La méthode de ponction thermoplasmonique intègre la microscopie confocale, la pince optique et les nanoparticules d’or pour étudier les réponses des protéines lors de la réparation de la membrane plasmique dans les cellules et les vésicules unilamellaires géantes. Cette technique permet une ponction membranaire rapide et localisée, permettant l’identification de protéines clés et de leurs rôles fonctionnels dans la machinerie complexe de réparation de la membrane plasmique.
La membrane cellulaire est cruciale pour la survie des cellules, et il est essentiel d’assurer son intégrité car la cellule subit des blessures tout au long de son cycle de vie. Pour éviter d’endommager la membrane, les cellules ont développé des mécanismes efficaces de réparation de la membrane plasmique. Ces mécanismes de réparation peuvent être étudiés en combinant la microscopie confocale et la thermoplasmonique à l’échelle nanométrique pour identifier et étudier le rôle de protéines clés, telles que les annexines, impliquées dans la réparation de surface dans les cellules vivantes et les systèmes modèles membranaires.
La méthode de ponction utilise un laser pour induire un échauffement très localisé lors de l’irradiation de nanoparticules. L’utilisation de la lumière proche infrarouge minimise la phototoxicité dans l’échantillon biologique, tandis que la majorité de l’absorption a lieu dans la nanoparticule plasmonique résonante proche infrarouge. Cette méthode thermoplasmonique a été exploitée pour des recherches photothermiques et biophysiques potentielles afin d’améliorer la compréhension des mécanismes intracellulaires et des réponses cellulaires grâce à des études de fusion de vésicules et de cellules. L’approche s’est avérée complémentaire aux méthodes existantes de rupture membranaire, telles que les lésions induites mécaniquement, chimiquement ou optiquement, et offre un haut niveau de contrôle en infligeant des blessures extrêmement localisées. L’étendue de la lésion est limitée au voisinage de la nanoparticule sphérique, et aucun dommage préjudiciable ne se produit le long du trajet du faisceau, contrairement aux lasers pulsés utilisant des longueurs d’onde différentes. Malgré certaines limitations, telles que la formation de nanobulles, la méthode thermoplasmonique offre un outil unique pour étudier les réponses cellulaires dans la réparation de la membrane plasmique dans un environnement presque natif sans compromettre la viabilité cellulaire.
Lorsqu’elle est intégrée à la microscopie confocale, la méthode de ponction peut fournir une compréhension mécaniste de la dynamique membranaire dans les systèmes membranaires modèles ainsi que des informations quantitatives sur les réponses des protéines aux dommages membranaires, y compris le recrutement des protéines et leur fonction biophysique. Dans l’ensemble, l’application de cette méthode à des systèmes modèles réduits peut améliorer notre compréhension de la machinerie complexe de réparation de la membrane plasmique dans les cellules vivantes.
La membrane cellulaire, qui sert à la fois de barrière physique et de plate-forme de signalisation, est vitale pour la survie des cellules1. Tout au long de son cycle cellulaire, la membrane plasmique (PM) est soumise à des dommages, tels que des lésions mécaniques 2,3,4,5 et chimiques6 induites par le stress. Pour maintenir l’intégrité de la membrane et assurer la survie de la cellule, celle-ci a développé des mécanismes robustes de réparation de la membrane plasmique (PMR). Ces mécanismes dépendent de diverses stratégies, telles que la réorganisation du cytosquelette, la fusion membranaire et les stratégies de remplacement membranaire 7,8,9,10,11, qui reposent toutes sur le recrutement de protéines spécifiques. Notamment, les membres de la famille des protéines annexines ont été identifiés comme des protéines clés associées aux processus de PMR 1,9,12,13,14,15,16. À la suite d’une lésion des particules, la cellule subit un afflux d’ions calcium (Ca2+), ce qui constitue une menace immédiate pour la survie de la cellule17. En réponse à l’afflux de Ca2+, les protéines de l’annexine, qui sont principalement situées dans le cytosol, se lient au feuillet interne de la membrane plasmique endommagée dans le cadre des stratégies PMR18. L’annexine A2 (ANXA2) a été l’un des premiers membres de la famille de l’annexine à être associée à la RPM dans la dystrophie musculaire déficiente en dysferline et il a été suggéré qu’elle intermédie la réparation en fusionnant des vésicules intracellulaires à la MP près du site de la lésion 5,19,20,21. Par la suite, plusieurs fonctions ont été attribuées aux annexines22, et leur rôle dans la RPM a suscité une attention accrue au cours des 20 dernières années. Cependant, le rôle exact des annexines dans la RPM n’est pas encore entièrement compris 15,18,21,22.
