Visualizzazione a raggi X del trattamento ablativo intraduttale a base di etanolo per la prevenzione del cancro al seno in modelli di ratto

Riepilogo

Viene descritta una procedura per la consegna di una soluzione ablativa chimica all'albero duttale mammario del ratto per il trattamento preventivo guidato da immagini del cancro al seno. Le cellule epiteliali mammarie possono essere mirate con danni tissutali collaterali minimi attraverso l'incannulamento direttamente nell'apertura del capezzolo e l'infusione intraduttale di una soluzione ablativa a base di etanolo al 70%.

Abstract

Ci sono ancora un numero limitato di interventi primari per la prevenzione del cancro al seno. Per le donne ad alto rischio di sviluppare il cancro al seno, l'intervento più efficace è la mastectomia profilattica. Questa è una procedura chirurgica drastica in cui le cellule epiteliali mammarie che possono dare origine al cancro al seno vengono completamente rimosse insieme al tessuto circostante. L'obiettivo di questo protocollo è dimostrare la fattibilità di una procedura intraduttale minimamente invasiva che potrebbe diventare un nuovo intervento primario per la prevenzione del cancro al seno. Questa procedura locale ablerebbe preferenzialmente le cellule epiteliali mammarie prima che possano diventare maligne. Metodi intraduttali per fornire soluzioni direttamente a queste cellule epiteliali in modelli di roditori di cancro al seno sono stati sviluppati presso la Michigan State University e altrove. La ghiandola mammaria del ratto è costituita da un singolo albero duttale che ha un'architettura più semplice e lineare rispetto al seno umano. Tuttavia, i modelli di ratto indotti chimicamente di cancro al seno offrono strumenti preziosi per studi proof-of-concept di nuovi interventi preventivi e scalabilità dai modelli murini agli esseri umani. Qui viene descritta una procedura per la somministrazione intraduttale di una soluzione ablativa a base di etanolo contenente nanoparticelle di ossido di tantalio come agente di contrasto a raggi X e cellulosa etilica come agente gelificante nell'albero duttale mammario del ratto. La somministrazione di reagenti acquosi (ad es. composti citotossici, siRNA, AdCre) mediante iniezione intraduttale è stata descritta in precedenza in modelli murini e di ratto. Questa descrizione del protocollo enfatizza i cambiamenti metodologici e le fasi che riguardano unicamente la fornitura di una soluzione ablativa, la considerazione della formulazione per ridurre al minimo gli effetti collaterali locali e sistemici della soluzione ablativa e l'imaging a raggi X per la valutazione in vivo del riempimento dell'albero duttale. Le tecniche di fluoroscopia e micro-CT consentono di determinare il successo della somministrazione della soluzione ablativa e l'entità del riempimento duttale dell'albero grazie alla compatibilità con il mezzo di contrasto contenente tantalio.

Introduzione

Per le donne negli Stati Uniti¹, il cancro al seno (BC) continua ad essere il tipo di cancro più diagnosticato e causa più morti di qualsiasi altro tipo di cancro tranne il cancro del polmone. Le proiezioni per il 2022 stimano che 51.400 donne saranno diagnosticate con carcinoma in situ e 287.850 donne saranno diagnosticate con carcinoma invasivo e che 43.600 donne moriranno di BC¹. Nonostante la prevalenza e la mortalità associate alla BC, ci sono poche opzioni disponibili per la prevenzione primaria e la ricerca traslazionale su nuovi interventi poiché la prevenzione primaria non è prioritaria dalle agenzie federali². La mastectomia profilattica è l'intervento più efficace per la prevenzione primaria. Tuttavia, questa procedura è raccomandata solo per gli individui ad alto rischio perché è un intervento chirurgico importante con conseguenze che cambiano la vita³. Questo intervento comporta la rimozione completa delle cellule epiteliali mammarie da cui si sviluppa la carcinogenesi e del normale tessuto circostante. Gli individui sono spesso dissuasi dall'utilizzare questa procedura come prima opzione di intervento primario a causa dell'impatto negativo dello stress fisico, psicologico e sociale. Per questi motivi, anche alcuni individui ad alto rischio scelgono di non sottoporsi a questa procedura e scelgono invece l'attesa vigile o strategie di sorveglianza simili³. In una precedente pubblicazione, la somministrazione del 70% di etanolo (EtOH) direttamente nell'albero duttale dei modelli murini è stata efficace nell'ablazione chimica delle cellule epiteliali mammarie con danni limitati al tessuto normale adiacente e nel prevenire la formazione di tumori al seno⁴. EtOH è utilizzato in molteplici applicazioni cliniche come agente ablativo per il trattamento locale di alcuni tumori o agente sclerosante per il trattamento locale di gonfiore artero-venoso e malformazioni 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 . La bassa tossicità e il profilo di sicurezza dell'EtOH sono ben consolidati, poiché in alcune procedure possono essere somministrati fino a 50 ml di EtOH al 95% per sessione ^5,10.

