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  • Riepilogo
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  • Introduzione
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  • Discussione
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  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il metodo di puntura termoplasmonica integra microscopia confocale, pinzette ottiche e nanoparticelle d'oro per studiare le risposte proteiche durante la riparazione della membrana plasmatica nelle cellule e nelle vescicole unilamellari giganti. La tecnica consente una puntura di membrana rapida e localizzata, consentendo l'identificazione di proteine chiave e dei loro ruoli funzionali nell'intricato meccanismo di riparazione della membrana plasmatica.

Abstract

La membrana cellulare è fondamentale per la sopravvivenza cellulare e garantirne l'integrità è essenziale poiché la cellula subisce lesioni durante il suo intero ciclo di vita. Per prevenire danni alla membrana, le cellule hanno sviluppato efficienti meccanismi di riparazione della membrana plasmatica. Questi meccanismi di riparazione possono essere studiati combinando la microscopia confocale e la termoplasmonica su scala nanometrica per identificare e studiare il ruolo di proteine chiave, come le annessine, coinvolte nella riparazione superficiale nelle cellule viventi e nei sistemi modello di membrana.

Il metodo di puntura impiega un laser per indurre un riscaldamento altamente localizzato in seguito all'irradiazione di nanoparticelle. L'uso della luce nel vicino infrarosso riduce al minimo la fototossicità nel campione biologico, mentre la maggior parte dell'assorbimento avviene nella nanoparticella plasmonica risonante nel vicino infrarosso. Questo metodo termoplasmonico è stato sfruttato per potenziali ricerche fototermiche e biofisiche per migliorare la comprensione dei meccanismi intracellulari e delle risposte cellulari attraverso studi di fusione di vescicole e cellule. L'approccio ha dimostrato di essere complementare ai metodi esistenti per la rottura della membrana, come le lesioni indotte meccanicamente, chimicamente o otticamente, e fornisce un elevato livello di controllo infliggendo lesioni estremamente localizzate. L'entità della lesione è limitata alla vicinanza della nanoparticella sferica e non si verificano danni dannosi lungo il percorso del fascio rispetto ai laser pulsati che utilizzano lunghezze d'onda diverse. Nonostante alcune limitazioni, come la formazione di nanobolle, il metodo termoplasmonico offre uno strumento unico per studiare le risposte cellulari nella riparazione della membrana plasmatica in un ambiente quasi nativo senza compromettere la vitalità cellulare.

Se integrato con la microscopia confocale, il metodo di puntura può fornire una comprensione meccanicistica della dinamica della membrana nei sistemi di membrana modello, nonché informazioni quantitative sulle risposte delle proteine al danno di membrana, compreso il reclutamento delle proteine e la loro funzione biofisica. Nel complesso, l'applicazione di questo metodo a sistemi modello ridotti può migliorare la nostra comprensione dell'intricato meccanismo di riparazione della membrana plasmatica nelle cellule viventi.

Introduzione

La membrana cellulare, che funge sia da barriera fisica che da piattaforma di segnalazione, è vitale per la sopravvivenza cellulare1. Durante il suo intero ciclo cellulare, la membrana plasmatica (PM) è soggetta a danni, come lesioni meccaniche 2,3,4,5 e chimiche 6 indotte dallo stress. Per mantenere l'integrità della membrana e garantire la sopravvivenza cellulare, la cellula ha sviluppato robusti meccanismi di riparazione della membrana plasmatica (PMR). Questi meccanismi dipendono da varie strategie, come la riorganizzazione del citoscheletro, la fusione della membrana e le strategie di sostituzione della membrana 7,8,9,10,11, che si basano tutte sul reclutamento di proteine specifiche. In particolare, i membri della famiglia delle proteine annessine sono stati identificati come proteine chiave associate ai processi di PMR 1,9,12,13,14,15,16. A seguito di una lesione da PM, la cellula subisce un afflusso di ioni calcio (Ca2+), che rappresenta una minaccia immediata per la sopravvivenza della cellula17. In risposta all'afflusso di Ca2+, le proteine annessine, che si trovano prevalentemente nel citosol, si legano al lembo interno della membrana plasmatica danneggiata come parte delle strategie PMR18. L'annessina A2 (ANXA2) è stata uno dei primi membri della famiglia delle annessine ad essere associata alla PMR nella distrofia muscolare da deficit di disferlina ed è stato suggerito per mediare la riparazione fondendo le vescicole intracellulari al PM vicino al sito della lesione 5,19,20,21. Successivamente, diverse funzioni sono state attribuite alle annessioni22 e il loro ruolo nella PMR ha attirato una maggiore attenzione negli ultimi 20 anni. Tuttavia, l'esatto ruolo delle annessine nella PMR non è ancora pienamente compreso 15,18,21,22.

Questo articolo propone un metodo per studiare l'interazione proteina-membrana e la dinamica della membrana in modo controllato e altamente localizzato, utilizzando una combinazione di microscopia confocale, pinzette ottiche e nanoparticelle d'oro (AuNP). Questo metodo consente lo studio quantitativo delle interazioni tra proteine, lipidi e piccole molecole in risposta al danno alla membrana e all'afflusso di Ca2+ . Nonostante la complessità e la molteplicità dei componenti coinvolti nel processo di riparazione della membrana, sono stati impiegati sistemi a membrana semplificati che imitano la membrana plasmatica per ottenere una comprensione meccanicistica più profonda della dinamica della membrana e della risposta delle proteine annessine alla rottura della membrana16. Le vescicole lipidiche unilamellari giganti (GUV) sono state scelte come sistema di membrana modello con una composizione lipidica specificata. I GUV sono stati generati utilizzando il metodo di idratazione assistita da gel, in particolare l'idratazione su gel di alcol polivinilico, come descritto da Weinberger et al.23, che ha permesso un efficiente incapsulamento delle annessine nei GUV.