Cet article propose une méthode pour étudier l’interaction protéine-membrane et la dynamique membranaire de manière contrôlée et hautement localisée, en utilisant une combinaison de microscopie confocale, de pinces optiques et de nanoparticules d’or (AuNPs). Cette méthode permet l’étude quantitative des interactions entre les protéines, les lipides et les petites molécules en réponse aux dommages membranaires et à l’afflux de Ca2+ . Malgré la complexité et la multiplicité des composants impliqués dans le processus de réparation membranaire, des systèmes membranaires simplifiés qui imitent la membrane plasmique ont été utilisés pour acquérir une compréhension mécanistique plus approfondie de la dynamique membranaire et de la réponse des protéines annexines à la perturbation membranaire16. Des vésicules lipidiques unilamellaires géantes (GUV) ont été choisies comme système membranaire modèle avec une composition lipidique spécifiée. Les GUV ont été générés à l’aide de la méthode d’hydratation assistée par gel, en particulier l’hydratation par gel d’alcool polyvinylique, telle que décrite par Weinberger et al.23, qui a permis une encapsulation efficace des annexines dans les GUV.
L’utilisation de l’irradiation laser dans le proche infrarouge (NIR) sur les nanoparticules métalliques (NP) induit un échauffement important du NP, ce qui en fait une méthode efficace pour établir une source de chaleur locale exploitée dans les applications biomédicales24. La méthode a d’abord été utilisée pour mesurer directement la température autour d’un seul AuNP dans des tests biomimétiques 2D et 3D. Dans ces essais25,26, les nanoparticules plasmoniques ont été irradiées sur une bicouche lipidique supportée ou piégées optiquement à proximité des GUV subissant une transition de phase thermique locale lors d’un chauffage local, ce qui a permis de quantifier et de contrôler le profil de température exact autour de la particule. Ce profil de température de référence a été utilisé lors de l’étude ou de la manipulation d’échantillons biologiques. D’autres progrès dans la méthode ont facilité l’induction de pores nanoscopiques dans les membranes27, permettant la fusion des vésicules et des cellules28,29. D’autres études ont étudié le comportement des protéines membranaires périphériques dans les GUVs29 et les protéines transmembranaires30 en créant de nouvelles vésicules hybrides, tandis que l’administration de médicaments spécifiques aux cellules a également été explorée pour contrôler et étudier les réponses cellulaires ou l’expression des gènes 28,29,31,32,33. Récemment, la méthode a été utilisée pour étudier les réponses des protéines aux lésions membranaires 32,34,35.
Il existe plusieurs méthodes pour perturber la membrane plasmique afin d’explorer les réponses cellulaires et la réparation des membranes. Il s’agit notamment des ponctions de micro-aiguilles, de l’agitation des microbilles et du grattage cellulaire, qui peuvent tous perturber mécaniquement la membrane cellulaire 14,36,37. Les dommages induits chimiquement peuvent être obtenus en ajoutant des détergents 5,38 ou des toxines bactériennes39,40 qui déstabilisent la bicouche lipidique et génèrent des pores membranaires à travers la membrane plasmique. De plus, des lésions induites optiquement par des lasers à ondes continues et pulsées ont été utilisées pour étudier des composants PMR, tels que les protéines annexine 5,14,21,41, en combinaison avec des nanoparticules plasmoniques 42,43,44,45. Malgré l’efficacité des lasers pulsés de haute puissance, ils peuvent causer des blessures importantes et des dommages à l’intérieur de la cellule le long du trajet du faisceau. De plus, les changements détaillés qui se produisent dans la matière biologique lors de l’irradiation laser pulsée et si elle crée un pore bien défini restent à étudier. Une méthode alternative est présentée dans cet article, utilisant la thermoplasmonique pour induire des trous nanoscopiques dans les particules de manière contrôlée34,35 sans causer de dommages significatifs aux structures internes. Ceci est accompli en exposant les NP plasmoniques à un laser NIR hautement focalisé, ce qui entraîne une augmentation de température extrêmement localisée qui peut facilement atteindre des températures supérieures à 200 °C, ce qui peut conduire à de petites explosions nanoscopiques 25,46,47. Ce processus peut être contrôlé en ajustant l’intensité du laser ainsi que la taille, la forme et la composition des NPs48. En utilisant cette technique, les chercheurs peuvent explorer le rôle des protéines dans la réparation des particules dans les cellules vivantes, ce qui pourrait aider à répondre à certaines des questions sans réponse concernant l’implication des protéines d’annexine dans la réparation membranaire sans compromettre la viabilité cellulaire.