La rimozione completa delle cellule epiteliali mammarie da cui si sviluppa BC è la componente più cruciale sia della mastectomia profilattica che della somministrazione locale di una soluzione ablativa. Pertanto, la conferma del completo riempimento duttale dell'albero è necessaria per garantire che la soluzione ablativa sia entrata in contatto diretto con tutte le cellule epiteliali mammarie. La fornitura di una soluzione all'interno dell'albero duttale (o degli alberi) e la sua visualizzazione mediante fluoroscopia o duttografia guidata da immagini sono possibili attraverso procedure cliniche già esistenti^15,16,17. Pertanto, sarà possibile implementare e valutare prontamente questa procedura negli studi clinici. Un passo fondamentale per stabilire l'efficacia e la fattibilità traslazionale dell'ablazione intraduttale (ID) come nuovo intervento per la prevenzione primaria sarà quello di dimostrare la fattibilità di questo approccio di visualizzazione a raggi X in modelli animali di dimensioni e complessità crescenti della loro architettura ad albero duttale 4,18,19. Un protocollo che scala questa procedura ablativa dal topo²⁰ ai modelli di ratto è descritto qui. Mentre gli alberi duttali di topo e ratto hanno una struttura lineare e un modello di ramificazione simili, l'albero duttale del ratto è proporzionalmente più grande ed è circondato da uno stroma molto più denso. Abbiamo implementato un metodo in laboratorio per iniettare con successo ogni ghiandola mammaria in un ratto in una serie di sessioni settimanali con una soluzione ablativa contenente un mezzo di contrasto. La distanza tra le sessioni è necessaria per garantire che gli animali abbiano effetti collaterali minimi di EtOH (Figura 1 e Figura 2). La procedura prevede l'iniezione della soluzione ablativa direttamente nell'apertura del capezzolo di un ratto anestetizzato con isoflurano con un ago da 33 G. Alcuni miglioramenti chiave della procedura includono l'uso di un trattamento antinfiammatorio esteso, l'iniezione di volumi più elevati per albero duttale rispetto a²¹ suggerito e siringhe a tenuta di gas per liquidi e gas. La durata del trattamento con 5 mg/kg di carprofen (un FANS) da 48 ore prima a 1 settimana dopo le iniezioni di ID è paragonabile al protocollo antinfiammatorio utilizzato per la terapia sclerosante della malformazione venosa in clinica. Il trattamento viene eseguito su pazienti in anestesia sistemica seguiti da 2 giorni di farmaci antinfiammatori come i FANS. Il trattamento antinfiammatorio può essere prolungato per qualche giorno in più per ridurre l'infiammazione locale e qualsiasi potenziale dolore¹³. Come nei topi²⁰, l'iniezione intraperitoneale di una soluzione di saccarosio al 5% mitiga l'effetto a breve termine dell'intossicazione da alcol nei ratti. I ratti possono essere iniettati con fino a 1 ml di EtOH al 70% (fino a 4 condotti; 0,2 g/dL di contenuto di EtOH nel sangue) in una singola sessione quando somministrati con questa soluzione di saccarosio; gli animali si riprendono completamente entro 4 ore dopo le iniezioni di ID. Eseguiamo sessioni sequenziali per consentire un tempo di recupero sufficiente quando si iniettano più di 4 ghiandole e / o concentrazioni più elevate di EtOH. L'intossicazione da alcol nelle donne sarà molto meno probabile poiché l'iniezione ID di tutti gli alberi duttali in entrambi i seni, assumendo 16 condotti principali^16,17 e 2 ml per condotto^22,23, con il 70% di EtOH comporterebbe meno di ^0,1 g / dL di contenuto di EtOH nel sangue e potrebbe causare lieve compromissione.

L'imaging a raggi X consente di determinare il successo della consegna intraduttale in ogni singola ghiandola e se l'intero albero duttale è riempito (Figura 1, Figura 2, Figura 3). L'imaging fluoroscopico in tempo reale in preparazione per la scansione micro-CT e / o la ricostruzione 3D dei dati del file DICOM può essere utilizzato per valutare l'entità della consegna della soluzione nell'albero duttale e qualsiasi perdita nello stroma. L'uso della fluoroscopia può aiutare a limitare la dose complessiva di radiazioni imposta all'animale. La tecnica di fluoroscopia si avvicina più strettamente all'applicazione clinica prevista per la guida dell'immagine di questo trattamento ablativo. Il confronto tra Isovue contenente iodio approvato dalla FDA e nanoparticelle di ossido di tantalio (TaO_x) è stato eseguito al fine di perfezionare ulteriormente l'utilità della soluzione ablativa ^4,19. È stato trovato che TaO_x è un mezzo di contrasto micro-CT superiore a Isovue per la visualizzazione del riempimento iniziale dell'albero duttale nei topi ^4,19. Qui, dimostriamo che TaOx è un agente di contrasto adatto per visualizzare il riempimento iniziale dell'albero duttale del ratto (Figura 2 e Figura 3). Sia nella ricerca traslazionale che nelle applicazioni di pratica clinica, l'agente gelificante etilcellulosa (EC) è stato aggiunto alla soluzione EtOH per ridurre al minimo la diffusione dalle regioni target previste 13,14,24,25,26,27,28,29. Gli studi hanno dimostrato che l'aggiunta fino all'1,5% di EC a soluzioni ablative contenenti EtOH è compatibile con l'imaging basato su TaO_x (Figura 3). Questi e ulteriori perfezionamenti alla soluzione ablativa possono aiutare nella pronta traduzione di questa procedura guidata da immagini alla clinica.

