Visualisation aux rayons X d’un traitement ablatif intracanalaire à base d’éthanol pour la prévention du cancer du sein chez le rat

Résumé

Une procédure pour l’administration d’une solution ablative chimique à l’arbre canalaire mammaire du rat pour le traitement préventif du cancer du sein guidé par l’image est décrite. Les cellules épithéliales mammaires peuvent être ciblées avec un minimum de dommages collatéraux aux tissus par canulation directement dans l’ouverture du mamelon et perfusion intracanalaire d’une solution ablative à base d’éthanol à 70%.

Résumé

Il existe encore un nombre limité d’interventions primaires pour la prévention du cancer du sein. Pour les femmes à risque élevé de développer un cancer du sein, l’intervention la plus efficace est la mastectomie prophylactique. Il s’agit d’une intervention chirurgicale drastique dans laquelle les cellules épithéliales mammaires qui peuvent donner lieu à un cancer du sein sont complètement enlevées avec les tissus environnants. L’objectif de ce protocole est de démontrer la faisabilité d’une procédure intracanalaire mini-invasive qui pourrait devenir une nouvelle intervention primaire pour la prévention du cancer du sein. Cette procédure locale permettrait de préférence d’ablater les cellules épithéliales mammaires avant qu’elles ne deviennent malignes. Des méthodes intracanalaires pour fournir des solutions directement à ces cellules épithéliales dans des modèles de cancer du sein chez les rongeurs ont été développées à la Michigan State University et ailleurs. La glande mammaire du rat est constituée d’un seul arbre canalaire qui a une architecture plus simple et plus linéaire par rapport au sein humain. Cependant, les modèles de cancer du sein induits chimiquement chez le rat offrent des outils précieux pour les études de validation de principe de nouvelles interventions préventives et l’évolutivité des modèles murins aux humains. Ici, une procédure d’administration intracanalaire d’une solution ablative à base d’éthanol contenant des nanoparticules d’oxyde de tantale comme agent de contraste aux rayons X et de l’éthylcellulose comme agent gélifiant dans l’arbre canalaire mammaire du rat est décrite. L’administration de réactifs aqueux (p. ex. composés cytotoxiques, siRNAs, AdCre) par injection intracanalaire a été décrite précédemment dans des modèles de souris et de rats. Cette description du protocole met l’accent sur les changements méthodologiques et les étapes qui se rapportent uniquement à l’administration d’une solution ablative, à la formulation pour minimiser les effets secondaires locaux et systémiques de la solution ablative et à l’imagerie par rayons X pour l’évaluation in vivo du remplissage des arbres canalaires. Les techniques de fluoroscopie et de micro-tomodensitométrie permettent de déterminer le succès de l’administration de la solution ablative et l’étendue du remplissage des arbres canalaires grâce à la compatibilité avec l’agent de contraste contenant du tantale.

Introduction

Pour les femmes aux États-Unis¹, le cancer du sein (BC) continue d’être le type de cancer le plus diagnostiqué et cause plus de décès que tout autre type de cancer, à l’exception du cancer du poumon. Les projections pour 2022 estiment que 51 400 femmes recevront un diagnostic de carcinome in situ et 287 850 femmes recevront un diagnostic de carcinome invasif et que 43 600 femmes mourront de BC¹. Malgré la prévalence et la mortalité associées à la Colombie-Britannique, il existe peu d’options disponibles pour la prévention primaire et la recherche translationnelle sur les nouvelles interventions, car la prévention primaire n’est pas priorisée par les organismes fédéraux². La mastectomie prophylactique est l’intervention la plus efficace pour la prévention primaire. Cependant, cette procédure n’est recommandée que pour les personnes à haut risque, car il s’agit d’une intervention chirurgicale majeure ayant des conséquences qui changent la^vie3. Cette chirurgie implique l’ablation complète des cellules épithéliales mammaires à partir desquelles la cancérogenèse se développe ainsi que des tissus environnants normaux. Les individus sont souvent dissuadés d’utiliser cette procédure comme première option d’intervention primaire en raison de l’impact négatif du stress physique, psychologique et social. Pour ces raisons, même certaines personnes à haut risque choisissent de ne pas subir cette procédure et choisissent plutôt l’attente vigilante ou des stratégies de surveillance^{similaires 3}. Dans une publication précédente, l’administration de 70% d’éthanol (EtOH) directement dans l’arbre canalaire de modèles murins était efficace pour ablation chimique des cellules épithéliales mammaires avec des dommages limités aux tissus normaux adjacents et pour prévenir la formation de tumeurs mammaires⁴. L’EtOH est utilisé dans de multiples applications cliniques comme agent ablatif pour le traitement local de certains cancers ou agent sclérosant pour le traitement local de l’enflure artérioveineuse et des malformations 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Le faible profil de toxicité et d’innocuité de l’EtOH est bien établi, car dans certaines procédures, jusqu’à 50 mL d’EtOH à 95% peuvent être administrés par séance ^5,10.