Le piégeage optique des nanoparticules plasmoniques a été bien établi par des études antérieures 25,49,50,51,52 ; cependant, des informations supplémentaires concernant les propriétés thermoplasmoniques des nanoparticules 53,54,55 peuvent être obtenues dans les matériaux supplémentaires (Fichier supplémentaire 1). La méthode thermoplasmonique peut être utilisée pour créer des trous nanoscopiques dans les particules dans le but d’étudier la réponse cellulaire et les mécanismes de réparation. Plus précisément, la ponction peut être réalisée par le chauffage optique des AuNPs à proximité immédiate de la membrane, comme le montrent les figures 1A et B. Cette ponction localisée permet un afflux de Ca2+, qui a été vérifié par un capteur de calcium, activant ainsi la machinerie PMR. Pour les expériences sur cellules vivantes, des AuNPs d’un diamètre de 200 nm ont été immobilisés à la surface sous la cellule pour surveiller le rôle d’ANXA2 dans la PMR par microscopie confocale. Le laser NIR (Figure 1A,B), d’une longueur d’onde de 1064 nm, irradie l’AuNP, exploitant ses propriétés plasmoniques (Figure 1C), ce qui entraîne un échauffement local important (Figure 1D) dans la fenêtre de transparence biologique49 tout en causant des dommages minimes à la cellule elle-même. La région à haute température entourant l’AuNP diminue rapidement de 30 à 40 % à une distance correspondant au rayon du NP, comme le montre la figure 1E, ce qui permet une lésion extrêmement confinée dans les trois dimensions.
Dossier supplémentaire 1. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure 1 : Schéma de la méthode expérimentale. (A) les cellules transfectées ANXA sont situées au-dessus de nanoparticules d’or immobilisées (AuNPs) à la surface, ou (B) les vésicules monolamellaires géantes (GUVs) avec ANXA encapsulé sont en suspension dans un milieu contenant des AuNPs. (C) Un seul AuNP est irradié par le piège optique NIR, où l’interaction entre le champ électromagnétique entrant et les électrons de conduction conduit à l’oscillation collective des électrons dans le NP. (D) Ce processus entraîne une augmentation très confinée mais significative de la température. Pour estimer la température à la surface du NP, la théorie de Mie est utilisée, et un profil de température (E) est calculé pour un AuNP d’un diamètre de 200 nm et d’une intensité laser I = 6,36 x 108 W/cm2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Pour minimiser l’effet thermique sur la membrane cellulaire, les AuNPs ne sont irradiés que pendant ~1 seconde. Cela provoque une explosion transitoire et locale d’échauffement, ce qui réduit les dommages aux protéines qui nécessitent généralement plus de temps pour se déployer. Lors de la ponction membranaire, les protéines d’annexine sont recrutées en une fraction de seconde et, en quelques secondes, un échafaudage en forme d’anneau d’annexine se forme autour du site de la lésion (Figure 2). Cette approche a également été appliquée pour explorer l’implication d’ANXA5 à la fois dans les cellules vivantes et dans les membranes modèles16 dans le but de faire la lumière sur le schéma complet des processus de réparation. Bien que l’accent ait été mis sur le recrutement corrélé de diverses protéines annexines, les aspects biophysiques du mécanisme de réparation n’ont pas encore été élucidés.
Pour mettre pleinement en œuvre la méthode proposée, trois composants clés sont nécessaires : la microscopie confocale, la pince optique et les nanoparticules métalliques. Des pinces optiques sont utilisées pour piéger les AuNPs, et leur construction peut être réalisée en suivant la procédure décrite par Neuman et al.49. Cependant, si la construction d’une pince optique s’avère trop difficile, un laser NIR à focalisation serrée peut être utilisé pour irradier les AuNPs immobilisés sous les cellules. Bien que des AuNP sphériques aient été choisis pour ce protocole, une variété de particules plasmoniques avec des spectres d’absorption accordables pourrait également être utilisée pour obtenir un gradient de température hautement localisé dans la région NIR48.
L’imagerie par fluorescence est nécessaire pour observer le rôle des protéines marquées par fluorescence et, par conséquent, la microscopie à réflexion interne totale (TIRF)56 pourrait être considérée comme une alternative à l’imagerie confocale. Cependant, cette technique ne permet que l’imagerie de surface et ne serait pas compatible avec les expériences modèles de vésicules membranaires. Par conséquent, la pince optique et le microscope confocal sont essentiels pour la localisation précise de la nanoparticule et l’étude détaillée de la zone locale entourant la lésion cellulaire. Pour irradier efficacement la nanoparticule avec un foyer laser limité par diffraction, il est nécessaire de visualiser la nanoparticule. Cela peut être réalisé de manière optimale par microscopie à réflexion, qui est une caractéristique d’imagerie standard des microscopes confocaux Leica. Cependant, si l’imagerie par réflexion ou diffusion n’est pas disponible, d’autres méthodes, telles que le marquage fluorescent AuNP moins efficace, peuvent être envisagées.