L'utilizzo dell'irradiazione laser nel vicino infrarosso (NIR) su nanoparticelle metalliche (NP) induce un significativo riscaldamento delle NP, rendendolo un metodo efficace per stabilire una fonte di calore locale sfruttata nelle applicazioni biomediche24. Il metodo è stato inizialmente utilizzato per misurare direttamente la temperatura che circonda una singola AuNP in saggi biomimetici 2D e 3D. In questi saggi25,26, le nanoparticelle plasmoniche sono state irradiate su un doppio strato lipidico supportato o intrappolate otticamente vicino a GUV sottoposti a una transizione di fase termica locale dopo riscaldamento locale, consentendo la quantificazione e il controllo dell'esatto profilo di temperatura intorno alla particella. Questo profilo di temperatura di riferimento è stato utilizzato durante l'indagine o la manipolazione di campioni biologici. Ulteriori progressi nel metodo hanno facilitato l'induzione di pori nanoscopici nelle membrane27, consentendo la fusione di vescicole e cellule28,29. Altri studi hanno studiato il comportamento delle proteine di membrana periferiche nei GUV29 e nelle proteine transmembrana30 creando nuove vescicole ibride, mentre la somministrazione di farmaci cellulo-specifici è stata esplorata anche per controllare e studiare le risposte cellulari o l'espressione genica 28,29,31,32,33. Recentemente, il metodo è stato utilizzato per studiare le risposte proteiche al danno di membrana 32,34,35.

Esistono diversi metodi per interrompere la membrana plasmatica per esplorare le risposte cellulari e la riparazione della membrana. Questi includono punture con microaghi, scuotimento di microsfere e raschiamento cellulare, che possono interrompere meccanicamente la membrana cellulare 14,36,37. Il danno indotto chimicamente può essere ottenuto aggiungendo detergenti 5,38 o tossine batteriche39,40 che destabilizzano il doppio strato lipidico e generano pori di membrana attraverso la membrana plasmatica. Inoltre, le lesioni otticamente indotte da laser ad onda continua e pulsati sono state utilizzate per studiare i componenti PMR, come le proteine annessina 5,14,21,41, in combinazione con nanoparticelle plasmoniche 42,43,44,45. Nonostante l'efficienza dei laser pulsati ad alta potenza, possono causare lesioni significative e danni all'interno della cellula lungo il percorso del raggio. Inoltre, i cambiamenti dettagliati che si verificano nella materia biologica in seguito all'irradiazione laser pulsata e se crea un poro ben definito rimangono da indagare ulteriormente. In questo articolo viene presentato un metodo alternativo, che impiega la termoplasmonica per indurre fori nanoscopici nel PM in modo controllato 34,35 senza causare danni significativi alle strutture interne. Ciò si ottiene esponendo le NP plasmoniche a un laser NIR altamente focalizzato, con conseguente aumento della temperatura estremamente localizzato che può facilmente raggiungere temperature superiori a 200 °C, che possono portare a piccole esplosioni nanoscopiche 25,46,47. Questo processo può essere controllato regolando l'intensità del laser, nonché le dimensioni, la forma e la composizione degli NP48. Impiegando questa tecnica, i ricercatori possono esplorare il ruolo delle proteine nella riparazione del PM nelle cellule viventi, il che potrebbe aiutare a rispondere ad alcune delle domande senza risposta riguardanti il coinvolgimento delle proteine annessina nella riparazione della membrana senza compromettere la vitalità cellulare.

L'intrappolamento ottico delle nanoparticelle plasmoniche è stato ben stabilito da precedenti studi 25,49,50,51,52; tuttavia, ulteriori approfondimenti sulle proprietà termoplasmoniche delle nanoparticelle 53,54,55 possono essere ottenuti nei materiali supplementari (Supplementary File 1). Il metodo termoplasmonico può essere utilizzato per creare fori nanoscopici nel PM allo scopo di studiare la risposta cellulare e i meccanismi di riparazione. Più precisamente, la puntura può essere ottenuta attraverso il riscaldamento ottico delle AuNP in prossimità della membrana, come mostrato nelle Figure 1A e B. Questa puntura localizzata consente l'afflusso di Ca2+, che è stato verificato da un sensore di calcio, attivando così il meccanismo PMR. Per gli esperimenti su cellule vive, le AuNP con un diametro di 200 nm sono state immobilizzate sulla superficie sotto la cellula per monitorare il ruolo di ANXA2 nella PMR tramite microscopia confocale. Il laser NIR (Figura 1A,B), con una lunghezza d'onda di 1064 nm, irradia l'AuNP, sfruttando le sue proprietà plasmoniche (Figura 1C), provocando un sostanziale riscaldamento locale (Figura 1D) nella finestra di trasparenza biologica49 e causando danni minimi alla cellula stessa. La regione ad alta temperatura che circonda l'AuNP diminuisce rapidamente del 30-40% a una distanza corrispondente al raggio dell'NP, come illustrato nella Figura 1E, consentendo una lesione estremamente limitata in tutte e tre le dimensioni.

Fascicolo supplementare 1. Fare clic qui per scaricare il file.

