트 농도 450 g L-1, 플롯 당 수돗물 5 L에서 적용 속도 6.4 L ha-1)와 글리포세이트가 없는 동일한 양의 수돗물로 대조군 플롯으로 처리하였다. 처리는 GBP가 처리 플롯 외부로 확산되는 것을 방지하기 위해 스프링클러 팁의 플라스틱 후드를 사용하여 손으로 작동하는 압력 탱크로 적용되었습니다. GBP 적용 후 두 주간의 안전 기간 후, 귀리 (Avena sativa), faba 콩 (Vicia faba) 및 순무 강간 (Brassica rapa subsp. oleifera)이 뿌려졌고 감자 (Solanum tuberosum)가 플롯에 심어졌습니다. 연구된 작물 식물, 잎 및 뿌리로부터의 Microbiota 샘플은 2014년 실험 개시 이후 여러 번 수집되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 현장 실험 2는 두 개의 다년생 작물과 관련 미생물에 대한 분뇨 비료의 GBP 잔류 물의 결과를 테스트했습니다. 12개월간의 조류 실험에서 채취한 침구류를 대조군 또는 GBP로 오염된 사료를 공급한 일본 메추라기를 이용한 실험에서 분뇨 비료로 사용하였다. 실험 분야는 6 x 6 체스 보드 그리드에 배열 된 18 개의 컨트롤과 18 GBP 플롯 (1m x 1m)으로 구성되었습니다. 침구는 2018 년 8 월과 2019 년 5 월 (25 L / 플롯)에 두 번 실험 현장에 퍼졌습니다. 대조구는 통제 사료를 먹인 메추라기에서 수집 된 침구와 GBP로 오염 된 사료를 먹인 메추라기에서 침구가있는 GBP 플롯으로 수정되었습니다. 대조군 침구의 글리포세이트 잔류물은 글리포세이트의 0.17 mg/kg이었고, GBP 침구에서, 그 양은 글리포세이트의 158 mg/kg이었다. 두 개의 내피 공생 (E +), 두 개의 내피가없는 (E-) Festuca pratensis, 그리고 두 개의 Fragaria x vescana 가 첫 번째 침구가 퍼진 지 약 한 달 후인 2018 년 9 월에 플롯 당 심어졌습니다. 식물 성능 및 체력의 측정뿐만 아니라 뿌리 및 잎 관련 미생물에 대한 샘플링은 두 번의 연속 성장기 (2019 & 2020) 동안 수행되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 4: EPSPS 유전자를 이용한 16S rRNA 유전자/ITS 영역 및 글리포세이트에 대한 마이크로바이옴의 민감도를 이용한 미생물 탁사 분석. (A) 미생물 탁사를 확인하기 위한 16S rRNA 또는 ITS 서열의 분석. (B) 글리포세이트(GS-글리포세이트 민감성/GR-글리포세이트 내성)에 대한 미생물의 민감도를 확인하기 위한 EPSPS 서열 분석, 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 5: EPSPS 단백질 서열의 부류를 동정하는 알고리즘. 입력은 FASTA 포맷의 EPSPS 단백질 서열이다. 이 알고리즘은 글리포세이트에 대한 잠재적 감수성을 결정하는 참조 단백질 서열에서 공지된 아미노산 마커와 비교를 수행한다. 이 알고리즘은 자유롭게 액세스 가능한 웹 서버 EPSPSClass²⁹에서 구현되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: EPSPSClass 웹 서버의 기본 입력 및 출력 (a) 입력: FASTA 포맷의 EPSPS 단백질 서열. (b) 출력 1 - 동일성: 질의 서열 (클래스 I-IV) 및 모티프 (클래스 III)에 존재하는 아미노산 마커의 분획. (C) 출력 2 - 동일성 : 쿼리 및 참조 시퀀스의 정렬. (D) 출력 3 - 질의 및 참조 시퀀스의 쌍 정렬. (e) 참조 EPSPS 서열: 비브리오 콜레라 (vcEPSPS, 클래스 I), 콕시엘라 버네티 (cbEPSPS, 클래스 II), 브레분디모나스 수포성 (bvEPSPS, 클래스 III), 스트렙토마이세스 다바웬시스 (sdEPSPS, 클래스 IV). (F) 추가 blastp 검색 및 보존된 도메인의 식별을 수행하기 위한 링크 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: EPSPS 시퀀스의 미리 계산된 데이터 세트에 대한 액세스 그림의 표시에 따라 EPSPS 시퀀스의 미리 계산된 데이터 세트에 액세스합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 8: EPSPS 서열이 없는 마이크로바이옴 프로젝트에서 잠재적 감수성을 추정하는 방법의 예. 