En résumé, la méthode thermoplasmonique hautement contrôlable et localisée présentée dans cette étude a le potentiel de servir d’excellente plate-forme pour étudier les composants moléculaires impliqués dans les réponses cellulaires et les mécanismes de réparation des particules dans les cellules vivantes. En plus d’étudier la réponse protéique lors de dommages aux particules, cette approche peut également être utilisée pour perforer localement les vésicules, permettant ainsi d’étudier la réponse protéique dans la dynamique protéine-protéine et protéine-membrane. De plus, cette méthode permet une analyse quantitative des interactions entre les protéines, les lipides et les petites molécules lorsque les membranes sont perturbées. Collectivement, ces avancées ont le potentiel de faire la lumière sur certaines des questions non résolues concernant la machinerie complexe et complexe de réparation des membranes plasmiques.
1. Préparation de la ponction de la membrane cellulaire
2. Expérience de ponction de membrane cellulaire
Informations complémentaires. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
3. Préparation de la vésicule unilamellaire géante (GUV)
4. Expérience de ponction GUV
Tableau 1 : Tableau de détermination de la composition de la GUV. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
5. Mesures et analyse des données de la réponse ANXA dans les expériences de ponction cellulaire
Dans la présente étude, la méthode thermoplasmonique est utilisée pour étudier la réponse de la protéine de l’annexine à la perturbation de la membrane plasmique ; Cependant, toute protéine susceptible d’être recrutée lors d’une lésion membranaire peut être étudiée à l’aide de ce test, étant donné que la protéine concernée est marquée par fluorescence. Le recrutement et la fonction des protéines sont surveillés par imagerie confocale dans les cellules rénales embryonnaires humaines (HEK293T) et les vésicules unilamellaires géantes (GUV). Pour élaborer, la figure 2 illustre les conditions expérimentales dans lesquelles un faisceau laser NIR focalisé à 1064 nm est utilisé pour irradier un seul AuNP (Figure 2A), ce qui entraîne une lésion de la membrane et un afflux de Ca2+ dans la cellule, activant la machinerie PMR. Par la suite, les annexines sont rapidement recrutées sur le site de la lésion, où elles se lient aux phospholipides chargés négativement sur le périmètre de la plaie, formant une structure en forme d’anneau en quelques secondes (Figure 2B, i-iv). Les expériences sur les membranes modèles, à l’aide de GUV, ont démontré que les perforations membranaires étaient rapidement refermées en l’absence d’ANXA, comme le montre la figure 2C. Cependant, en présence d’ANXA, une accumulation rapide d’ANXA a été observée au site de la lésion après la ponction de la membrane (Figure 2D). Notamment, ANXA a continué à rouler les bords exposés, ce qui a finalement conduit à l’éclatement du GUV. On pense que ce mécanisme de roulement provient de la capacité d’ANXA à induire une courbure et à plier les membranes lipidiques20.