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Figura 1: Schema del metodo sperimentale. (A) le cellule trasfettate con ANXA sono situate sopra nanoparticelle d'oro immobilizzate (AuNP) sulla superficie, o (B) le vescicole unilamellari giganti (GUV) con ANXA incapsulate sono sospese in un mezzo contenente AuNP. (C) Una singola AuNP viene irradiata dalla trappola ottica NIR, dove l'interazione tra il campo elettromagnetico in ingresso e gli elettroni di conduzione porta all'oscillazione collettiva degli elettroni all'interno della NP. (D) Questo processo provoca un aumento della temperatura altamente confinato ma significativo. Per stimare la temperatura sulla superficie NP, viene utilizzata la teoria di Mie, e viene calcolato un profilo di temperatura (E) per un AuNP con un diametro di 200 nm e intensità laser I = 6,36 x 108 W/cm2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per ridurre al minimo l'effetto termico sulla membrana cellulare, le AuNP vengono irradiate solo per ~1 secondo. Ciò provoca un'esplosione di riscaldamento transitoria e locale, che riduce il danno alle proteine che in genere richiedono più tempo per dispiegarsi. Dopo la puntura della membrana, le proteine annessina vengono reclutate in una frazione di secondo e, nel giro di pochi secondi, si forma un'impalcatura ad anello di annessina attorno al sito della lesione (Figura 2). Questo approccio è stato applicato anche per esplorare il coinvolgimento di ANXA5 sia nelle cellule viventi che nelle membrane modello16 nel tentativo di far luce sullo schema completo dei processi di riparazione. Mentre l'attenzione principale si è concentrata sul reclutamento correlato di varie proteine annessine, gli aspetti biofisici del meccanismo di riparazione devono ancora essere chiariti.

Per implementare pienamente il metodo proposto, sono necessari tre componenti chiave: microscopia confocale, pinzette ottiche e nanoparticelle metalliche. Le pinzette ottiche vengono utilizzate per intrappolare le AuNP e la loro costruzione può essere ottenuta seguendo la procedura descritta da Neuman et al.49. Tuttavia, se la costruzione di una pinzetta ottica si rivela troppo impegnativa, è possibile utilizzare un laser NIR strettamente focalizzato per irradiare le AuNP immobilizzate sotto le cellule. Mentre le AuNP sferiche sono state scelte per questo protocollo, una varietà di particelle plasmoniche con spettri di assorbimento sintonizzabili potrebbe anche essere utilizzata per ottenere un gradiente di temperatura altamente localizzato all'interno della regione NIR48.

L'imaging a fluorescenza è necessario per osservare il ruolo delle proteine marcate con fluorescenza e, pertanto, la microscopia a riflessione interna totale (TIRF)56 potrebbe essere considerata un'alternativa all'imaging confocale. Tuttavia, questa tecnica consente solo l'imaging di superficie e non sarebbe compatibile con gli esperimenti sulle vescicole di membrana modello. Di conseguenza, sia le pinzette ottiche che il microscopio confocale sono essenziali per la localizzazione precisa della nanoparticella e per l'indagine dettagliata dell'area locale che circonda la lesione cellulare. Per irradiare efficacemente la nanoparticella con un fuoco laser limitato alla diffrazione, è necessario visualizzare la nanoparticella. Ciò può essere ottenuto in modo ottimale con la microscopia a riflessione, che è una caratteristica di imaging standard dei microscopi confocali Leica. Tuttavia, se l'imaging a riflessione o a dispersione non è disponibile, possono essere presi in considerazione metodi alternativi, come la marcatura fluorescente AuNP meno efficiente.

In sintesi, il metodo termoplasmonico altamente controllabile e localizzato presentato in questo studio ha il potenziale per fungere da eccellente piattaforma per studiare i componenti molecolari coinvolti nelle risposte cellulari e nei meccanismi di riparazione del PM nelle cellule viventi. Oltre a studiare la risposta proteica al danno da PM, questo approccio può essere utilizzato anche per perforare localmente le vescicole, consentendo così un'indagine della risposta proteica sia nella dinamica proteina-proteina che in quella proteina-membrana. Inoltre, questo metodo consente un'analisi quantitativa delle interazioni tra proteine, lipidi e piccole molecole quando le membrane vengono interrotte. Collettivamente, questi progressi hanno il potenziale per far luce su alcune delle questioni irrisolte riguardanti l'intricato e complesso meccanismo di riparazione della membrana plasmatica.

