Isolement de cellules endothéliales rétiniennes murines pour le séquençage de nouvelle génération

Résumé

Ce protocole décrit une méthode d’isolement des cellules endothéliales rétiniennes postnatales murines optimisées pour le rendement, la pureté et la viabilité cellulaires. Ces cellules conviennent aux approches de séquençage de nouvelle génération.

Résumé

Les améliorations récentes du séquençage de nouvelle génération ont fait progresser les connaissances des chercheurs en biologie moléculaire et cellulaire, plusieurs études révélant de nouveaux paradigmes en biologie vasculaire. L’application de ces méthodes à des modèles de développement vasculaire nécessite l’optimisation des techniques d’isolement cellulaire à partir de tissus embryonnaires et postnataux. Le rendement, la viabilité et la pureté des cellules doivent tous être maximaux pour obtenir des résultats précis et reproductibles à partir d’approches de séquençage de nouvelle génération. Le modèle de vascularisation rétinienne de souris néonatale est utilisé par les chercheurs pour étudier les mécanismes du développement vasculaire. Les chercheurs ont utilisé ce modèle pour étudier les mécanismes de l’angiogenèse et la spécification du devenir artériel-veineux pendant la formation et la maturation des vaisseaux sanguins. L’application de techniques de séquençage de nouvelle génération pour étudier le modèle de développement vasculaire rétinien nécessite l’optimisation d’une méthode d’isolement des cellules endothéliales rétiniennes qui maximise le rendement, la viabilité et la pureté cellulaires. Ce protocole décrit une méthode d’isolement, de digestion et de purification des tissus murins de la rétine à l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Les résultats indiquent que la population de cellules endothéliales CD31+/CD45- purifiées par FACS est fortement enrichie pour l’expression génique des cellules endothéliales et ne présente aucun changement de viabilité pendant 60 minutes après la FACS. Sont inclus les résultats représentatifs des approches de séquençage de nouvelle génération sur les cellules endothéliales isolées à l’aide de cette méthode, y compris le séquençage de l’ARN en vrac et le séquençage de l’ARN unicellulaire, démontrant que cette méthode d’isolement des cellules endothéliales rétiniennes est compatible avec les applications de séquençage de la prochaine génération. Cette méthode d’isolement des cellules endothéliales rétiniennes permettra des techniques de séquençage avancées pour révéler de nouveaux mécanismes de développement vasculaire.

Introduction

La capacité à haut débit du séquençage des acides nucléiques via des approches de séquençage de nouvelle génération a grandement fait progresser les connaissances des chercheurs en biologie moléculaire et cellulaire. Ces techniques avancées comprennent le séquençage de l’ARN du transcriptome entier, le séquençage de l’ADN des régions ciblées pour identifier les polymorphismes mononucléotidiques (SNP), le séquençage de l’ADN des facteurs de transcription liés dans le séquençage de l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) ou les régions de chromatine ouvertes dans le dosage pour le séquençage de la chromatine accessible par la transposase (ATAC) et le séqu....

Protocole

Les comités institutionnels de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Yale et de l’Université de Virginie ont approuvé toutes les expériences sur les animaux énumérées dans ce protocole.

1. Obtenir des yeux de souris pour l’isolement rétinien

1. Préparez 1x PBS glacé et ajoutez 500 μL à chaque puits d’une plaque de 48 puits.
2. Euthanasier les souris néonatales au sixième jour postnatal (P6) selon les directives approuvées de l’établissement. Pour cette expérience, des portées d’environ 4 à 8 souris néonatales sont euthanasiées à P6 par inhalation d’isoflurane pendant au moins trois minu....

Résultats

La digestion du tissu rétinien et l’immunomarquage pour CD31 et CD45 donnent lieu à une population identifiable de cellules endothéliales CD31+/CD45- après vérification des cellules, des cellules individuelles et de la viabilité (figure 2A). L’immunocoloration CD45 est nécessaire pour éliminer les cellules CD31+/CD45+, qui comprennent les plaquettes et certains leucocytes²¹. Des contrôles doivent être effectués pour chaque expérience afin de montrer la.......

Discussion

Ce protocole décrit une méthode d’isolement des cellules endothéliales à partir du tissu rétinien murin postnatal qui a été optimisée pour un nombre élevé de cellules, une pureté et une viabilité. La pureté cellulaire est obtenue par isolement FACS de populations de cellules endothéliales à partir de la suspension unicellulaire digérée par immunomarquage CD31+/CD45-. La qualité de l’isolement est quantifiée dans les essais de viabilité par coloration au bleu de trypan et expression génique par qP.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Eppendorf safe-lock tubes	USA Scientific	4036-3352
5 ml Falcon Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
60 mm Non TC-treated Culture Dish	Corning	430589
APC Rat Anti-Mouse CD31	BD Biosciences	551262
APC Rat IgG2a κ Isotype Control	BD Biosciences	553932
BD FACSChorus Software	BD Biosciences	FACSCHORUS
BD FACSMelody Cell Sorter	BD Biosciences	FACSMELODY
Collagenase Type II	Sigma-Aldrich	234115
Costar 48-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3548
D-Glucose	Gibco	A2494001
Disposable Graduated Transfer Pipettes	Fisher Scientific	12-711-9AM
Dissecting Pan Wax	Carolina	629100
Dissection scissors	Fine Science Tools	14085-08
Dissection Stereo Microscope M165 FC	Leica	M165FC
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-052
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190144
Eppendorf Flex-Tubes Microcentrifuge Tubes 1.5 mL	Sigma-Aldrich	22364120
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio	100-106
Fine dissection forceps	Fine Science Tools	11250-00
Hank's Buffered Salt Solution (HBSS)	Gibco	14175095
HEPES (1M)	Gibco	15630130
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	1708890
Isoflurane, USP	Covetrus	11695067772
Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath	Fisher Scientific	FSGPD20
Primer: ActB_Forward: 5’- agagggaaatcgtgcgtgac -3’	Integrated DNA Technologies	N/A
Primer: ActB_Reverse: 5’- caatagtgatgacctggccgt -3’	Integrated DNA Technologies	N/A
Primer: CD31_Forward: 5’- gagcccaatcacgtttcagttt -3’	Integrated DNA Technologies	N/A
Primer: CD31_Reverse: 5’- tccttcctgcttcttgctagct -3’	Integrated DNA Technologies	N/A
Primer: CD45_Forward: 5’- gggttgttctgtgccttgtt -3’	Integrated DNA Technologies	N/A
Primer: CD45_Reverse: 5’- ctggacggacacagttagca -3’	Integrated DNA Technologies	N/A
Primer: VE-Cadherin_Forward: 5’- tcctctgcatcctcactatcaca -3’	Integrated DNA Technologies	N/A
Primer: VE-Cadherin_Reverse: 5’- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3’	Integrated DNA Technologies	N/A
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	P4864
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134
Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge, Refrigerated	ThermoFisher	75002477
SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5120
Trypan Blue Solution	ThermoFisher	15250061
V450 Rat Anti-Mouse CD45	BD Biosciences	560501
V450 Rat IgG2b, κ Isotype Control	BD Biosciences	560457