Figure 2 : Réponse des annexines (ANXA) à la perturbation membranaire induite par les thermoplasmes. Initialement, (A) la membrane plasmique agit comme une barrière entre l’environnement extracellulaire contenant des niveaux élevés d’ions Ca2+ et l’environnement intracellulaire avec des ANXA encapsulés. Lors de l’irradiation avec un laser proche infrarouge (NIR), l’AuNP génère une chaleur substantielle, provoquant la rupture de la membrane et entraînant un afflux d’ions Ca2+. Par conséquent, la machinerie de réparation de la membrane plasmique (PMR) est activée, ce qui implique le recrutement d’ANXA sur le site de la lésion, où ils se lient aux phospholipides chargés négativement. (B-D) Les images de microscopie confocale d’une cellule contenant ANXA2 et d’un GUV contenant ANXA4 démontrent ce processus. (i) Avant l’irradiation, les images montrent une cellule intacte, ou GUV, avec les sites d’irradiation indiqués par les flèches blanches. (ii) Lors de l’irradiation par nanoparticules, (B) les ANXA sont rapidement recrutés sur le site de la lésion, formant une structure en forme d’anneau autour de la plaie membranaire (B [ii-iv]). Le panneau (C) montre un GUV coloré par la membrane sans ANXA, qui, en cas de perforation, se referme rapidement sans remodelage de la membrane observable. D’autre part, le panneau (D) montre un GUV contenant de l’ANXA4 recombinant, qui est déjà lié à la membrane avant (i) l’irradiation due à une fuite de Ca2+ à travers la membrane. (ii) Lors de la perforation, ANXA4 se lie aux bords libres, provoquant l’effondrement du GUV lorsque la membrane s’éloigne du bord. Les barres d’échelle mesurent 10 μm pour la figure (B), 2 μm pour B (i), 10 μm pour (C) et 15 μm pour (D). Cette figure est reproduite d’après Moreno-Pescador et. al16 avec l’autorisation de la Royal Society of Chemistry. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
L’analyse des structures complètes en forme d’anneau ANXA (Figure 2B et Figure supplémentaire 1) fournit des informations utiles sur la taille et la morphologie de la plaie. Le rayon de la structure de l’anneau ANXA peut être déterminé dans le temps et dans l’espace, comme décrit dans la section 5. Moreno et al.16 ont analysé plus de 135 lésions de la membrane plasmique dans des cellules vivantes, où l’analyse des structures de l’anneau ANXA5 est représentée à la figure 3. Le rayon a été déterminé en mesurant la distance entre le centre de l’anneau et le rayon externe de la courbe en fonction de la demi-largeur maximale du profil d’intensité replié (figure 3A). Les résultats ont illustré une distribution hétérogène des tailles d’anneaux ANXA5 (Figure 3B), qui sont restées constantes dans le temps (Figure 3D, G, H) et dans l’espace (Figure 3C, E, F). Ces résultats suggèrent une accumulation d’ANXA5 autour des sites de lésion, ce qui indique une stratégie PMR alternative médiée par ANXA5 dans les cellules vivantes à l’hypothétique bourgeonnement vers l’intérieur de la membrane endommagée en forme d’entonnoir5.
Figure 3 : Analyse des structures annulaires d’ANXA5 entourant un site de lésion dans des cellules vivantes. (A) La représentation schématique illustre l’approche analytique, qui est basée sur la largeur maximale du profil de la raie d’intensité ANXA. (B) L’histogramme illustre 135 rayons d’anneaux ANXA5 mesurés. (C) Profils de raies d’intensité de fluorescence à travers un anneau ANXA5-GFP pour chaque section z de la pile z. (D) Les images confocales illustrent l’évolution temporelle d’une plaie, où ANXA5-GFP s’accumule au périmètre de la plaie immédiatement après la blessure, suivie de la stabilisation de la plaie. Les intervalles de temps étiquetés de 1 à 6 ont été capturés à des intervalles de 0,66 s par image. La barre d’échelle est de 2 μm. (E) Les rayons des plaies ont été déterminés en fonction de la profondeur de la plaie sur la base de la méthode présentée dans le panneau A. (F) La pente de la plaie a été analysée en tant que rayons de l’anneau ANXA5 en fonction de la hauteur z sur la base des données extraites du panneau E. (G) Les profils de raies d’intensité de fluorescence ont été mesurés à travers l’anneau ANXA5-GFP du panneau D, où chaque intervalle de temps 1 à 6 est noté tranche 1 à 6. Enfin, (H) l’évolution temporelle des rayons de l’anneau ANXA5-GFP est présentée en fonction du temps calculé à partir des données du panneau G. Cette figure est reproduite d’après Moreno-Pescador et. al16 avec l’autorisation de la Royal Society of Chemistry. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Par rapport aux structures en forme d’anneau formées par la perturbation des particules seules (figure supplémentaire 1), les lésions à proximité immédiate du noyau (figure supplémentaire 2A) peuvent influencer l’évolution et la géométrie de la plaie. Parfois, seule une fraction des anneaux ANXA était évidente (Figure supplémentaire 2B,C), qui peut également être analysée à l’aide du workflow d’analyse interne de MATLAB (voir Section 5), bien que des données supplémentaires puissent être perdues. En règle générale, les formations d’anneaux ANXA observées dans les cellules non adhérentes (figure supplémentaire 2C) sont situées à proximité du noyau et de la périphérie de la cellule. En conséquence, une structure annulaire plus allongée peut être observée, ce qui n’est pas optimal pour l’analyse des données présentées. De plus, les cellules non adhérentes semblaient être plus sensibles à la mort cellulaire après une lésion des particules. De plus, lorsque l’on considère les blessures résultant de l’irradiation des agrégats d’AuNP, il est important de noter que ces blessures peuvent être plus graves et moins contrôlables. Cela est dû à l’augmentation significative de l’échauffement plasmonique, qui peut endommager une grande partie de la cellule. Par conséquent, ces blessures n’ont pas été intégrées dans l’analyse de l’anneau ANXA5.