Protocollo

1. Preparazione alla puntura della membrana cellulare

  1. Semina cellulare (Giorno 1)
    1. Colture di cellule renali embrionali umane (HEK293T) in terreno di coltura a 37 °C in un incubatore umidificatore al 5% di CO2 fino a raggiungere il 70% di confluenza.
    2. Staccare le cellule dalla superficie utilizzando 500 μL di tripsina, contare 200.000 cellule HEK293T e seminarle in una piastra di coltura con un volume totale di 3 mL di terreno di coltura. Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore umidificatore al 5% di CO2 per 24 ore.
      NOTA: Per evitare il raggruppamento delle cellule al centro della parabola, distribuire le cellule in modo uniforme ed evitare di far roteare la capola, in quanto ciò può ridurre l'efficienza della trasfezione.
  2. Trasfezione cellulare (Giorno 2)
    NOTA: Le cellule trasfettate possono essere utilizzate fino a 48 ore dopo la trasfezione.
    1. Pipettare il plasmide di interesse e il reagente di trasfezione per 5 secondi prima dell'uso.
    2. In una provetta sterile da 2 mL, miscelare quanto segue nell'ordine specifico: 500 μL di terreno sierico ridotto, 5 μL di reagente di trasfezione (4 volte più del plasmide) e 1,25 μL di plasmide (1 μg/μL).
      NOTA: Per studiare l'afflusso di calcio in caso di rottura della membrana, seguire la stessa procedura ma utilizzare la sonda del sensore di calcio legata alla membrana GCaMP6-CAAX (1 μg/μL).
    3. Pipettare delicatamente ma accuratamente la miscela di trasfezione e incubarla a temperatura ambiente (RT) per 30 minuti prima di aggiungerla goccia a goccia alle cellule.
    4. Prima di aggiungere la miscela di trasfezione, rimuovere il terreno dal piatto di coltura, lavare delicatamente le cellule con 2 mL di soluzione salina tamponata con fosfato e aggiungere 2000 μL di terreno a siero ridotto nel piatto.
    5. Incubare le cellule insieme alla miscela di trasfezione a 37 °C in un incubatore umidificatore al 5% di CO2 per 2 ore e 45 minuti prima di cambiare il terreno con 3 mL di terreno di coltura.
  3. Preparazione della soluzione di nanoparticelle d'oro (AuNP) (Giorno 2)
    1. Vorticare la soluzione madre AuNP a 200 nm per 10 s al livello 10 (vedere la tabella dei materiali per ulteriori specifiche dell'apparecchiatura), sonicare per 5 min (ampiezza massima) e vorticare di nuovo per 10 s.
    2. Miscelare 150 μL di AuNP con 850 μL di acqua distillata per un volume totale di 1 mL.
      NOTA: La soluzione AuNP diluita può essere conservata in frigorifero e riutilizzata per un massimo di 1 mese.
  4. Preparazione del piatto sperimentale (Giorno 2)
    1. Rivestire la piastra a micropozzetti con 150 μL di soluzione di attacco cellulare allo 0,01%-0,1% e incubare per 15 minuti a RT.
    2. Lavare due volte la superficie del vetro con 500 μL di acqua distillata e lasciarla asciugare all'aria per ~10 min.
    3. Aggiungere 80 μL di soluzione di AuNP goccia a goccia sulla superficie asciutta.
      NOTA: Vorticare (10 s), sonicare (5 min) e vorticare (10 s) la soluzione di AuNP diluita prima di aggiungerla alla superficie del vetro rivestito per ridurre al minimo gli aggregati di AuNP.
    4. Attendere ~10 minuti prima di introdurre 1,5 mL di terreno di coltura. Lasciare incubare la capsula a 37 °C per una notte.
  5. Preparazione della camera sperimentale (Giorno 3)
    NOTA: La camera sperimentale può essere preparata sia il giorno 3 che il giorno 4; Tuttavia, assicurarsi che i seguenti preparativi vengano eseguiti lo stesso giorno dell'esperimento.
    1. Rimuovere il terreno dalle cellule nel piatto di coltura e lavare le cellule con 2 mL di soluzione salina tamponata con fosfato.
      NOTA: Questo passaggio è essenziale per rimuovere eventuali residui di fluido e detriti che potrebbero interferire con i passaggi successivi.
    2. Aggiungere 500 μL di soluzione di distacco cellulare a base enzimatica nel pozzetto e incubare per 1-3 minuti fino a quando le cellule non si sono staccate dalla piastra di coltura.
    3. Aggiungere 1,5 mL di terreno di coltura fresco e pipettare la soluzione cellulare per ottenere una soluzione cellulare omogenea per ridurre al minimo la probabilità di cluster cellulari.
    4. Rimuovere con cautela il terreno dalle AuNP nel micropozzetto sperimentale.
    5. Aggiungere la soluzione cellulare (2 ml) al micropozzetto e lasciarla incubare per almeno 5 ore prima di eseguire l'esperimento.
      NOTA: Per condizioni sperimentali ottimali, evitare di far roteare la camera, in quanto ciò potrebbe causare il raggruppamento delle cellule al centro della camera.