L’ablation complète des cellules épithéliales mammaires à partir desquelles la BC se développe est l’élément le plus crucial de la mastectomie prophylactique et de l’administration locale d’une solution ablative. Par conséquent, la confirmation du remplissage complet de l’arbre canalaire est nécessaire pour garantir que la solution ablative est entrée en contact direct avec toutes les cellules épithéliales mammaires. L’administration d’une solution dans le(s) arbre(s) canalaire(s) et sa visualisation par fluoroscopie ou ductographie guidée par l’image sont possibles grâce à des procédures cliniques qui existent déjà^15,16,17. Ainsi, il sera possible de mettre en œuvre et d’évaluer facilement cette procédure dans les essais cliniques. Une étape clé dans l’établissement de l’efficacité et de la faisabilité translationnelle de l’ablation intracanalaire (DI) en tant que nouvelle intervention pour la prévention primaire sera de démontrer la faisabilité de cette approche de visualisation par rayons X dans des modèles animaux de taille et de complexité croissantes de leur architecture d’arbre canalaire 4,18,19. Un protocole qui étend cette procédure ablative de la souris²⁰ aux modèles de rats est décrit ici. Alors que les arbres canalaires de souris et de rats ont une structure linéaire et un motif de ramification similaires, l’arbre canalaire du rat est proportionnellement plus grand et est entouré d’un stroma beaucoup plus dense. Nous avons mis en place une méthode en laboratoire pour injecter avec succès chaque glande mammaire chez un rat sur une série de séances hebdomadaires avec une solution ablative contenant un agent de contraste. L’espacement des séances est nécessaire pour s’assurer que les animaux ont des effets secondaires minimes de l’EtOH (Figure 1 et Figure 2). La procédure consiste à injecter la solution ablative directement dans l’ouverture du mamelon d’un rat anesthésié à l’isoflurane avec une aiguille de 33 G. Certaines améliorations clés de la procédure comprennent l’utilisation d’un traitement anti-inflammatoire étendu, l’injection de volumes plus élevés par arbre canalaire que suggéré²¹, et des seringues étanches aux gaz pour les liquides et les gaz. La durée du traitement avec 5 mg/kg de carprofène (un AINS) de 48 h avant à 1 semaine après les injections d’ID est comparable au protocole anti-inflammatoire utilisé pour le traitement sclérosant des malformations veineuses en clinique. Le traitement est effectué sur des patients sous anesthésie systémique suivie de 2 jours de médicaments anti-inflammatoires tels que les AINS. Le traitement anti-inflammatoire peut être prolongé de quelques jours supplémentaires pour réduire l’inflammation locale et toute douleur potentielle¹³. Comme chez la souris²⁰, l’injection intrapéritonéale d’une solution de saccharose à 5% atténue l’effet à court terme de l’intoxication alcoolique chez le rat. Les rats peuvent recevoir jusqu’à 1 mL d’EtOH à 70 % (jusqu’à 4 conduits; 0,2 g/dL d’EtOH dans le sang) en une seule séance lorsqu’ils sont administrés avec cette solution de saccharose; les animaux se rétablissent complètement dans les 4 heures suivant les injections intra-injectables. Nous effectuons des séances séquentielles pour permettre un temps de récupération suffisant lors de l’injection de plus de 4 glandes et / ou de concentrations plus élevées d’EtOH. L’intoxication alcoolique chez les femmes sera beaucoup moins probable que l’injection par ID de tous les arbres canalaires dans les deux seins, en supposant que 16 canaux principaux^16,17 et 2 mL par conduit^22,23, avec 70% d’EtOH entraînerait moins de ^0,1 g / dL de contenu d’EtOH dans le sang et pourrait entraîner une légère déficience.

L’imagerie par rayons X permet de déterminer le degré de réussite de l’administration intracanalaire dans chaque glande individuelle et si l’arbre canalaire entier est rempli (Figure 1, Figure 2, Figure 3). L’imagerie par fluoroscopie en temps réel en préparation de la micro-tomodensitométrie et/ou de la reconstruction 3D des données du fichier DICOM peut être utilisée pour évaluer l’étendue de la livraison de solution dans l’arbre canalaire et toute fuite dans le stroma. L’utilisation de la fluoroscopie peut aider à limiter la dose globale de rayonnement imposée à l’animal. La technique de fluoroscopie se rapproche plus de l’application clinique prévue pour le guidage par imagerie de ce traitement ablatif. Une comparaison d’Isovue contenant de l’iode approuvé par la FDA avec des nanoparticules d’oxyde de tantale (TaO_x) a été effectuée afin d’affiner davantage l’utilité de la solution ablative ^4,19. Il a été constaté que TaO_x est un agent de contraste micro-CT supérieur à Isovue pour la visualisation du remplissage initial de l’arbre canalaire chez la souris ^4,19. Ici, nous démontrons que TaOx est un agent de contraste approprié pour visualiser le remplissage initial de l’arbre canalaire du rat (Figure 2 et Figure 3). Tant dans la recherche translationnelle que dans les applications de pratique clinique, l’agent gélifiant éthylcellulose (EC) a été ajouté à la solution d’EtOH pour minimiser la diffusion à partir des régions ciblées 13,14,24,25,26,27,28,29. Des études ont montré que l’ajout de jusqu’à 1,5 % d’EC à des solutions ablatives contenant de l’EtOH est compatible avec l’imagerie à base de TaO_x (Figure 3). Ceux-ci ainsi que d’autres améliorations apportées à la solution ablative peuvent aider à la traduction rapide de cette procédure guidée par l’image à la clinique.