이 예제에서는 원핵 종의 서열을 포함하는 정렬 가능한 타이트 게놈 클러스터(³⁰)의 데이터베이스의 값을 사용합니다. 마이크로바이옴 프로젝트의 가설 종은 스타필로코커스 아우레우스, 코리네박테리움 디프테리아, 캄필로박터 제주니, 클라미디아 시타치 및 설폴로버스 섬감기이다. 글리포세이트에 대한 민감도 점수는 Number_Sensitive_Sequences/Total_Number_Of_Sequences로 계산됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 9 : 이 프로토콜과 가상의 진화 시나리오의 결과 해석 계획. (A) 미생물에서 잠재적 인 감도 (녹색)와 저항 (빨간색) 박테리아의 비율은 약 50:50입니다. 검은 점들은 분류되지 않은 미생물 종을 나타내고; 따라서, 글리포세이트에 대한 그들의 민감성은 알려져 있지 않다. 일부 미생물에서, 민감한 박테리아의 비율은 인간 장내 미생물¹²에서와 같이 약간 더 높다. (b) 시간이 지남에 따라, 글리포세이트의 사용은 미생물 dysbiosis (즉, 민감하고 내성 박테리아의 비율의 불균형)로 이어질 수 있으며, 이는 상이한 가설적 시나리오로 이어진다. (C) 가설적인 사례 1 (선택 없음) : 글리포세이트의 사용은 미생물에 영향을 미치지 않는다; 따라서 민감하고 내성이 강한 박테리아의 비율은 일정하게 유지됩니다. (D) 가상의 경우 2: 글리포세이트의 사용은 글리포세이트에 민감한 박테리아를 집단으로부터 제거한다. 우리는이 시나리오가 복용량에 따라 다를 수 있다고 추측합니다. (E) 가설적인 사례 3: 글리포세이트의 사용으로부터의 선택 압력은 박테리아의 민감성 상태를 변화시키는 EPSPS 유전자의 돌연변이를 강화시킨다. 따라서, 전체 미생물 집단은 글리포세이트에 내성을 갖게 된다. 또한,이 시나리오에서는 다제 내성 박테리아가 증가 할 수 있습니다. (F) 가상의 경우 4 : 글리포세이트의 사용은 특정 박테리아 종의 구성을 변경시켜 내성 박테리아에 대한 불균형을 일으키는 반면, 일부 박테리아 종은 유출 펌프와 같은 추가적인 내성 메커니즘 또는 EPSPS 유전자¹³의 과발현으로 인해 변경되지 않은 상태로 남아 있습니다. 이 시나리오는 또한 글리포세이트 내성 박테리아의 증가뿐만 아니라 추가 항생제에 대한 박테리아 내성의 증가로 이어질 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 10: 종 트리에 걸친 글리포세이트에 대한 예측된 민감도의 분포. 원형 차트는 글리포세이트에 대해 추정적으로 민감한(녹색) 또는 내성(빨간색) 종과 분류되지 않은(검정) 종의 비율을 나타냅니다. 이 수치는 Rainio et ^al.14의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 11: 사용자 자신의 참조 시퀀스를 테스트하기 위한 EPSPSClass 웹 서버의 입력 및 출력. (A) 입력 1: 쿼리 시퀀스. (B) 입력 2: 참조 시퀀스. (c) 입력 3: 참조 서열의 아미노산 마커. (d) 출력: 동일성: 질의 서열에서 아미노산 마커의 분획 (클래스 I-IV 및 사용자 자신의 참조 서열). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 마이크로바이옴 분석에서 16S rRNA 유전자 및 ITS 영역의 PCR 증폭을 위한 프라이머 목록은 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: 다른 데이터베이스에서 효소 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소(EPSPS)의 코드는 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 3: 평균 글리포세이트 농도 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 4: 글리포세이트에 민감한/내성인 종의 백분율에 대한 요약 표. 