De plus, les résultats préliminaires indiquent que la perturbation de la membrane plasmique à l’aide de la thermoplasmonique entraîne des niveaux intracellulaires élevés de Ca2+ . Cela a été observé même à une irradiation de faible intensité d’AuNPs uniques, suggérant une perméabilisation des particules35, comme le montre la figure 4. L’afflux de Ca2+ a été observé dans des cellules exprimant une sonde de calcium liée à la membrane, GCaMP6s-CAAX, qui subit un changement conformationnel lors de l’afflux de Ca2+ , et donc, une augmentation de son intensité peut être observée64. L’intensité calcique a été quantifiée pour l’ensemble de l’empreinte de la cellule au fil du temps. Pour éliminer le bruit de fond, le niveau de fond de Ca2+ a été soustrait avant la perturbation de la membrane et après la réparation de la membrane. L’intensité maximale a été déterminée en normalisant l’intensité moyenne du Ca2+ à l’intérieur de la cellule, ce qui a donné lieu à une courbe d’intensité montrant une augmentation initiale rapide de l’intensité du Ca2+ suivie d’une diminution plus lente, comme le montre la figure 4B.
La cellule a atteint une intensité calcique maximale à ~ 6,6 s, ce qui est cohérent avec les résultats de Klenow et al.64, qui ont suggéré que le temps du pic d’intensité calcique (t = tc) correspond au temps nécessaire à la fermeture de la plaie. Néanmoins, bien que d’autres investigations soient nécessaires pour établir le mécanisme sous-jacent de la réparation membranaire et de la cicatrisation des plaies, les résultats préliminaires ont montré que ce processus de Ca2+ a été observé exclusivement dans la cellule lésée et non dans la cellule non blessée utilisée comme témoin positif. Cela confirme que la cellule a subi un afflux de Ca2+ lors d’une perturbation de la membrane thermoplasmonique, où l’excès de calcium intracellulaire est activement pompé après une PMR réussie, car le niveau de calcium intracellulaire n’est plus en compétition avec l’afflux de Ca2+ , atteignant finalement l’homéostase cellulaire64.
Figure 4 : L’afflux de calcium se produit lorsque la membrane plasmique d’une cellule HEK293T est rompue par la thermoplasmonique. Une série d’images confocales montre deux cellules (la cellule d’intérêt et une cellule non blessée utilisée comme témoin positif) exprimant la sonde calcique membranaire, GCaMP6s-CAAX. La barre d’échelle mesure 10 μm. (A) Avant l’irradiation, à 00 :00 s, l’empreinte des deux cellules est visualisée par la ligne pointillée grise, et le site d’irradiation est indiqué par le cercle jaune. Lors de l’irradiation laser, un afflux rapide de Ca2+ est observé, atteignant une intensité maximale à ~ 6,6 s, indiquée par la ligne pointillée orange, un point de temps qui est présumé correspondre au moment de la fermeture de la plaie64. (B) Le profil d’intensité calcique obtenu à partir de la sonde GCaMP6s-CAAX dans la cellule lésée (ligne bleue) a été comparé à l’intensité de Ca2+ dans une cellule voisine non blessée (ligne pointillée grise), montrant un afflux clair de Ca2+ exclusivement lors de la perturbation des particules. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
L’étude met en évidence l’approche thermoplasmonique comme une technique prometteuse pour explorer les réponses protéiques dans les cellules vivantes et les membranes modèles après une rupture membranaire. Cette méthode fournit non seulement des informations détaillées sur le recrutement des protéines, mais aussi sur la fonction biophysique des protéines impliquées dans la dynamique protéine-membrane. Par conséquent, il facilite l’identification des composants moléculaires responsables de la réparation de surface et fait progresser la compréhension de la machinerie complexe mais vitale de la réparation des membranes plasmiques. Bien qu’il existe diverses méthodes pour induire une perturbation membranaire, telles que les techniques mécaniques, chimiques et optiques, ces méthodes souffrent de limitations, telles que le fait d’être non spécifiques aux cellules, de générer de multiples lésions de la membrane cellulaire ou de causer des dommages importants à la membrane et d’abler le matériel cellulaire interne le long du trajet du laser lors de l’utilisation de lasers pulsés de haute puissance. Bien que l’intégration de la microscopie confocale et de la pince optique offre les informations les plus complètes, d’autres modalités d’imagerie pourraient également être utilisées. Par exemple, comme l’imagerie de la nanoparticule plasmonique est réalisée à l’aide de la microscopie par réflexion, un mode d’imagerie intégré dans les microscopes confocaux Leica, des techniques d’imagerie supplémentaires, telles que la microscopie à fond noir 65,66, d’autres méthodes de diffusion comme iSCAT67,68 ou le marquage fluorescent de la nanoparticule, pourraient être utilisées pour la visualisation de l’AuNP, bien que cela puisse limiter l’applicabilité de la méthode.