Protocole

Toutes les expériences décrites ont été menées selon des protocoles approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de la Michigan State University.

1. Traitement anti-inflammatoire prolongé

1. Préparer des tasses de gel de sucralose comme dosage oral de carprofène. Fournir aux rats ce traitement anti-inflammatoire de 2 jours avant de recevoir une injection intraveineuse de 70% d’EtOH à 7 jours après la procédure.
2. Diluer une solution de travail de carprofène dans du PBS stérile pour injection dans la tasse. À partir d’une solution mère à 50 mg/mL, préparer une solution diluée à 2 mg/mL colorée avec un colorant alimentaire bleu stérile à 1 % v/v et injecter 500 μL dans chaque tasse. L’ajout du colorant aide à visualiser le mélange complet du médicament dans le sucralose de la tasse.
3. Suivez la recommandation du fabricant pour préparer la tasse pour l’ajout de carprofène. Sauf indication contraire du vendeur, réchauffer la tasse au bain-marie à 60 °C pendant 15 minutes et la sécher au moment de la retirer pour réduire le risque de contamination.
   1. Nettoyez le couvercle de la tasse de sucralose avec 70% d’EtOH dans la zone et introduisez l’aiguille de la seringue contenant la solution de travail au carprofène. Distribuer le volume approprié (500 μL).
   2. Couvrez la perforation avec un autocollant. Secouez énergiquement la tasse pendant 15 s, puis placez cette tasse dans un vortex pendant 15 s supplémentaires. Évaluer visuellement le mélange homogène et complet avant de stocker pour une utilisation ultérieure. Recherchez la présence d’une couleur bleu foncé.
      REMARQUE: Laissez les tasses à la température ambiante. Conservez les tasses à température ambiante si vous le souhaitez, mais faites attention aux conseils d’efficacité du médicament du fabricant. Vous pouvez également conserver les gobelets à 4 °C et les utiliser dans un délai d’un mois. La datation de l’autocollant est une bonne pratique pour garder une trace de la date d’injection sans risque qu’un stylo ou un marqueur pointu perfore le couvercle.
4. Juste avant utilisation, essuyez l’extérieur de la tasse avec 70% d’EtOH. Retirez le couvercle avant de placer la tasse dans la cage à animaux. Remplacez les gobelets tous les deux jours ou lorsqu’ils sont vides. Vérifiez le niveau de gel quotidiennement pour assurer un dosage adéquat. Une tasse peut fournir du carprofène pour jusqu’à deux rats jusqu’à 2 jours; Cependant, les rats peuvent consommer une tasse entière plus tôt.

2. Préparation préopératoire

REMARQUE: Assurez-vous que l’étape de préparation de l’animal précède la procédure d’injection d’ID de 2-3 jours.

1. Allumez le vaporisateur d’isoflurane (2%-3% isoflurane, 1,5 L/min d’oxygène) pour anesthésier le rat. Déplacez l’animal vers un cône de nez sur un coussin chauffant. Appliquez du lubrifiant pour les yeux sur le rat, puis positionnez l’animal sur le dos. Surveillez attentivement la respiration de l’animal pour vous assurer que le plan anesthésique est maintenu à 1 % à 3 % d’isoflurane.
   REMARQUE: Un rasoir électrique peut être utilisé pour enlever l’excès de fourrure avant l’épilation. Des précautions extrêmes doivent être prises pour ne pas endommager les mamelons avec le rasoir. Pour cette raison, cette étape peut être ignorée. Les rats sont plus sensibles à la crème dépilatoire que les souris, il est donc très important d’éliminer l’excès de crème. Évitez d’injecter une solution contenant de l’éthanol dans une zone où l’épilation présente déjà une abrasion. Certaines crèmes ont ajouté des composés tels que l’aloès et la lanoline qui peuvent aider à minimiser le risque d’abrasions.
2. Utilisez un applicateur à embout de coton pour étaler la crème dépilatoire en vente libre sur la zone du mamelon. Utilisez l’applicateur pour frotter la crème dans la zone pendant 10-30 s. Vérifiez si la fourrure s’est rapidement desserrée.
   1. Laissez la crème sur le rat pendant l’intervalle le plus court possible et retirez-la complètement pour éviter de brûler la peau. Les rats sont encore plus sensibles à cette procédure que les souris.
3. Après 10-30 s d’application, humidifiez la gaze avec de l’eau tiède et utilisez-la pour rincer la crème et la fourrure détachée de l’animal. Effectuez au moins trois rinçages de la zone avec de la gaze fraîchement humidifiée et séchez avec de la gaze sèche après le rinçage final. Confirmez une bonne visibilité et un bon accès à la zone du mamelon d’où la fourrure est retirée. Répétez la procédure dépilatoire si nécessaire.
4. Placez le rat dans une cage propre sur un coussin chauffant et laissez-le récupérer. Vérifiez le rat pour vous assurer qu’il est complètement rétabli de l’anesthésie avant de le ramener dans sa cage permanente.
5. Placez une tasse de gel de sucralose dosée au carprofène (1 mg / tasse) dans la cage pour un traitement anti-inflammatoire. Vérifiez la consommation quotidienne de gel et remplacez-la par une tasse fraîche selon le cas. Ne laissez pas la tasse pendant plus de 2 jours. En règle générale, les tasses devront être remplacées après 1 jour.