Protocollo

Tutti gli esperimenti descritti sono stati condotti secondo protocolli approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Michigan State University.

1. Trattamento antinfiammatorio prolungato

1. Preparare tazze di gel di sucralosio come dosaggio orale di carprofene. Fornire ai ratti questo trattamento antinfiammatorio da 2 giorni prima di ricevere l'iniezione ID del 70% di EtOH a 7 giorni dopo la procedura.
2. Diluire una soluzione di lavoro di carprofen in PBS sterile per iniezione nella tazza. A partire da 50 mg/mL di soluzione madre, preparare una soluzione diluita da 2 mg/mL colorata con colorante alimentare blu sterile all'1% v/v e iniettare 500 μL in ciascuna tazza. L'aggiunta del colorante aiuta nella visualizzazione della miscelazione completa del farmaco all'interno del sucralosio della tazza.
3. Seguire le raccomandazioni del produttore per preparare la tazza per l'aggiunta di carprofene. Salvo diversa indicazione del venditore, riscaldare la tazza a bagnomaria a 60 °C per 15 minuti e asciugare dopo la rimozione per ridurre il rischio di contaminazione.
   1. Pulire il coperchio della tazza di sucralosio con il 70% di EtOH nella zona e introdurre l'ago della siringa contenente la soluzione di lavoro di carprofene. Erogare il volume appropriato (500 μL).
   2. Coprire la foratura con un adesivo. Agitare energicamente la tazza per 15 s, quindi posizionare quella tazza in un vortice per altri 15 s. Valutare visivamente la miscelazione omogenea e completa prima di conservarla per un uso successivo. Cerca la presenza di un colore blu scuro.
      NOTA: Lasciare che le tazze raggiungano la temperatura ambiente. Conservare le tazze a temperatura ambiente, se lo si desidera, ma prestare attenzione alle indicazioni sull'efficacia del farmaco da parte del produttore. In alternativa, conservare le tazze a 4 °C e utilizzarle entro un mese. Datare l'adesivo è una buona pratica per tenere traccia della data di iniezione senza il rischio che una penna o un pennarello affilato forino il coperchio.
4. Appena prima dell'uso, pulire l'esterno della tazza con il 70% di EtOH. Rimuovere il coperchio prima di posizionare la tazza nella gabbia degli animali. Sostituire le tazze a giorni alterni o quando sono vuote. Controllare il livello di gel ogni giorno per garantire un dosaggio adeguato. Una tazza può fornire carprofen per un massimo di due ratti per un massimo di 2 giorni; Tuttavia, i ratti possono consumare l'intera tazza prima.

2. Preparazione preoperatoria

NOTA: Assicurarsi che la fase di preparazione dell'animale precede la procedura di iniezione ID di 2-3 giorni.

1. Accendere il vaporizzatore di isoflurano (2%-3% di isoflurano, 1,5 L/min di ossigeno) per anestetizzare il ratto. Sposta l'animale su un cono nasale su un pad riscaldante. Applicare il lubrificante per gli occhi al ratto, quindi posizionare l'animale sulla schiena. Monitorare attentamente la respirazione dell'animale per assicurarsi che il piano anestetico sia mantenuto all'1% -3% di isoflurano.
   NOTA: Un rasoio elettrico può essere utilizzato per rimuovere la pelliccia in eccesso prima della depilazione. Bisogna fare estrema attenzione a non danneggiare i capezzoli con il rasoio. Per questo motivo, questo passaggio può essere saltato. I ratti sono più sensibili alla crema depilatoria rispetto ai topi, quindi la rimozione della crema in eccesso è molto importante. Evitare di iniettare una soluzione contenente etanolo in un'area che ha già un'abrasione presente dalla depilazione. Alcune creme hanno aggiunto composti come aloe e lanolina che possono aiutare a ridurre al minimo la probabilità di abrasioni.
2. Utilizzare un applicatore a punta di cotone per distribuire la crema depilatoria da banco sulla zona del capezzolo. Utilizzare l'applicatore per strofinare la crema nell'area per 10-30 secondi. Controlla se la pelliccia si è allentata rapidamente.
   1. Lasciare la crema sul ratto per l'intervallo più breve possibile e rimuovere completamente per evitare di bruciare la pelle. I ratti sono ancora più sensibili a questa procedura rispetto ai topi.
3. Dopo 10-30 s di applicazione, bagnare una garza con acqua tiepida e usarla per sciacquare la crema e la pelliccia allentata dall'animale. Eseguire almeno tre risciacqui dell'area con una garza fresca inumidita e asciugare con una garza asciutta dopo il risciacquo finale. Confermare una buona visibilità e l'accesso all'area del capezzolo da cui viene rimossa la pelliccia. Ripetere la procedura depilatoria se necessario.
4. Metti il topo in una gabbia pulita su una piastra elettrica e lascialo recuperare. Controlla il ratto per assicurarti che sia completamente recuperato dall'anestesia prima di riportarlo nella sua gabbia permanente.
5. Mettere una tazza di gel di sucralosio dosata con carprofene (1 mg / tazza) nella gabbia per il trattamento anti-infiammatorio. Controllare il consumo di gel ogni giorno e sostituirlo con una tazza fresca a seconda dei casi. Non lasciare la tazza per più di 2 giorni. In genere, le tazze dovranno essere sostituite dopo 1 giorno.