이 테이블은 Rainio et ^al.14의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 5: 참조 서열에서 아미노산 마커의 위치는 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 프로토콜은 EPSPS 단백질의 분석에 기초하여 마이크로바이옴에 대한 GBP의 효과를 정량화하는 방법에 대한 일반적인 지침을 제공한다. 이 프로토콜은 세 가지 중요한 단계를 가지고 있습니다 : (i) 미생물 데이터로부터 EPSPS 단백질의 정량화. 이 단계는 EPSPS가 제초제의 직접 표적 효소이기 때문에 중요합니다. 따라서, EPSPS 유전자의 카피를 갖는 종은 GBP의 사용에 의해 영향을 받을 수 있다. 그럼에도 불구하고, EPSPS 유전자의 카피가 결여된 종조차도 대안적인 비표적 메카니즘^(43,44)을 통해 제초제에 의해 영향을 받을 수 있다. (ii) EPSPS 유전자의 분석이 연구의 설계에 포함되지 않은 경우, 16S rRNA(박테리아) 또는 ITS (진균)를 분석함으로써 양호한 추정치를 얻을 수 있다. 이 경우, 포괄적인 참조 테이블에 의존하는 것이 필수적이다 (예를 들어, ATGC 데이터베이스는 몇몇 밀접하게 관련된 종으로부터의 EPSPS 단백질의 서열을 제공한다). (iii) EPSPS 단백질은 EPSPS의 활성 부위의 특정 아미노산 잔기에 따라 글리포세이트에 잠재적으로 민감하거나 내성인 것으로 나뉜다. 그러나, 단일 아미노산에 영향을 미치는 돌연변이는 이러한 분류(⁴⁵)를 변경할 수 있고, 부류들 사이의 전이는 비교적 짧은 기간에 발생할 수 있다⁽¹⁴).

글리포세이트에 대한 유기체의 잠재적 민감성은 참조 게놈, 아미노산 마커 및 서열 정렬에 의해 결정될 수 있다. (i) 참조 게놈: EPSPS 효소는 아미노산 마커 및 모티프의 존재에 기초하여 글리포세이트에 잠재적으로 민감성(클래스 I[알파 또는 베타]^46,47) 또는 내성(클래스 II ^48,49, III⁵⁰ 및 IV⁵¹)으로 분류될 수 있다(클래스 III의 경우). 이들 아미노산 마커 및 모티프는 비브리오 콜레라 (vcEPSPS, 클래스 I), 콕시엘라 버네티 (cbEPSPS, 클래스 II), 브레분디모나스 수포 (bvEPSPS, 클래스 III), 및 스트렙토마이세스 다바웬시스 (sdEPSPS, 클래스 IV)의 EPSPS 단백질 내의 아미노산 잔기의 위치에 기초한다. (ii) 아미노산 마커: 글리포세이트는 EPSPS 효소와 상호작용하고 포스포에놀피루베이트(PEP, EPSPS 효소의 두 번째 기질)^52,53과 경쟁한다. 특정 종에서, EPSPS 서열의 작은 아미노산 변화는 PEP에 대해 더 높은 친화도 및 글리포세이트 12,14,52,54,55에 대한 내성을 ^{제공한다.} 다른 서열에서, 글리포세이트는 EPSPS 서열을 비억제 입체형태(⁴⁵)로 결합한다. 글리포세이 트에 대한 많은 내성 ^{12,14,48,49,52,54,55} 및 ^56,57 EPSP 서열이 기술되었지만^, EPSPS에 대한 현재의 분류 시스템은 4개의 주요 부류(I-IV)¹²로 나뉘어져 있다(표 5 ). (iii) 서열 정렬: EPSPS 효소를 분류하기 위해, 우리는 다중 서열 정렬 프로그램-디폴트 파라미터³⁵-와 함께, 참조 서열(vcEPSPS, cbEPSPS, bvEPSPS 및 sdEPSPS)의 각각에 대해 질의 서열의 쌍 정렬을 수행하였다. 이러한 정렬은 질의 서열에서 아미노산 마커의 위치를 확인하기 위해 필요하다. 그 결과, 효소는 아미노산 마커 및 클래스 III 기반 모티프 마커의 존재에 기초하여 기술된¹²-클래스 I, II 및/또는 IV로 분류된다.