3. Injection intracanalaire

1. Préparer la solution mère de TaO_x à 333,3 mM comme décrit¹⁹ en utilisant une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS). Réchauffer la solution si la poudre ne se dissout pas complètement. Remuer doucement. Ne pas vorter ou agiter vigoureusement pour éviter la formation de bulles.
2. Mélanger trois parties de TaO x 333,3 mM avec sept parties d’EtOH à 100% pour obtenir une solution finale d’EtOH 100 mM/TaO_x à 70%. Éventuellement, ajouter une quantité appropriée de 0,5% à 1,5% d’éthylcellulose (EC) comme agent gélifiant pour maximiser la rétention locale de la solution ablative. Ajouter un colorant alimentaire bleu à 1 % v/v à la solution ablative pour l’examen visuel de l’administration dans l’arbre canalaire pendant la perfusion.
3. Préparer un volume adapté aux besoins expérimentaux. Les paires de glandes 1 (cervicale) et 6 (inguinale) peuvent être remplies avec jusqu’à 100 μL de la solution tandis que toutes les autres paires peuvent être remplies avec jusqu’à 300 μL.
4. Anesthésiez le rat comme à l’étape 2.1 et déplacez le rat vers le cône nasal une fois complètement anesthésié. Appliquez du lubrifiant pour les yeux sur les deux yeux, puis placez l’animal sur le dos. Fixez le rat sous le stéréoscope à l’aide de ruban adhésif près des mamelons qui seront injectés, si désiré. Le poids du rat est généralement suffisant pour l’empêcher de bouger considérablement sans ruban adhésif.
5. Pour préparer les mamelons pour l’injection, retirez toute peau morte qui recouvre l’ouverture du mamelon avec une pince fine et pointue, si possible. Les rats ont souvent un bouchon dépassant de l’ouverture du mamelon qui peut empêcher la canulation réussie du mamelon s’il n’est pas retiré.
   REMARQUE : Il est important de noter que des volumes d’injection plus importants de solutions ablatives utilisées chez le rat peuvent être plus susceptibles d’entraîner des plaies cutanées superficielles près du ou des sites d’injection. Pour cette raison, l’injection d’un mamelon sur deux en une seule séance est moins dommageable et irritante pour l’animal que l’injection de mamelons adjacents. La surveillance des rats pour détecter toute abrasion pendant 7 jours après l’injection permet de s’assurer qu’il n’y a pas d’effets graves sur la santé causés par le grattage de l’animal et l’introduction de la possibilité d’infection par contamination par des débris du sol de la cage. Une pommade antibiotique triple ou des lavages avec une solution de chlorhexidine peuvent être utilisés pour traiter tout signe d’infection par blessure pouvant survenir (tableau 1).
6. Utilisez une seringue de 500 μL avec une aiguille de 33 G pour aspirer 101-301 μL de solution ablative. Aspirer 1 μL supplémentaire de la solution pour une éventuelle fuite mineure lors du retrait de l’aiguille canulée.
   NOTE: Ce sont des recommandations pour les volumes visant à remplir complètement le(s) arbre(s) canalaire(s): jusqu’à 100 μL dans les glandes cervicales et inguinales, et jusqu’à 300 μL dans les autres glandes. Pour d’autres applications, il peut être approprié d’utiliser des volumes plus petits ou plus grands.
7. Utilisez une pince à épiler pour tenir doucement le mamelon et canuler l’aiguille dans l’ouverture du mamelon. Continuez doucement à insérer l’aiguille jusqu’à ce que le biseau soit complètement à l’intérieur du mamelon. Pour accueillir l’aiguille dans le mamelon, amenez le mamelon vers l’aiguille au lieu de pousser l’aiguille vers le bas dans le mamelon. (tableau 1). Prenez soin de suivre le chemin de l’ouverture du mamelon.
   REMARQUE: Les mamelons de rat sont généralement beaucoup plus faciles à manipuler et à canuler avec succès que ceux des souris en raison de leur plus grande taille. Cependant, la quantité accrue de graisse entourant l’ouverture du mamelon le rend également plus susceptible d’injecter par erreur le coussinet graisseux si l’aiguille dévie du canal principal.
8. Une fois le biseau à aiguille complètement inséré, infuser lentement la solution à un débit constant d’environ 100 μL/min chez le rat. Des changements brusques dans le débit de perfusion peuvent éclater ou endommager l’arbre canalaire. Attendre 30 s après la fin de la perfusion avant de retirer l’aiguille de l’arbre canulé à l’aide d’une pince; cela garantit que le volume injecté reste à l’intérieur de l’arbre canalaire (Figure 2) et réduit la probabilité de fuite.
9. Nettoyez toute solution renversée avec de la gaze humidifiée ou une lingette EtOH pour éviter toute solution de contraste étrangère dans les images.
10. Injecter du PBS contenant 5 % de saccharose (10 mL/kg) par voie intrapéritonéale pour atténuer les effets de l’intoxication alcoolique si de l’éthanol est contenu dans les solutions injectables par voie intraveineuse. Cette dose peut être administrée au début et à la fin de la procédure.