3. Iniezione intraduttale

1. Preparare la soluzione madre di TaO_x a 333,3 mM come descritto¹⁹ utilizzando soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS). Riscaldare la soluzione se la polvere non si dissolve completamente. Mescolare delicatamente. Non vortice o agitare vigorosamente per evitare la formazione di bolle.
2. Mescolare tre parti di 333,3 mM TaO x con sette parti di 100% EtOH per una soluzione finale al 70% di EtOH 100 mM/TaO_x. Facoltativamente, aggiungere una quantità appropriata di 0,5% -1,5% di etilcellulosa (EC) come agente gelificante per massimizzare la ritenzione locale della soluzione ablativa. Aggiungere colorante alimentare blu all'1% v/v alla soluzione ablativa per l'esame visivo della consegna nell'albero duttale durante l'infusione.
3. Preparare un volume adeguato alle esigenze sperimentali. Le coppie ghiandolari 1 (cervicale) e 6 (inguinale) possono essere riempite con un massimo di 100 μL della soluzione, mentre tutte le altre coppie possono essere riempite con un massimo di 300 μL.
4. Anestetizzare il ratto come al punto 2.1 e spostare il ratto sul cono del naso una volta completamente anestetizzato. Applicare il lubrificante per gli occhi su entrambi gli occhi e quindi posizionare l'animale sulla schiena. Fissare il topo sotto lo stereoscopio usando del nastro adesivo vicino ai capezzoli che verranno iniettati, se lo si desidera. Il peso del ratto è generalmente sufficiente per impedirgli di muoversi sostanzialmente senza picchiettare.
5. Per preparare i capezzoli per l'iniezione, rimuovere qualsiasi pelle morta che copre l'apertura del capezzolo con una pinza appuntita fine, se possibile. I ratti hanno spesso un tappo che sporge dall'apertura del capezzolo che può impedire il successo dell'incannulamento del capezzolo se non rimosso.
   NOTA: È importante notare che maggiori volumi di iniezione di soluzioni ablative utilizzate nei ratti possono avere maggiori probabilità di provocare ferite cutanee superficiali vicino al sito o ai siti di iniezione. Per questo motivo, iniettare ogni altro capezzolo in una singola sessione è meno dannoso e irritante per l'animale rispetto all'iniezione di capezzoli adiacenti. Il monitoraggio dei ratti per eventuali abrasioni per 7 giorni dopo l'iniezione aiuta a garantire che non ci siano gravi effetti sulla salute derivanti dal graffio dell'animale e introduce la possibilità di infezione da contaminazione con detriti del pavimento della gabbia. Un triplo unguento antibiotico o lavaggi con soluzione di clorexidina può essere usato per trattare eventuali segni di infezione da lesioni che possono verificarsi (Tabella 1).
6. Utilizzare una siringa da 500 μL con un ago da 33 G per aspirare 101-301 μL di soluzione ablativa. Aspirare un ulteriore 1 μL della soluzione per possibili perdite minori durante la rimozione dell'ago inannulato.
   NOTA: Queste sono raccomandazioni per volumi volti a riempire completamente l'albero o gli alberi duttali: fino a 100 μL nelle ghiandole cervicali e inguinali e fino a 300 μL nelle altre ghiandole. Per altre applicazioni, può essere opportuno utilizzare volumi più piccoli o più grandi.
7. Utilizzare una pinzetta per tenere delicatamente il capezzolo e cannulare l'ago nell'apertura del capezzolo. Continuare delicatamente a inserire l'ago fino a quando la smussatura è completamente all'interno del capezzolo. Per accogliere l'ago nel capezzolo, portare il capezzolo verso l'ago invece di spingere l'ago verso il basso nel capezzolo. (Tabella 1). Fare attenzione a seguire il percorso dell'apertura del capezzolo.
   NOTA: i capezzoli di ratto sono generalmente molto più facili da manipolare e cannulare con successo rispetto a quelli dei topi a causa delle dimensioni maggiori. Tuttavia, l'aumento della quantità di grasso che circonda l'apertura del capezzolo rende anche più probabile iniettare erroneamente il cuscinetto di grasso se l'ago devia dal condotto principale.
8. Una volta che la smussatura dell'ago è completamente inserita, infondere lentamente la soluzione ad una velocità costante di circa 100 μL/min nei ratti. Bruschi cambiamenti nella velocità di infusione possono scoppiare o danneggiare l'albero duttale. Attendere 30 secondi dopo la fine dell'infusione prima di rimuovere l'ago dall'albero cannulato con assistenza con una pinza; ciò garantisce che il volume iniettato rimanga all'interno dell'albero duttale (Figura 2) e riduce la probabilità di perdite.
9. Pulire qualsiasi soluzione versata con una garza inumidita o una salvietta EtOH per evitare soluzioni di contrasto estranee nelle immagini.
10. Iniettare PBS contenente il 5% di saccarosio (10 ml/kg) per via intraperitoneale per mitigare gli effetti dell'intossicazione da alcol se l'etanolo è contenuto nelle soluzioni di iniezione ID. Questa dose può essere somministrata all'inizio e alla fine della procedura.