2. Esperimento di puntura della membrana cellulare

  1. Impostazioni ottiche dell'esperimento
    1. Condurre gli esperimenti utilizzando un microscopio a scansione confocale combinato con un laser a intrappolamento da 1064 nm57.
    2. Eseguire l'intrappolamento ottico sul piano focale utilizzando un obiettivo a immersione in acqua 63x con un'apertura numerica (NA) di 1,2.
    3. Si supponga che il fuoco abbia le dimensioni di un disco di Airy e che l'ampiezza del fascio focale del laser di irradiazione sia di ~540 nm di raggio.
    4. Convertire la potenza del laser (P) nella corrispondente intensità del laser (I) calcolando la potenza del laser per area (W/cm2).
    5. Utilizza un divisore di fascio acusto-ottico (AOBS) per visualizzare più segnali fluorescenti rilevati utilizzando tubi fotomoltiplicatori e rilevamento simultaneo di NP metallici tramite il loro segnale di diffusione.
      NOTA: Non tutti i sistemi confocali sono dotati di AOBS, che consente l'imaging a riflessione di NP metallici. In questo caso, è necessario implementare altre forme di rilevamento o tentare una scansione sequenziale del laser NIR nell'area sottostante la cella.
    6. Durante le sessioni sperimentali, montare al microscopio una camera aperta con fondo di vetro contenente cellule, sonde fluorescenti molecolari e nanoparticelle d'oro.
    7. Spostare la trappola rispetto alle cellule traslando il campione montato su uno stadio piezoelettrico, consentendo movimenti laterali precisi al nanometro16.
      NOTA: La trappola ottica viene mantenuta ferma.
  2. Impostazioni sperimentali per la puntura della membrana cellulare
    1. Posizionare HEK293T cellule, trasfettate con plasmidi di annessina accoppiati con una proteina fluorescente, sopra AuNP isolate che sono immobilizzate sulla superficie di vetro (Figura 1A).
    2. Utilizzare un laser ad argon da 488 nm per visualizzare il segnale di fluorescenza GFP e un laser HeNe da 633 nm per osservare la riflessione AuNP nel microscopio confocale a scansione.
    3. Impiega la pinzetta ottica, che funziona con un laser NIR a 1064 nm, per irradiare una singola AuNP per ~ 1 s, inducendo un significativo aumento locale della temperatura che interrompe la membrana plasmatica.
    4. Applicare l'irradiazione tra 200-295 mW alla particella focalizzata, con conseguente aumento sostanziale della temperatura.
      NOTA: C'è una sostanziale perdita di potenza all'interno dell'ottica, con la potenza del laser nel punto focale che raggiunge circa il 20% del milliwatt dichiarato, a seconda della configurazione specifica. L'intensità specifica (misurata in W/cm2) dipende dall'esatto allineamento del sistema, in particolare dalla dimensione focale. Inoltre, la conduzione del calore del vetro è superiore a quella della cellula e dell'acqua e di conseguenza la riduzione della quantità di calore rilasciata alla membrana plasmatica è leggermente ridotta48,58.
    5. Ottenere una lesione da PM efficace e localizzata e la successiva risposta di riparazione delle proteine calibrando correttamente la localizzazione del punto di messa a fuoco del laser NIR. Ciò si ottiene catturando una singola AuNP sospesa nello stesso mezzo di imaging e assicurando che l'AuNP selezionata sia a fuoco prima dell'irradiazione.
      NOTA: La nanoparticella è considerata a fuoco quando il suo segnale di scattering appare più nitido, cioè mostrando bordi chiari e l'assenza di un alone attorno alla particella, quando la si osserva al microscopio confocale (Figura 2C (ii)).
  3. Condizioni di densità cellulare e AuNP
    1. Scegliere cellule singole invece di cluster di cellule per evitare la sovrapposizione delle membrane plasmatiche.
      NOTA: Le cellule devono essere aderenti alla superficie, presentando una morfologia appiattita (Figura supplementare 1), che consente di perforare la periferia cellulare prevenendo danni alla membrana nucleare (Figura supplementare 2).
    2. Incubare le cellule secondo il protocollo o fino a quando non si sono stabilizzate e appiattite per prevenire l'assorbimento cellulare di AuNP. Evitare tempi di incubazione eccessivi e ridurre la probabilità di endocitosi delle AuNP utilizzando AuNP PEGilate.
    3. Assicurarsi che le AuNP immobilizzate siano presenti come singole particelle, adeguatamente distanziate l'una dall'altra per evitare aggregazioni. Gli aggregati possono portare a un aumento significativo del gradiente termico, con conseguente aumento delle temperature che possono distruggere una frazione sostanziale della cella.
    4. Sostituire il campione ogni 1-2 ore per mantenere la salute delle cellule.
      NOTA: L'esposizione prolungata può portare a un deterioramento della salute delle cellule, compromettendo la loro capacità di rispondere con precisione alle lesioni in termini di riparazione della membrana. Questo declino della salute cellulare è tipicamente osservato da un cambiamento nella forma cellulare, poiché le cellule appaiono più sferiche e più rigide, culminando infine nella morte cellulare.

Informazioni supplementari. Fare clic qui per scaricare il file.

3. Preparazione della vescicola unilamellare gigante (GUV)

  1. Preparazione della miscela lipidica
    1. Ottenere la composizione lipidica GUV combinando i lipidi 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) e 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (DOPS) in un rapporto molare di 4:1 (vedi Tabella 1). Aliquotare la scorta lipidica in flaconcini di vetro da 1,5 mL in base alle esigenze sperimentali e conservarle a -20 °C.
      NOTA: Per una conservazione prolungata dei lipidi e per prevenire l'ossidazione dei lipidi insaturi, sostituire l'aria con argon nei flaconcini aliquotati.
    2. Prima di miscelare i lipidi, pulire accuratamente una siringa di vetro o metallo da 50 μL e una da 500 μL con cloroformio cinque volte per assicurarsi che siano prive di contaminanti per i lipidi disciolti nel cloroformio.
      ATTENZIONE: Maneggiare il cloroformio in una cappa aspirante a causa della sua tossicità.
      1. Trasferire il volume calcolato di cloroformio in un flaconcino di vetro ambrato pulito, seguito dalla quantità specificata di ciascun lipide (vedere Tabella 1).
        NOTA: Per evitare la contaminazione incrociata tra i lipidi, assicurarsi che le siringhe siano pulite con cloroformio.
      2. Infine, aggiungere il colorante di membrana e mescolare accuratamente i lipidi mediante pipettaggio. Conservare la miscela lipidica preparata a -20 °C per un ulteriore utilizzo; La miscela rimane vitale per 2-3 settimane senza alcun danno lipidico considerevole.
        NOTA: La miscelazione deve essere effettuata con una siringa metallica o di vetro. Tenere sempre i lipidi sul ghiaccio quando sono fuori dal congelatore.
  2. Preparazione di gel di alcol polivinilico (PVA)
    1. Preparare i GUV utilizzando il metodo di idratazione assistita da gel descritto da Weinberger et al.23con piccole modifiche.
      1. Preparare il gel di PVA sciogliendo 5 g di PVA in 100 mL di tampone contenente 50 mM di saccarosio, 25 mM di NaCl e 25 mM di Tris (pH 7,4).
      2. Scaldare la soluzione di PVA a 85 °C e mescolare fino a quando non diventa trasparente. Lasciarlo raffreddare a RT e conservarlo in frigorifero per un ulteriore utilizzo.
        NOTA: Il PVA non è disciolto correttamente nel tampone e quindi è necessario riscaldare fino a 85 °C.
  3. Preparazione di vetrini
    1. Pulisci i vetrini con etanolo e lasciali asciugare all'aria. Quindi, trattare i vetrini con un detergente al plasma ad aria per rimuovere eventuali contaminazioni residue dalla superficie del vetro.
    2. Preparazione di vetrini rivestiti in PVA
      1. Riscaldare il gel PVA (5%) fino a 60 °C per 30 min per aumentarne la fluidità. Applicare 90 μL di PVA caldo sul vetrino, stendere uniformemente e lasciare asciugare in una camera calda a 50 °C per 50 minuti.
      2. Una volta che il vetrino in PVA è pronto, aggiungere 30 μL della miscela lipidica preparata utilizzando una siringa di vetro o metallo e stenderlo in una pellicola sottile utilizzando il bordo dell'ago.
      3. Asciugare la miscela lipidica facendo evaporare il suo contenuto di cloroformio sotto una leggera pressione di azoto. Inoltre, asciugare i vetrini sotto vuoto per 1,5-2 ore.
  4. Crescita di GUV in una camera
    1. Assemblare la camera interna, simile nel design a un rapportoprecedentemente pubblicato 59, utilizzando il vetrino preparato.
    2. In una provetta separata da 2 mL, diluire la proteina ricombinante di interesse (in questo caso, ANXA5 o ANXA4) a una concentrazione finale di 500 nM con un tampone di crescita (GB) costituito da 80 mM di saccarosio, 70 mM di NaCl e 25 mM di Tris-HCl (pH 7,4).
    3. Aggiungere 400 μL della soluzione proteica ricombinante diluita nella camera. Incubare la camera a RT per 1 ora per consentire ai GUV di crescere dal rivestimento lipidico depositato. Utilizzare lo stesso tampone, esclusa la proteina, come controllo negativo.
      NOTA: Avvolgere la camera in una pellicola poliolefinica per evitare l'evaporazione del tampone.
    4. Raccogliere i GUV trasferendo 400 μL del contenuto della camera in una provetta da 2 mL.
    5. Rimuovere le proteine non incapsulate al di fuori dei GUV aggiungendo 1 mL di tampone di osservazione (OB) contenente 55 mM di glucosio, 70 mM di NaCl e 50 mM di Tris-HCl (pH 7,4) alla soluzione raccolta. Quindi, centrifugare la soluzione a 600 x g per 10 minuti a 13 °C.
    6. Dopo la centrifugazione, sostituire 1 mL di surnatante con un volume uguale di tampone di osservazione. Disperdere i GUV attraverso un pipettaggio delicato e conservarli in frigorifero fino a quando non vengono utilizzati negli esperimenti GUV.