4. Imagerie micro-CT

1. Une fois que toutes les glandes désirées ont été injectées, déplacez rapidement l’animal vers le système micro-CT et continuez à maintenir l’anesthésie à l’aide du vaporisateur d’isoflurane incorporé.
2. Redressez la colonne vertébrale de l’animal et collez chaque patte arrière dans une position étendue, de sorte que les os de la patte de l’animal soient plus éloignés des glandes inférieures d’intérêt et ne chevauchent pas la région d’intérêt dans l’image numérisée.
3. Scotcher sur l’abdomen pour minimiser les artefacts respiratoires si vous scannez les glandes inférieures.
   REMARQUE : Les animaux peuvent être imagés avec différents paramètres de balayage (p. ex. haute résolution, balayages longitudinaux) si l’on prend soin de déterminer une dose de rayonnement acceptable appropriée à vie pour les rats et de s’assurer que la dose cumulative ne dépasse pas ce niveau. L’exposition aux rayonnements peut être encore réduite en acquérant des photos et des vidéos de fluoroscopie sans effectuer de balayage (figure 2).
4. Effectuer une imagerie TaO_x de l’arbre canalaire du rat avec une bonne résolution et la possibilité de répéter des balayages d’acquisition standard (2 min) en utilisant les paramètres de balayage suivants: 90 kVp / 88 μA; champ de vision (FOV), 72 mm; nombre de tranches, 512; épaisseur de tranche, 72 μm; Résolution voxel, 72 μm³. Des scans à haute résolution pendant de plus longues périodes (4 à 14 min) peuvent également être acquis chez des animaux qui ne seront pas scannés longitudinalement en utilisant les mêmes paramètres.
5. Après l’acquisition des données, retirez soigneusement le rat du cône d’anesthésie et placez-le dans une nouvelle cage propre sur un coussin chauffant. Vérifiez le rat pour vous assurer qu’il s’est complètement remis de l’anesthésie avant de le ramener dans sa cage permanente. Placez la tasse de sucralose contenant du carprofène et remplacez-la de manière appropriée, comme décrit à l’étape 2.5, pour vous assurer que les animaux continuent de recevoir un traitement anti-inflammatoire pendant les 7 prochains jours.
6. Transformez les images numérisées en rendus rapides dans le logiciel micro-CT pour mieux apprécier les fuites de contraste, le remplissage partiel ou le surremplissage (Figure 2).
7. Passez à la section suivante pour effectuer un traitement formel des images en vue de leur publication ou de l’analyse détaillée des numérisations, si vous le souhaitez (Figure 3).

5. Analyse d’images

1. Utilisez des progiciels spécialisés pour produire des rendus de l’arbre canalaire rempli.
   REMARQUE: Il est préférable de segmenter le coussinet graisseux mammaire afin d’obtenir la meilleure interprétation de l’arbre canalaire injecté. Spline trace les limites sombres du coussinet graisseux sur toute l’épaisseur de l’animal afin d’obtenir cette segmentation.
2. Pour segmenter le coussinet graisseux (contrairement aux souris, les limites de ce compartiment ne sont pas aussi faciles à distinguer de la cavité péritonéale, des muscles fémoraux et de la peau en raison d’unités Hounsfield similaires) dans lequel l’arbre canalaire d’intérêt est contenu, la sélection de l’option « trace spline » dans le menu manuel est la première étape de la création d’un rendu.
3. Spline trace le contour du coussinet gras dans une tranche sur trois. Cliquez sur l’option Propager les objets dans le menu semi-automatique. Cela va propager et connecter toutes les tranches en un seul objet d’intérêt segmenté.
   REMARQUE: La modification du seuil dans la région segmentée permet de visualiser le signal uniquement dans une certaine plage d’unités Hounsfield (HU); Pour d’autres agents de contraste ou paramètres d’imagerie, il peut être nécessaire d’ajuster cette plage. Un progiciel ou une analyse d’intelligence artificielle peut être utilisé pour effectuer d’autres mesures et images afin de montrer combien l’arbre canalaire a été rempli.
4. Définissez les valeurs HU sur un point bas de 300 et un point haut de 3 000 dans le menu semi-automatique sous l’onglet Volume de seuil. Cela permet de créer un rendu affichant uniquement le contraste (TaO_x) dans l’arbre canalaire.
5. Définissez le rendu comme principal à l’aide du bouton « Afficher ». Cela modifiera l’affichage pour afficher uniquement le rendu 3D de l’arbre canalaire.
   REMARQUE: Effectuez une reconstruction de l’arbre canalaire pour une analyse plus approfondie.