4. Imaging micro-CT

1. Dopo che tutte le ghiandole desiderate sono state iniettate, spostare rapidamente l'animale sul sistema micro-CT e continuare a mantenere l'anestesia utilizzando il vaporizzatore isoflurano incorporato.
2. Raddrizzare la colonna vertebrale dell'animale e fissare ogni zampa posteriore in una posizione estesa, in modo che le ossa delle gambe dell'animale siano più lontane dalle ghiandole inferiori di interesse e non si sovrappongano alla regione di interesse nell'immagine scansionata.
3. Nastro adesivo attraverso l'addome per ridurre al minimo gli artefatti respiratori durante la scansione delle ghiandole inferiori.
   NOTA: Gli animali possono essere ripresi con diversi parametri di scansione (ad esempio, alta risoluzione, scansioni longitudinali) se si presta attenzione a determinare un'appropriata dose accettabile di radiazioni per tutta la vita per i ratti e assicurando che la dose cumulativa non superi questo livello. L'esposizione alle radiazioni può essere ulteriormente ridotta acquisendo fotogrammi e video in fluoroscopia senza eseguire scansioni (Figura 2).
4. Eseguire l'imaging TaO_x dell'albero duttale del ratto con una buona risoluzione e possibilità di ripetere scansioni di acquisizione standard (2 min) utilizzando i seguenti parametri di scansione: 90 kVp/88 μA; campo visivo (FOV), 72 mm; numero di fette, 512; spessore della fetta, 72 μm; Risoluzione voxel, 72 μm³. Scansioni ad alta risoluzione per periodi di tempo più lunghi (4-14 min) possono essere acquisite anche in animali che non verranno scansionati longitudinalmente utilizzando gli stessi parametri.
5. Dopo l'acquisizione dei dati, allontanare con cautela il ratto dal cono di anestesia e metterlo in una nuova gabbia pulita su una piastra riscaldante. Controlla il ratto per assicurarti che si sia completamente ripreso dall'anestesia prima di riportarlo nella sua gabbia permanente. Posizionare la tazza di sucralosio contenente carprofene e sostituirla in modo appropriato come descritto al punto 2.5 per garantire che gli animali continuino a ricevere il trattamento antinfiammatorio per i prossimi 7 giorni.
6. Elabora le immagini acquisite in rendering rapidi all'interno del software micro-CT per apprezzare meglio eventuali perdite di contrasto, riempimento solo parziale o riempimento eccessivo (Figura 2).
7. Passare alla sezione successiva per eseguire l'elaborazione formale delle immagini per la pubblicazione o l'analisi dettagliata delle scansioni, se lo si desidera (Figura 3).

5. Analisi delle immagini

1. Utilizzare pacchetti software specializzati per produrre rendering dell'albero duttale riempito.
   NOTA: È meglio segmentare il cuscinetto di grasso mammario per ottenere la migliore resa dell'albero duttale iniettato. Spline traccia i confini scuri del cuscinetto grasso per tutto lo spessore dell'animale per ottenere questa segmentazione.
2. Per segmentare il cuscinetto adiposo (a differenza dei topi, i confini di questo compartimento non sono così facilmente distinguibili dalla cavità peritoneale, dai muscoli femorali e dalla pelle a causa di unità Hounsfield simili) all'interno del quale è contenuto l'albero duttale di interesse, selezionare l'opzione "traccia spline" dal menu manuale è il primo passo nella creazione di un rendering.
3. Spline traccia il contorno del cuscinetto grasso in ogni terza fetta. Fare clic sull'opzione Propaga oggetti dal menu semiautomatico. Questo si propagherà e collegherà tutte le fette in un unico oggetto segmentato di interesse.
   NOTA: la modifica della soglia all'interno della regione segmentata consente la visualizzazione del segnale solo entro un certo intervallo di unità Hounsfield (HU); Per altri agenti di contrasto o parametri di imaging, potrebbe essere necessario regolare questo intervallo. Un pacchetto software o un'analisi di intelligenza artificiale possono essere utilizzati per effettuare altre misurazioni e immagini per mostrare quanto è stato riempito l'albero duttale.
4. Impostare i valori HU su un punto basso di 300 e un punto massimo di 3.000 nel menu semiautomatico nella scheda del volume di soglia. Ciò consente la creazione di una rappresentazione che visualizza solo il contrasto (TaO_x) all'interno dell'albero duttale.
5. Imposta il rendering come principale utilizzando il pulsante "visualizza". Questo cambierà la visualizzazione per mostrare solo la rappresentazione 3D dell'albero duttale.
   NOTA: eseguire la ricostruzione dell'albero duttale per ulteriori analisi.