이 프로토콜은 네 가지 알려진 유형의 EPSPS를 기반으로합니다 : 한 유형은 민감하고 다른 세 유형은 내성입니다). 그러나, 원핵생물에서 EPSPS 서열의 대략 10%는 아직 분류되지 않았다(고세균에서 16%, 박테리아에서 8%)¹². 따라서, 추가 연구는 글리포세이트 감수성을 결정하기 위해 이러한 서열을 분석해야 한다. EPSPSClass 서버는 새로운 유전자 마커를 검사할 수 있는 옵션을 제공합니다. EPSPS의 알려진 클래스의 식별은 섹션 4.4에 표시된 것처럼 간단합니다. 및 그림 5. 또한, 사용자가 자신의 질의와 참조 단백질을 비교하고자 하는 경우, 서버는 참조 서열과 아미노산 마커 세트를 수동으로 포함하는 옵션을 제공한다(그림 11). 이 옵션은 EPSPS의 새로운 클래스를 확인하고 다른 제초제 및 표적 서열을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.

EPSPS 클래스의 분석은 서열 분석 및 아미노산 마커의 존재 / 부재에 의해 결정됩니다. 이것은 현장에서 가설 테스트에 사용할 수있는 예비 추정치입니다. 아미노산 마커는 경험적 및 관찰 연구^{46,47,48,49,50,51}에 기초한 문헌에서 결정되었다. 그러나, EPSPS 부류를 결정하기 위한 기준 단백질 서열은 제한된 수의 종에서만 시험되었으며, 때때로 글리포세이트에 대한 내성을 설명하지 못할 수 있다. 보상 돌연변이 및 EPSPS-관련 도메인 (주로 진균에서)의 효과는 또한 글리포세이트⁵⁸에 대한 감수성에 영향을 미칠 수 있다. 이 논문의 분석은 네 가지 EPSPS 클래스를 기반으로합니다. 인간 장내 미생물에서 박테리아를 조사한 결과, 그 중 약 30%가 분류되지 않은 것으로 나타났으며(즉, 이들 종의 EPSPS 단백질은 알려진 부류에 속하지 않음), 다른 EPSPS 부류를 확인하기 위해서는 추가적인 연구가 필요하다. 또한, 박테리아 및 식물의 EPSPS 단백질 서열은 단일도메인인 반면, 진균 EPSPS 단백질은 여러 도메인⁽⁵⁹)을 포함한다는 것을 주목해야 한다. 따라서, 진균에서 폴딩된 단백질은 글리포세이트에 대한 EPSPS 효소의 상이한 반응을 유도할 수 있다. 더욱이, 추가적인 비-표적 내성 (예를 들어, 유출 펌프 및 EPSPS 유전자¹³의 과발현) 또는 글리포세이트에 대한 민감성 (예를 들어, 미토콘드리아 수송 사슬¹²에 대한 글리포세이트의 효과)은 고려되지 않는다.