Résultats

Chacune des 12 glandes mammaires d’un rat femelle contient un seul arbre canalaire qui s’ouvre au niveau de l’orifice du mamelon. Malgré les différences de taille entre la souris et le rat, le moment du développement des glandes mammaires et le moment où ces animaux atteignent l’âge adulte sont très similaires^30,31. Une brève description des étapes clés du développement des glandes mammaires chez le rat en tant que représentatives des deux espèces de rongeurs est fournie. Les bourgeons terminaux (TEB) sont les structures hautement prolifératives aux extrémités de l’arbre canalaire allongé qui dirigent la ramification canalaire^30,31. Le pic de prolifération et de densité des TEB se produit à l’âge de 3-4 semaines pendant la phase d’allongement de l’arbre canalaire dans le développement pubertaire³⁰. À l’âge de 9-10 semaines, il reste peu de TEB car l’arbre canalaire a grandi pour occuper toute la longueur du coussinet adipeux³⁰. Après cela, la croissance et l’expansion de l’arbre canalaire sont proportionnelles à celles du coussinet graisseux et de l’animal³². Les unités lobulaires canalaires terminales (TDLU) dans le sein humain jouent un rôle similaire à celui des TEB chez les rongeurs. Les TDLU sont la principale source d’initiation de la cancérogenèse et de progression vers^{BC 33,34}. Nous pouvons injecter jusqu’à 300 μL de solution d’EtOH à 70 % pour remplir tout l’arbre canalaire des glandes mammaires thoracique et abdominale du rat Sprague-Dawley âgé de 9 semaines (Figure 1, Figure 2, Figure 3). Contrairement aux souris²⁰, les mamelons des glandes cervicales et inguinelles des rats Sprague-Dawley conviennent généralement à l’injection chez plus de 80 % des animaux, et jusqu’à 100 μL de solution d’EtOH à 70 % sont nécessaires pour remplir tout l’arbre canalaire (Figure 2). Nous injectons régulièrement jusqu’à 10 glandes mammaires avec la solution ablative à l’étude. Un plan expérimental typique consiste en deux séances hebdomadaires indépendantes d’injection de DI, au cours desquelles cinq glandes alternées sont perfusées avec la solution ablative contenant un agent de contraste radiologique et/ou une EC comme agent gélifiant (Figure 2). Pour la solution ablative contenant du TaO_x (50-200 mM), une fluoroscopie et/ou une micro-tomodensitométrie sont effectuées après la fin de chaque séance afin de déterminer et d’enregistrer le succès individuel de la perfusion de chaque arbre canalaire avec une quantité partielle ou totale de solution perfusée (Figure 2). L’imagerie immédiate et longitudinale après injection permet d’évaluer comment les changements de formulation, en particulier la concentration d’agent gélifiant EC, affectent et limitent la diffusion vers l’extérieur de la solution ablative en fonction du volume injecté (Figure 3). Cette analyse d’imagerie fournit des informations permettant de comprendre les paramètres optimaux pour obtenir une ablation maximale avec un minimum de lésions tissulaires collatérales.