4. Esperimento di puntura GUV

  1. Preparazione della camera
    1. Utilizzare un piatto con fondo di vetro da 35 mm per l'esperimento. Per evitare che i GUV si attacchino alla superficie e scoppino, rivestire la superficie con β-caseina (5 mg/mL) per 15-30 minuti.
      1. Per la soluzione di β-caseina, sciogliere 0,1 g della proteina in un tampone da 20 mL di 20 mM Tris (PH 7,5) e 100 mM di NaCl. Filtrare la soluzione proteica, aliquotarla in piccole fiale e congelarla per un ulteriore utilizzo.
    2. Lavare la camera due volte con tampone di osservazione per rimuovere eventuali β-caseine libere in eccesso dalla superficie e lasciare asciugare a RT.
    3. In una provetta separata da 2 mL, miscelare i GUV raccolti con l'OB. Aggiungere CaCl2 alla miscela per ottenere la concentrazione finale desiderata (in questo caso, 200 μM).
    4. Introdurre nanogusci d'oro (AuNS) da 150 nm nella miscela in un rapporto di 1:100. La miscela finale comprende 250 μL di GUV, 225 μL di OB, 20 μL di CaCl2 (5 mM) e 5 μL degli AuNS specificati.
  2. Configurazione sperimentale
    1. Trasferire la miscela nella camera e montarla sul tavolino del microscopio. A seconda delle dimensioni della camera, aggiungere l'intera miscela o una parte della miscela.
      NOTA: La tempistica è fondamentale poiché gli ioni calcio possono passare attraverso la membrana e mediare il legame delle annessine al foglietto interno della membrana.
    2. Impiega la stessa configurazione ottica utilizzata per gli esperimenti di perforazione cellulare.
    3. Utilizzare le pinzette ottiche per intrappolare un singolo AuNS in prossimità o sulla superficie di un GUV applicando una potenza laser di ~ 125 mW.
    4. Successivamente, aumentare la potenza del laser a ~ 300 mW. Ciò produce un aumento di temperatura altamente localizzato, che interrompe e perfora la membrana nel sito bersaglio.
      NOTA: Gli AuNS sono preferiti per gli esperimenti GUV a causa della loro capacità di generare un aumento di temperatura transitorio più elevato pur mantenendo una dimensione inferiore rispetto agli AuNP solidi.

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Tabella 1: Tabella per la determinazione della composizione GUV. Clicca qui per scaricare questa tabella.