Risultati

Ognuna delle 12 ghiandole mammarie di un ratto femmina contiene un singolo albero duttale che si apre all'orifizio del capezzolo. Nonostante le differenze di dimensioni tra il topo e il ratto, i tempi di sviluppo delle ghiandole mammarie e il tempo in cui questi animali raggiungono l'età adulta sono molto simili^30,31. Viene fornita una breve descrizione delle fasi chiave dello sviluppo della ghiandola mammaria nei ratti come rappresentativo di entrambe le specie di roditori. Le gemme terminali terminali (TEB) sono le strutture altamente proliferative sulle punte dell'albero duttale allungato che dirigono la ramificazione duttale^30,31. Il picco di proliferazione e densità dei TEB si verifica a 3-4 settimane di età durante la fase di allungamento dell'albero duttale nello sviluppo puberale³⁰. A 9-10 settimane di età, ci sono pochi TEB rimanenti poiché l'albero duttale è cresciuto fino a occupare l'intera lunghezza del cuscinetto adiposo³⁰. Dopo di ciò, la crescita e l'espansione dell'albero duttale è proporzionale a quella del cuscinetto grasso e dell'animale³². Le unità lobulari duttali terminali (TDLU) nel seno umano svolgono un ruolo simile ai TEB nei roditori. Le TDLU sono la principale fonte per l'inizio della carcinogenesi e la progressione a BC^33,34. Possiamo iniettare fino a 300 μL di soluzione di EtOH al 70% per riempire l'intero albero duttale delle ghiandole mammarie toraciche e addominali del ratto Sprague-Dawley di 9 settimane (Figura 1, Figura 2, Figura 3). A differenza dei topi 20, i capezzoli delle ghiandole cervicale e inguinale dei ratti Sprague-Dawley sono tipicamente adatti per l'iniezione in oltre l'80% degli animali e sono necessari fino a 100 μL di soluzione di EtOH al⁷⁰% per riempire l'intero albero duttale (Figura 2). Iniettiamo regolarmente fino a 10 ghiandole mammarie con la soluzione ablativa in studio. Un tipico disegno sperimentale consiste in due sessioni di iniezione ID settimanali indipendenti, in cui cinque ghiandole alternate vengono infuse con la soluzione ablativa contenente mezzo di contrasto a raggi X e / o EC come agente gelificante (Figura 2). Per la soluzione ablativa contenente TaO_x (50-200 mM), la fluoroscopia e/o la micro-TC vengono eseguite dopo la fine di ogni sessione per determinare e registrare il successo individuale dell'infusione di ciascun albero duttale con quantità parziale o totale di soluzione infusa (Figura 2). L'imaging immediato e longitudinale dopo l'iniezione consente di valutare come i cambiamenti nella formulazione, in particolare la concentrazione dell'agente gelificante CE, influenzano e limitano la diffusione verso l'esterno della soluzione ablativa in funzione del volume iniettato (Figura 3). Questa analisi di imaging fornisce informazioni per comprendere i parametri ottimali per ottenere la massima ablazione con il minimo danno tissutale collaterale.