Figure 1 : Schémas de la procédure d’injection intracanalaire et d’analyse d’images chez le rat. La procédure étape par étape pour l’injection intracanalaire et l’analyse d’images sont mises en évidence. Veuillez regarder la vidéo pour plus de détails. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Exemples de canulation du mamelon et résultat de l’administration de la solution ablative dans plusieurs glandes mammaires. (A) Présentation typique des formes des mamelons chez la souche de rat Sprague-Dawley. La longueur du mamelon est en corrélation avec la probabilité de réussite de la canulation. Les mamelons plus longs sont plus faciles à canuler que les mamelons courts, tandis que les mamelons excessivement courts ou vestigiaux ne peuvent pas être canulés. Une fois canulées, les mamelons longs et courts peuvent être perfusés avec la solution et obtenir des taux de réussite d’administration similaires. Le colorant alimentaire bleu dans la solution injectée peut être utilisé comme preuve in vivo du remplissage de l’arbre canalaire et du succès de la livraison (le plus apparent, la formation de dômes, pour une injection infructueuse de coussinet adipeux). La fluoroscopie en temps réel (B) et les rendus micro-CT 3D générés après l’acquisition d’images (C) fournissent des preuves in vivo du succès de la livraison et une évaluation plus quantitative de la solution atteignant les TEB. (B) Chaque glande mammaire abdominale de la première paire (#4, #10) a reçu une solution ablative avec 1% EC (contour orange) ou sans elle (contour vert) (C) Livraison réussie (contour bleu) de la solution ablative dans le col de l’utérus droit (3, deuxième paire de glandes mammaires thoraciques (#3, #9) et première paire abdominale (#4, #10), et injection infructueuse (contour blanc pointillé) dans la glande thoracique gauche # 10. Les barres d’échelle correspondent à 1 mm dans les images à différents grossissements. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Reconstruction 3D et évaluation du remplissage et de la diffusion de la solution ablative. 70% EtOH/100 mM TaO_x nanoparticules avec 1% EC (en haut) ou sans EC (en bas) ont été injectées par voie intracanalaire dans la deuxième paire de glandes mammaires abdominales (#4 et #10) et immédiatement imagées par micro-CT. Chaque rat Sprague-Dawley a reçu un volume croissant de l’une ou l’autre solution. Les arbres canalaires individuels ont été reconstruits à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images (trace spline + objet de propagation + rendu de seuil). Avec 1% EC, la solution peut être vue atteindre les extrémités terminales. Au fur et à mesure que le volume livré augmente, le nombre de TEB remplis est plus apparent. La barre d’échelle correspond à 10 mm dans tous les rendus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Émettre	Apparence	Solution
Mamelon court (Fig. 2)	Le mamelon a un profil bas – difficile à saisir	Il est parfois plus facile de tenir la peau près du mamelon et de cibler le centre du mamelon avec l’aiguille. L’aiguille plongera probablement sous la peau. Tirer lentement vers le haut peut révéler que le mamelon est légèrement au-dessus du bout de l’aiguille et donner de la place pour le saisir et le tirer le reste du chemin sur l’aiguille. Soyez très prudent lorsque vous plongez sous la peau autour de l’angle de l’aiguille. Il est facile d’obtenir par inadvertance une injection de coussinet adipeux en poignardant sous le mauvais angle.
Injection de coussinets adipeux (Fig. 2)	Enflé autour du mamelon et peut-être dans le mamelon lui-même – plus facile à voir si de la couleur est ajoutée à la solution d’injection	Si le mamelon gonfle avec les premières injections ul, retirez l’aiguille et essayez de l’insérer à nouveau avec plus de soin pris de l’angle. Recommencez l’injection et surveillez l’enflure supplémentaire. Si l’enflure persiste, abandonnez la tentative. Il est très rare d’injecter avec succès un mamelon qui a commencé comme une injection de coussinet adipeux.
Plaies/croûtes	Plaie ouverte ou écaillage près du site d’injection de la solution d’EtOH	Les rats sont plus susceptibles que les souris de développer des plaies ou des croûtes près de la zone d’injection. Si des plaies sont trouvées, appliquez une pommade antibiotique triple sur les plaies ouvertes, mais laissez les plaies croûtées seules. L’application d’une pommade sur les croûtes peut augmenter la probabilité que l’animal dérange la croûte et l’enlève. Vérifiez tous les 1-2 jours jusqu’à guérison en fonction de la gravité de la plaie. Le carprofène doit être administré jusqu’à guérison, même s’il est au-delà de la fenêtre normale.
Injecter des glandes alternées	N/A	Des volumes d’injection plus importants chez le rat le rendent plus susceptible de provoquer des abrasions cutanées lors de l’injection de glandes consécutives. Pour la probabilité minimale de traumatisme à la zone d’injection, d’autres glandes ont été injectées en une seule séance (c.-à-d. injecter #1, 3, 4 et 6 plutôt que #1-4). L’espacement entre les troisième (#3 et #9) et quatrième (#4 et #10) paires de glandes permet l’injection de ces deux glandes en une seule séance.

Tableau 1 : Conseils utiles et dépannage

Discussion

Comme indiqué ici, l’administration d’ID de 70% d’EtOH enlève préférentiellement les cellules épithéliales mammaires avec des dommages collatéraux limités au stroma environnant et au système vasculaire chez la souris⁴. L’ablation locale de l’arbre canalaire est efficace pour prévenir la formation de tumeurs dans les modèles murins⁴. Ici, nous démontrons que cette procédure ablative peut être étendue aux rats.