La méthode présentée est en outre capable d’induire des trous nanoscopiques dans des membranes modèles, ce qui permet d’étudier les effets de synergie entre différentes annexines. Ceci est réalisé en encapsulant des annexines recombinantes marquées différemment, par exemple, RFP et GFP, respectivement, suivies d’une ponction thermoplasmonique. Ce système modèle donne un aperçu de la façon dont les annexines interagissent avec les membranes au voisinage des bords libres, comme le montre la figure 2D. Cependant, contrairement aux cellules, les trous infligés aux GUV continuent de s’étendre, suivis d’une déstabilisation de la vésicule. L’imagerie de l’évolution du trou à l’aide de la microscopie confocale peut être difficile en raison de l’expansion rapide du diamètre du trou, mais peut être accomplie en capturant plusieurs piles z au fil du temps. Une autre méthode consisterait à utiliser un disque confocal rotatif pour une imagerie plus rapide. De plus, l’approche thermoplasmonique donne généralement un nombre limité de résultats optimaux par heure lorsqu’elle est appliquée à des cellules uniques ou à des expériences GUV, généralement deux à trois, à des températures d’échantillon comprises entre 20 °C et 30 °C. Pour obtenir l’observation la plus précise possible de la dynamique protéine-membrane, il est recommandé de conserver les cellules dans un tampon contenant HEPES et de remplacer l’échantillon toutes les heures. Alternativement, la fenêtre expérimentale pourrait être prolongée en effectuant les expériences dans une chambre d’incubation cellulaire, c’est-à-dire à une température constante de 37 °C avec 5% de CO2. De plus, la combinaison de cette approche avec d’autres techniques d’imagerie, telles que la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM), pourrait permettre de mieux comprendre la fonction biophysique et l’interaction des protéines clés impliquées dans la réparation membranaire au niveau d’une seule molécule. Cela pourrait fournir des informations détaillées sur le site de la blessure, y compris la géométrie de la plaie et l’emplacement des protéines d’annexine, ainsi que l’identification d’autres acteurs clés impliqués dans la réparation de la surface de la membrane.
Afin d’obtenir une efficacité et une précision maximales dans l’induction d’une lésion membranaire, il est impératif de vérifier l’emplacement de la mise au point laser avant chaque expérience et de s’assurer que la position axiale de la mise au point laser coïncide avec la mise au point confocale. Cet alignement optimise l’intensité pendant l’imagerie AuNP, ce qui conduit à une augmentation locale maximale de la température et à une lésion de la membrane conséquente à une puissance laser plus faible. Ce processus est exécuté manuellement et est donc susceptible de varier l’efficacité de la rupture de la membrane, car la mise au point est traduite manuellement vers une position qui coïncide avec l’emplacement de la particule. Dans les microscopes qui n’ont pas de mode de réflexion, comme dans certains systèmes commerciaux, la colocalisation du foyer laser et de la particule peut être difficile. Dans de tels cas, d’autres modes d’imagerie (par exemple, fond clair) peuvent être utilisés, et un balayage raster lent peut être effectué autour de la position attendue de la particule. Il convient de noter qu’une faible puissance laser est susceptible d’induire uniquement une perméabilisation de la membrane, tandis qu’une puissance laser élevée peut générer des températures autour du NP qui dépassent le point d’ébullition de l’eau, même si la surface du verre a un effet de refroidissement. On estime que la formation de nanobulles entourant les NP se produit entre 200 °C et 300 °C25,48, où la chaleur explosive peut entraîner soit un déplacement des particules par rapport au foyer laser, soit une fragmentation des particules. De plus, la formation de nano ou de microbulles pendant le chauffage pose un défi à cette méthode. Comme l’air s’interface avec les membranes et peut provoquer une déstabilisation des protéines, ce qui n’est pas souhaitable, il est impératif de limiter l’échauffement lors de l’étude de la réparation des membranes. Notamment, les nanocoquilles d’or ne tolèrent pas les températures élevées et se dégradent dans ces conditions, comme l’a démontré la microscopie à haute résolution58.