Figura 1: Schemi della procedura per l'iniezione intraduttale e analisi delle immagini nei ratti. Viene evidenziata la procedura passo-passo per l'iniezione intraduttale e l'analisi delle immagini. Si prega di vedere il video per maggiori dettagli. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Esempi di incannulamento del capezzolo e risultato della consegna della soluzione ablativa in più ghiandole mammarie . (A) Presentazione tipica delle forme dei capezzoli nel ceppo di ratto Sprague-Dawley. La lunghezza del capezzolo è correlata alla probabilità di successo dell'incannulamento. I capezzoli più lunghi sono più facili da cannulare rispetto ai capezzoli corti, mentre i capezzoli eccessivamente corti o vestigiali non possono essere incannulati. Una volta incannulati, sia i capezzoli lunghi che quelli corti possono essere infusi con la soluzione e ottenere tassi di successo simili di consegna. Il colorante alimentare blu nella soluzione iniettata può essere utilizzato come prova in vivo del riempimento dell'albero duttale e del successo della consegna (più evidente, formazione a cupola, per un'iniezione di tampone di grasso non riuscita). La fluoroscopia in tempo reale (B) e le rappresentazioni micro-CT 3D generate dopo l'acquisizione dell'immagine (C) forniscono prove in vivo del successo della consegna e una valutazione più quantitativa della soluzione che raggiunge i TEB. (B) Ogni ghiandola mammaria addominale della prima coppia (# 4, # 10) ha ricevuto una soluzione ablativa con 1% EC (contorno arancione) o senza di essa (contorno verde) (C) Consegna riuscita (contorno blu) della soluzione ablativa nella ghiandola cervicale destra (# 7), secondo paio di ghiandole mammarie toraciche (# 3, # 9) e primo paio di ghiandole mammarie addominali (# 4, # 10) e iniezione infruttuosa (contorno bianco tratteggiato) nella ghiandola toracica sinistra . Le barre della scala corrispondono a 1 mm nelle immagini a diversi ingrandimenti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Ricostruzione 3D e valutazione del riempimento e della diffusione della soluzione ablativa . Il 70% di nanoparticelle di EtOH/100 mM TaO_x con l'1% di EC (in alto) o senza EC (in basso) sono state iniettate intraduttalmente nella seconda coppia di ghiandole mammarie addominali (#4 e #10) e immediatamente riprese mediante micro-CT. Ogni ratto Sprague-Dawley ha ricevuto un volume crescente di entrambe le soluzioni. I singoli alberi duttali sono stati ricostruiti utilizzando un pacchetto software di analisi delle immagini (traccia spline + propaga oggetto + resa soglia). Con l'1% EC, la soluzione può essere vista raggiungere le estremità terminali. All'aumentare del volume erogato, il numero di TEB riempiti è più evidente. La barra della scala corrisponde a 10 mm in tutte le rappresentazioni. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Questione	Apparenza	Soluzione
Capezzolo corto (Fig. 2)	Il capezzolo ha un profilo basso - difficile da afferrare	A volte è più facile tenere la pelle vicino al capezzolo e colpire il centro del capezzolo con l'ago. L'ago probabilmente si immergerà sotto la pelle. Tirare lentamente verso l'alto può rivelare che il capezzolo è leggermente sopra la punta dell'ago e dare spazio per afferrarlo e tirarlo per il resto della strada sull'ago. Fai molta attenzione quando ti immergi sotto la pelle sull'angolo dell'ago. È facile ottenere inavvertitamente un'iniezione di cuscinetto di grasso pugnalando con l'angolazione sbagliata.
Iniezione di tamponi di grasso (Fig. 2)	Gonfiore intorno al capezzolo e possibilmente nel capezzolo stesso - più facile vedere se il colore viene aggiunto alla soluzione di iniezione	Se il capezzolo si gonfia con i primi ul iniettati, rimuovere l'ago e tentare di inserirlo di nuovo con maggiore attenzione all'angolo. Iniziare nuovamente l'iniezione e osservare l'ulteriore gonfiore. Se il gonfiore continua, abbandonare il tentativo. È molto raro iniettare con successo un capezzolo che è iniziato come iniezione di cuscinetto di grasso.
Ferite/croste	Ferita aperta o crosta vicino al sito di iniezione della soluzione di EtOH	I ratti hanno maggiori probabilità rispetto ai topi di sviluppare ferite o croste vicino all'area di iniezione. Se vengono trovate ferite, applicare un triplo unguento antibiotico alle ferite aperte, ma lasciare solo le ferite croste. L'applicazione di unguento alle croste può aumentare la probabilità che l'animale dia fastidio alla crosta e la rimuova. Controllare ogni 1-2 giorni fino a guarigione a seconda della gravità della ferita. Il carprofene deve essere somministrato fino alla guarigione anche se oltre la finestra normale.
Iniettare ghiandole alternate	N/D	Maggiori volumi di iniezione nei ratti rendono più probabile causare abrasioni cutanee se si iniettano ghiandole consecutive. Per la minima probabilità di trauma nell'area di iniezione, ghiandole alternate iniettate all'interno di una singola sessione (cioè iniettare #1, 3, 4 e 6 piuttosto che #1-4). La spaziatura tra la terza (#3 e #9) e la quarta (#4 e #10) coppia di ghiandole consente l'iniezione di entrambe queste ghiandole in una sessione.

Tabella 1: Suggerimenti utili e risoluzione dei problemi

Discussione

Come mostrato qui, la somministrazione di ID del 70% di EtOH abla preferenzialmente le cellule epiteliali mammarie con danni collaterali limitati allo stroma e alla vascolarizzazione circostanti nei topi⁴. L'ablazione locale dell'albero duttale è efficace nel prevenire la formazione di tumori nei modelli murini⁴. Qui, dimostriamo che questa procedura ablativa può essere scalata fino ai ratti.