Il s’agit de la prochaine étape dans la voie de la traduction de cette procédure ablative en tant qu’intervention alternative à la mastectomie prophylactique pour la prévention primaire du cancer du sein chez les personnes à haut risque. L’ajout de nanoparticules de TaO_x en tant qu’agent de contraste aux rayons X à la solution ablative permet d’évaluer l’efficacité de la solution à prévenir la formation de tumeurs, car il est possible de déterminer si la procédure a réussi ou non à remplir complètement l’arbre canalaire. L’utilisation de la fluoroscopie pour visualiser la glande mammaire injectée reflète ce qui sera probablement fait en clinique pour guider cette procédure d’identification. Le guidage par image de la quantité de nourriture dans laquelle la solution a rempli l’arbre canalaire et du moment d’arrêter la perfusion sera un aspect clé de la mise en œuvre clinique pour assurer un remplissage maximal de chaque arbre canalaire. Les dépannages et les conseils utiles sont répertoriés dans le tableau 1. L’efficacité de cette procédure ablative exige que la solution infusée entre en contact direct avec toutes les cellules épithéliales pour maximiser le taux de destruction cellulaire. Des cellules épithéliales de rechange dans un ou plusieurs arbres pourraient éventuellement servir de source pour le développement de la Colombie-Britannique. Les autres groupes ont signalé l’administration par ID de particules virales (p. ex. composants des systèmes Cre/LoxP et/ou Cas9/CRISPR), d’hormones et d’antagonistes hormonaux (p. ex. prolactine, fulvestrant), d’agents chimiothérapeutiques (p. ex. cisplatine), de siRNA et/ou d’anticorps ou d’autres agents de ciblage chez les souris 4,19,21,35,36,37,38,39,40^, 41,42,43,44,45, rats 21,33,46,47,48 et/ou lapins ^{18,49,50,51,52,53} . Des études cliniques indépendantes ont rapporté la réussite de la canulation de jusqu’à huit arbres canalaires par sein humain pour l’administration locale de la chimiothérapie dans des études cliniques indépendantes 47,54,55. Le guidage par imagerie pour la perfusion de ces autres solutions visant à la prévention des tumeurs ou orientées vers un traitement local maximiserait également leur efficacité.

L’évolutivité et le raffinement de cette procédure de l’arbre canalaire de la souris à l’arbre canalaire du rat sont démontrés ici. La nanoparticule TaO_x dans l’arbre canalaire^{murin 4,19} et le rat (données non publiées) fournissent une imagerie haute résolution qui surpasse les agents de contraste radiographiques contenant de l’iode approuvés par la FDA. De même, nous ne connaissons pas d’autres approches d’imagerie de l’arbre canalaire chez la souris^40,41 ou d’autres modèles animaux¹⁸ qui peuvent fournir une résolution comparable à TaO_x. Pertinent pour la traduction clinique est le fait que l’effet gélifiant de la CE dans ces modèles de rats de taille intermédiaire est un raffinement de formulation permettant de minimiser les dommages tissulaires collatéraux. Au fur et à mesure que nous continuerons d’évaluer cette procédure d’identification ablative pour sa capacité à prévenir la BC, nous serons en mesure de déterminer, plus précisément, à partir de quelles glandes BC se développe grâce aux informations supplémentaires fournies par imagerie après l’administration de l’ID dans des modèles de BC induits chimiquement et d’autres rats de BC. Ces données détermineront l’innocuité de cette procédure et mettront en évidence toute préoccupation ou lacune quant à savoir si les arbres canalaires traités partiellement ou sans succès pourraient être plus susceptibles de développer une BC chez une femme à risque élevé.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
AnalyzeDirect  v12.0	Caliper	n/a	For micro-CT image processing
Carprieve, Carprofen 50 mg/mL	Allivet	50647	For anti-inflammatory treatment
Ethyl cellulose	Acros Organics	9004-57-3	For intraductal injection
Evans blue	Sigma	E2129-50G	For injection visualization
Hot water bath	Toolots	Yidu_HH-S2	For preparing carprofen cups
MediGel Sucralose Cups	ClearH2O	74-02-5022	For delivery of carprofen
Model 1750 TTL, PTFE Luer Lock Syringe, 500μL	Hamilton	81220	For intraductal injection
Photoshop 2021	Adobe	n/a	For image processing
Quantum GX2 microCT Imaging System	Perkin Elmer	CLS149276	For micro-CT image acquisition
Metal Hub Needle, 33 gauge, custom (30° bevel angle, 0.4 in, point style 4)	Hamilton	7747-01	For intraductal injection
Stereo Microscope SZM Series	AmScope	SM-4TPZ-144	For intraductal injection
Sterile blue food dye	McCormick	930641	For injection visualization
Sterile phosphate buffered saline (PBS)	ThermoFisher	14190250	For solution preparation
Stickers	DOT Scientific	DOTSCI-C50	For preparing carprofen cups
Sucrose	Calbiochem	8550-5KG	For intraductal injection
Syringes	Fisher	14-826-79	For preparing carprofen cups
Vortex	VWR	10153-834	For preparing carprofen cups
Warming pump/pad(s)	Braintree Scientific	HTP-1500 120V; AP-R 26E	For intraductal injection/preoperative preparation