Cet article fournit un protocole détaillé pour l’utilisation de la thermoplasmonique pour effectuer des ponctions hautement localisées dans les membranes, qui est applicable à la fois aux cellules et aux membranes modèles. Pour réduire davantage l’étendue de l’échauffement, des nanoparticules plus petites résonnant avec la lumière NIR peuvent être utilisées, ce qui permet des ponctions intracellulaires dans les endosomes, le réticulum endoplasmique et l’enveloppe nucléaire. De telles nanoparticules, y compris les bâtonnets et les nanomatriochkas48, peuvent être utilisées pour étudier la réparation de l’enveloppe nucléaire en ciblant les nanoparticules d’or endocytosées qui sont facilement absorbées à la surface de la cellule et trafiquées vers le noyau69. Dans l’ensemble, cette technique permet d’identifier et d’examiner les composants moléculaires clés impliqués dans la PMR, d’élucider leur fonction et leur rôle biophysiques tout en préservant la viabilité des cellules.
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Nous tenons à remercier Jesper Nylandsted de nous avoir fourni des protéines d’annexine recombinantes et des plasmides codant pour les annexines. Ce travail a été soutenu financièrement par le Conseil danois pour la recherche indépendante en sciences naturelles (DFF-4181-00196), par le programme de synergie interdisciplinaire 2018 de la Fondation Novo Nordisk (NNF18OC0034936), le comité scientifique de la Société danoise du cancer (R90-A5847-14-S2), la Fondation Lundbeck (R218-2016-534) et par le Centre d’excellence de la Fondation Lundbeck (biomembranes en nanomédecine).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1064 nm trapping laser | Spectra Physics | N/A | Spectra Physics J201-BL-106C, Nd: YVO4 NIR laser |
160 nm Gold Nanoshells | NanoComposix | NCXGSIR150 | |
200 nm Gold Nanoparticles | BBI Solutions | EM.GC200/7 | |
35 mm glass surface MatTex microwell | MATTEK | P35G-1.5-14-C | |
Amber-glass vials | Supelco Sigma Aldrich | 243438 | |
Annexin A2 plasmids | N/A | N/A | Received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center |
Annexin A4 recombinant-protein | N/A | N/A | N-terminal GFP tagged ANXA4 received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center |
Annexin A5 recombinant-protein | N/A | N/A | N-terminal GFP tagged ANXA5 received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center |
beta-casein | Sigma Life Science | C6905-1G | |
CaCl2 | Suprlco (sigma Aldrich) | 10035-04-8 | |
Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702 | |
Chloroform | VWR Chemicals | 67-66-3 | |
Culture dish (Nunclon Delta Surface) | Thermo scientific | 150460 | |
DID cell-labelling Solution | Invitrogen | 7757 | |
Distilled water | Gibco | 15230-089 | |
DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | Dissolved in chloroform |
DOPS | Avanti Polar Lipids | 840035C | Dissolved in chloroform |
Dulbecco's Modified Eage's Medium | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
FIJI ImageJ distribution | ImageJ2 | N/A | |
GCaMP6s-CAAX | N/A | Received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center | |
Gibco Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 11573397 | 10% of the culture medium |
Glucose | PROLABO | 24 374.297 | |
Hamilton syringes | Hamilton Company | N/A | 50 and 500 microliters |
Harrick Plasma Cleaner PDG-002 | Harrick Plasma | N/A | |
HEK293T cells | N/A | Received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center | |
Leica Acousto-Optical Beam Splitter (AOBS) | Leica | N/A | |
Leica PL APO 63x water immersion objective, NA = 1.2 | Leica | N/A | |
Leica SP5 confocal scanning microscope | Leica | N/A | |
Lipofectamine | Fisher Scientific | 15338030 | |
MatLab | The Mathworks, Inc., Natick, Massachusetts, United States | N/A | |
NaCl | VWR Chemicals | 7647-14-5 | |
Opti-MEM Reduced-Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | |
Parafilm | Bemis | PM-992 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 1% of the culture medium |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Piezoelectric stage (PI 731.20) | Physik Instrumente (Germany) | N/A | |
Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P8920-100ML | 0.01-0.1% for coating |
Polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich | 363065-25G | |
round glass slide 25 mm Ø | VWR | 631-1584 | |
Sonicator Brandson 2800 | Brandson | N/A | |
sucrose | Sigma Life Science | 57-50-1 | |
T25 tissue culture flask | Falcon | 353108 | Blue Vented cap |
Tris-HCl | Invitrogen | 15567-027 | |
TrypLE | Thermo Fisher Scientific | A1285901 | |
Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 11590626 | |
VWR Mixer mini vortex 230V EU | VWR | 12620-84 | ECN: 444-2790, SN: 150713022 |
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