5. Misure e analisi dei dati di risposta ANXA in esperimenti di puntura cellulare

  1. Utilizzare MATLAB per analizzare le immagini e per calcolare e tracciare il profilo di temperatura AuNP (Figura 1D, E) in base alle equazioni di Mie60,61.
  2. Inoltre, è possibile elaborare tutte le immagini confocali utilizzando la distribuzione FIJI ImageJ62,63.
  3. Calcolo del raggio dell'anello ANXA
    1. Ritagliare la regione di interesse contenente l'area perforata dai dati grezzi prima dell'analisi della lesione della membrana.
    2. Utilizza il flusso di lavoro interno di MATLAB per l'elaborazione di ogni immagine contrassegnando manualmente il centro dell'anello ANXA e il suo perimetro esterno.
      1. Utilizzare questi contrassegni per impostare i limiti di elaborazione per l'area di interesse.
        NOTA: L'area viene successivamente elaborata radialmente entro i limiti impostati e l'intensità della fluorescenza a una distanza specifica dal centro è la media sul cerchio completo con la stessa distanza dal centro. Questo numero viene memorizzato per ogni passo di raggio.
      2. Utilizzare il flusso di lavoro per adattare le intensità medie sull'intero intervallo di scansione a una curva gaussiana unidimensionale per identificare i massimi (Rp) e la larghezza completa a metà massimo (FWHM) corrispondenti rispettivamente a Rext e Rint, come illustrato nella Figura 3A.
    3. Infine, determinare il raggio dell'anello ANXA in base alla distanza dal centro dell'anello a Rext data dal grafico generato dal flusso di lavoro MATLAB.
  4. Calcolo tridimensionale del raggio dell'anello ANXA
    1. Traccia la variazione del raggio dell'anello ANXA nella direzione z utilizzando lo stesso flusso di lavoro di analisi MATLAB del passaggio 5.1. Applicare il flusso di lavoro a diverse sezioni Z confocali attraverso la membrana avvolta, come illustrato nella Figura 3C, E.
    2. Calcolare la pendenza per ogni avvolto in base alla variazione dei raggi sulle sezioni z, come illustrato nella Figura 3F.
  5. Evoluzione temporale del raggio dell'anello ANXA
    1. Allo stesso modo, è possibile monitorare l'evoluzione dell'anello ANXA dell'anello ANXA dopo la puntura termoplasmonica della membrana utilizzando il flusso di lavoro di analisi MATLAB dal passaggio 5.1. Analizzare punti temporali consecutivi per monitorare i cambiamenti nel tempo, come illustrato nella Figura 3D, G, H.

Risultati Rappresentativi

Nel presente studio, il metodo termoplasmonico viene utilizzato per studiare la risposta della proteina annessina alla rottura della membrana plasmatica; Tuttavia, qualsiasi proteina che può essere reclutata in seguito a una lesione della membrana può essere studiata utilizzando questo saggio, dato che la rispettiva proteina è marcata in modo fluorescente. Il reclutamento e la funzione delle proteine sono monitorati mediante imaging confocale sia nelle cellule renali embrionali umane (HEK293T) che nelle vescicole unilamellari giganti (GUV). Per approfondire, la Figura 2 illustra le condizioni sperimentali in cui un raggio laser NIR focalizzato a 1064 nm viene utilizzato per irradiare una singola AuNP (Figura 2A), provocando una lesione della membrana e un afflusso di Ca2+ nella cellula, attivando il meccanismo PMR. Successivamente, le annessine vengono rapidamente reclutate nel sito della lesione, dove si legano ai fosfolipidi caricati negativamente sul perimetro della ferita, formando una struttura ad anello in pochi secondi (Figura 2B, i-iv). Gli esperimenti di membrana modello, utilizzando GUV, hanno dimostrato che le punture di membrana sono state rapidamente risigillate in assenza di ANXA, come illustrato nella Figura 2C. Tuttavia, in presenza di ANXA, è stato osservato un rapido accumulo di ANXA nel sito della lesione dopo la puntura della membrana (Figura 2D). In particolare, ANXA ha continuato a far rotolare i bordi esposti, portando alla fine allo scoppio del GUV. Si ritiene che questo meccanismo di rotolamento derivi dalla capacità dell'ANXA di indurre curvatura e piegare le membrane lipidiche20.

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Figura 2: Risposta delle annessine (ANXA) alla rottura della membrana indotta dalla termoplasmonica. Inizialmente, (A) la membrana plasmatica funge da barriera tra l'ambiente extracellulare contenente alti livelli di ioni Ca2+ e l'ambiente intracellulare con ANXA incapsulati. Dopo l'irradiazione con un laser nel vicino infrarosso (NIR), l'AuNP genera un calore sostanziale, causando la rottura della membrana e provocando un afflusso di ioni Ca2+. Di conseguenza, viene attivato il meccanismo di riparazione della membrana plasmatica (PMR), che comporta il reclutamento di ANXA nel sito della lesione, dove si legano ai fosfolipidi caricati negativamente. (B-D) Le immagini al microscopio confocale di una cellula contenente ANXA2 e di un GUV contenente ANXA4 dimostrano questo processo. (i) Prima dell'irradiazione, le immagini mostrano una cella intatta, o GUV, con i siti di irradiazione indicati dalle frecce bianche. (ii) Dopo l'irradiazione con nanoparticelle, (B) gli ANXA vengono rapidamente reclutati nel sito della lesione, formando una struttura ad anello attorno alla membrana ferita (B [ii-iv]). Il pannello (C) mostra un GUV colorato con membrana senza ANXA, che, dopo la puntura, si richiude rapidamente senza rimodellamento osservabile della membrana. D'altra parte, il pannello (D) mostra un GUV contenente ANXA4 ricombinante, che è già legato alla membrana prima dell'irradiazione (i) a causa della fuoriuscita di Ca2+ attraverso la membrana. (ii) Al momento della puntura, ANXA4 si lega ai bordi liberi, causando il collasso del GUV mentre la membrana si allontana dal bordo. Le barre della scala misurano 10 μm per la figura (B), 2 μm per B (i), 10 μm per (C) e 15 μm per (D). Questa figura è riprodotta da Moreno-Pescador et. al16 con il permesso della Royal Society of Chemistry. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'analisi delle strutture anelliformi complete di ANXA (Figura 2B e Figura 1 supplementare) fornisce informazioni utili sulle dimensioni e sulla morfologia della ferita. Il raggio della struttura ad anello ANXA può essere determinato nel tempo e nello spazio, come descritto nella Sezione 5. Moreno et al.16 hanno analizzato oltre 135 lesioni della membrana plasmatica in cellule viventi, dove l'analisi delle strutture ad anello ANXA5 è illustrata nella Figura 3. Il raggio è stato determinato misurando la distanza dal centro dell'anello al raggio esterno della curva in base alla metà della larghezza massima del profilo di intensità collassato (Figura 3A). I risultati hanno illustrato una distribuzione eterogenea delle dimensioni dell'anello ANXA5 (Figura 3B), che è rimasta costante nel tempo (Figura 3D, G, H) e nello spazio (Figura 3C, E, F). Questi risultati suggeriscono un accumulo di ANXA5 intorno ai siti di lesione, indicativo di una strategia PMR alternativa mediata da ANXA5 nelle cellule viventi all'ipotizzata gemmazione a imbuto verso l'interno della membrana danneggiata5.