Questo è il prossimo passo nel percorso verso la traduzione di questa procedura ablativa come intervento alternativo alla mastectomia profilattica per la prevenzione primaria del cancro al seno in individui ad alto rischio. L'aggiunta di nanoparticelle di TaO_x come mezzo di contrasto a raggi X alla soluzione ablativa consente di valutare l'efficacia della soluzione nel prevenire la formazione del tumore, in quanto è possibile determinare se la procedura ha avuto successo o meno nel riempire completamente l'albero duttale. L'uso della fluoroscopia per visualizzare la ghiandola mammaria iniettata rispecchia ciò che probabilmente verrà fatto in clinica per guidare questa procedura ID. La guida dell'immagine di quanto la soluzione ha riempito l'albero duttale e quando interrompere l'infusione sarà un aspetto chiave dell'implementazione clinica per garantire il massimo riempimento di ciascun albero duttale. Le procedure di risoluzione dei problemi e i suggerimenti utili sono elencati nella tabella 1. L'efficacia di questa procedura ablativa richiede che la soluzione infusa entri in contatto diretto con tutte le cellule epiteliali per massimizzare il tasso di uccisione cellulare. Le cellule epiteliali di riserva all'interno di uno o più alberi potrebbero eventualmente servire come fonte per lo sviluppo di BC. Gli altri gruppi hanno riportato la consegna ID di particelle virali (ad esempio, componenti dei sistemi Cre / LoxP e / o Cas9 / CRISPR), ormoni e antagonisti ormonali (ad esempio, prolattina, fulvestrant), agenti chemioterapici (ad esempio, cisplatino), siRNA e / o anticorpi o altri agenti bersaglio nei topi 4,19,21,35,36,37,38,39,40^, 41,42,43,44,45, ratti 21,33,46,47,48 e/o conigli ^{18,49,50,51,52,53} . L'incannulamento riuscito di un massimo di otto alberi duttali per seno umano per la somministrazione locale di chemioterapia è stato riportato in studi clinici indipendenti 47,54,55. La guida dell'immagine per l'infusione di queste altre soluzioni finalizzate alla prevenzione del tumore o orientate al trattamento locale massimizzerebbe allo stesso modo la loro efficacia.

La scalabilità e la raffinatezza di questa procedura dal topo all'albero duttale del ratto è dimostrata qui. La nanoparticella TaO_x nell'albero duttale murino ^4,19 e ratto (dati non pubblicati) fornisce immagini ad alta risoluzione che superano gli agenti di contrasto a raggi X contenenti iodio approvati dalla FDA. Allo stesso modo, non siamo a conoscenza di altri approcci di imaging dell'albero duttale nei topi^40,41 o in altri modelli animali¹⁸ che possono fornire una risoluzione comparabile a TaO_x. Rilevante per la traduzione clinica è il fatto che l'effetto gelificante della CE in questi modelli di ratto di dimensioni intermedie è un perfezionamento della formulazione che consente di ridurre al minimo il danno tissutale collaterale. Mentre continuiamo a valutare questa procedura di identificazione ablativa per la sua capacità di prevenire la BC, saremo in grado di determinare, più precisamente, da quale ghiandola BC si sviluppa attraverso le informazioni aggiuntive fornite dall'imaging dopo la consegna dell'ID in modelli di BC indotti chimicamente e in altri modelli di ratto. Questi dati determineranno la sicurezza di questa procedura e individueranno eventuali preoccupazioni o carenze sul fatto che gli alberi duttali trattati parzialmente o con successo possano essere più inclini a sviluppare BC in una donna ad alto rischio.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AnalyzeDirect  v12.0	Caliper	n/a	For micro-CT image processing
Carprieve, Carprofen 50 mg/mL	Allivet	50647	For anti-inflammatory treatment
Ethyl cellulose	Acros Organics	9004-57-3	For intraductal injection
Evans blue	Sigma	E2129-50G	For injection visualization
Hot water bath	Toolots	Yidu_HH-S2	For preparing carprofen cups
MediGel Sucralose Cups	ClearH2O	74-02-5022	For delivery of carprofen
Model 1750 TTL, PTFE Luer Lock Syringe, 500μL	Hamilton	81220	For intraductal injection
Photoshop 2021	Adobe	n/a	For image processing
Quantum GX2 microCT Imaging System	Perkin Elmer	CLS149276	For micro-CT image acquisition
Metal Hub Needle, 33 gauge, custom (30° bevel angle, 0.4 in, point style 4)	Hamilton	7747-01	For intraductal injection
Stereo Microscope SZM Series	AmScope	SM-4TPZ-144	For intraductal injection
Sterile blue food dye	McCormick	930641	For injection visualization
Sterile phosphate buffered saline (PBS)	ThermoFisher	14190250	For solution preparation
Stickers	DOT Scientific	DOTSCI-C50	For preparing carprofen cups
Sucrose	Calbiochem	8550-5KG	For intraductal injection
Syringes	Fisher	14-826-79	For preparing carprofen cups
Vortex	VWR	10153-834	For preparing carprofen cups
Warming pump/pad(s)	Braintree Scientific	HTP-1500 120V; AP-R 26E	For intraductal injection/preoperative preparation