GBPs는 1974 년부터 제초제로 사용되어 왔으며 1991 년부터 널리 활용되어 왔지만, 이것은 글리포세이트에 대한 유기체의 잠재적 인 민감성을 결정하는 최초의 생물 정보학 방법입니다. 상기 방법은 표적 서열에서 공지된 아미노산 잔기의 확인에 기초한다. 따라서, 우리의 방법은 종에 대한 글리포세이트의 잠재적 효과에 대한 기준선 추정치를 제공한다. 가까운 장래에, 신규한 생물정보학 방법은 분류되지 않은 서열^12,54,55의 글리포세이트에 대한 잠재적 감수성을 결정하기 위해 EPSPS 단백질의 추가적인 부류를 포함해야 ^한다. 또한, EPSPS 효소의 정확한 거동이 단일 아미노산 변화^{12,14,52,54,55}에 의해 달라질 수 있다는 점을 감안할 때^, 실리코 실험에서 EPSPS 단백질의 폴딩에 작은 변화뿐만 아니라 진균 ⁵⁸의 단백질 구조에 대한 EPSPS 관련 도메인의 영향을 고려해야 합니다. . 더욱이, 글리포세이트에 대한 내성은 EPSPS 단백질^56,57의 과발현에 의해 생성될 수 있음이 밝혀졌다; 따라서 코돈 용도⁽⁶⁰)의 개선에 기초한 생물정보학 분석은 유전자 발현을 최대화하거나 최소화하는 신규한 EPSPS 서열을 확인하는데 이용될 수 있다.

농부, 정치인 및 의사 결정권자는 살충제의 과도한 사용과 관련된 위험에 대한 철저한 이해가 시급히 필요합니다. 따라서 살충제에 대한 유기체의 잠재적 민감성을 드러내는 생물 정보학 도구와 다양한 환경에서 수행되는 잘 복제되고 무작위화되고 현장 현실적인 실험 연구가 필요합니다. 글리포세이트에 대한 유기체의 민감성을 조사하기 위해 고안된 제시된 생물 정보학 방법은 다른 살충제에 대해 조절 될 수 있습니다. 마찬가지로, 실험 생태학의 방법은 관련된 생태 학적 질문을 연구하기 위해 적용될 수 있습니다. 함께이 방법을 사용하여 현장 관찰, 게놈 데이터 및 살충제 사용 사이의 사상자를 입증 할 수 있습니다. 제시된 모든 방법은 위험 평가에서 매우 중요합니다. 생물정보학적 방법은 예를 들어, 농약에 대한 미생물 적응을 모니터링하고, 농약에 대한 병원균의 내성의 증가, 통합 해충 관리(IPM)에서 생물학적 조절제로서 사용되는 미생물에 대한 부정적인 영향, 및 박테리아의 항생제 내성과 같은 잠재적인 다른 관련 위험을 시험하기 위한 정량적 방법을 제공하기 위해 사용될 수 있다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2939B	To check the concentration and quality of PCR products
dNTP mix (10 mM each)	ThermoFisher Scientific	R0192	For PCR reactions
GoTaq G2 DNA Polymerase kit	Promega	M7848	PCR buffer and DNA Polymerase for PCR amplification
Invisorb Spin Plant Mini Kit	INVITEK Molecular	1037100300	Genomic DNA extraction from plant tissues
Ion Chip Minifuge	ThermoFisher Scientific	4479672	For targeted sequencing of microbial PCR products
Ion PGM System	ThermoFisher Scientific	4462921	For targeted sequencing of microbial PCR products
Ion PGM Torrent Server	ThermoFisher Scientific	4483643	For targeted sequencing of microbial PCR products
Pippinprep	SageScience	PIP0001	For size fractionation of PCR amplicons
Pressure tank	Berthoud	102140	For sprayin glyphosate based products in field
Primers	Sigma Aldrich	Custom-made	For PCR amplification
Rotary tiller	Grillo	984511	For tilling the soil in experimental plots
S1000 ThermalCycler	BIO-RAD	1852196	For PCR amplification