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Figura 3: Analisi delle strutture ad anello ANXA5 che circondano un sito di lesione in cellule viventi. (A) La rappresentazione schematica illustra l'approccio analitico, che si basa sulla metà della larghezza massima del profilo della linea di intensità ANXA. (B) L'istogramma illustra 135 raggi di anello ANXA5 misurati. (C) Profili della linea di intensità della fluorescenza attraverso un anello ANXA5-GFP per ciascuna sezione z dello z-stack. (D) Le immagini confocali illustrano l'evoluzione temporale di una ferita, in cui ANXA5-GFP si accumula sul perimetro della ferita subito dopo la lesione, seguita dalla stabilizzazione della ferita. Gli intervalli di tempo etichettati da 1 a 6 sono stati acquisiti a intervalli di 0,66 s per fotogramma. La barra della scala è di 2 μm. (E) I raggi delle ferite sono stati determinati in funzione della profondità della ferita in base al metodo presentato nel pannello A. (F) La pendenza della ferita è stata analizzata come raggi dell'anello ANXA5 in funzione dell'altezza z in base ai dati estratti dal pannello E. (G) I profili della linea di intensità della fluorescenza sono stati misurati attraverso l'anello ANXA5-GFP del pannello D, dove ogni intervallo di tempo 1-6 è indicato come sezione 1-6. Infine, (H) l'evoluzione temporale dei raggi dell'anello ANXA5-GFP è presentata in funzione del tempo calcolato dai dati nel pannello G. Questa figura è riprodotta da Moreno-Pescador et. al16 con il permesso della Royal Society of Chemistry. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Rispetto alle strutture ad anello formate dalla sola distruzione del PM (Figura 1 supplementare), le lesioni in prossimità del nucleo (Figura 2A supplementare) possono influenzare l'evoluzione e la geometria della ferita. Occasionalmente, solo una frazione degli anelli ANXA era evidente (Figura supplementare 2B,C), che può anche essere analizzata utilizzando il flusso di lavoro di analisi MATLAB interno (vedere la Sezione 5), anche se ulteriori dati potrebbero andare persi. Tipicamente, le formazioni di anelli ANXA osservate nelle cellule non aderenti (Figura 2C supplementare) sono localizzate vicino sia al nucleo che alla periferia della cellula. Di conseguenza, si può osservare una struttura ad anello più allungata, che non è ottimale per l'analisi dei dati presentati. Inoltre, le cellule non aderenti sembravano essere più suscettibili alla morte cellulare in seguito a lesioni da PM. Inoltre, quando si considerano le lesioni derivanti dall'irradiazione di aggregati AuNP, è importante notare che queste lesioni possono essere più gravi e meno controllabili. Ciò è dovuto al significativo aumento del riscaldamento plasmonico, che può danneggiare una grande frazione della cellula. Di conseguenza, tali lesioni non sono state incorporate nell'analisi dell'anello ANXA5.

Inoltre, i risultati preliminari indicano che la rottura della membrana plasmatica mediante termoplasmonica provoca elevati livelli intracellulari di Ca2+ . Ciò è stato osservato anche all'irradiazione a bassa intensità di singole AuNP, suggerendo la permeabilizzazione del PM35, come illustrato nella Figura 4. L'afflusso di Ca2+ è stato osservato nelle cellule che esprimono una sonda di calcio legata alla membrana, GCaMP6s-CAAX, che subisce un cambiamento conformazionale all'afflusso di Ca2+ e, quindi, si può osservare un aumento della sua intensità64. L'intensità del calcio è stata quantificata per l'intera impronta della cellula nel tempo. Per eliminare il rumore di fondo, il livello di Ca2+ di fondo è stato sottratto prima della rottura della membrana e della riparazione post-membrana. L'intensità massima è stata determinata normalizzando l'intensità media di Ca2+ all'interno della cellula, risultando in una curva di intensità che mostra un rapido aumento iniziale dell'intensità di Ca2+ seguito da una diminuzione più lenta, come illustrato nella Figura 4B.

La cellula ha raggiunto un'intensità massima di calcio a ~ 6,6 s, il che è coerente con i risultati di Klenow et al.64, che hanno suggerito che il tempo del picco di intensità del calcio (t = tc) corrisponde al tempo necessario per la chiusura della ferita. Tuttavia, mentre sono necessarie ulteriori indagini per stabilire il meccanismo alla base della riparazione della membrana e della guarigione delle ferite, i risultati preliminari hanno mostrato che questo processo di Ca2+ è stato osservato esclusivamente nella cellula danneggiata e non nella cellula non lesa utilizzata come controllo positivo. Ciò conferma che la cellula ha sperimentato l'afflusso di Ca2+ in seguito alla rottura della membrana termoplasmonica, in cui il calcio intracellulare in eccesso viene attivamente pompato fuori dopo il successo della PMR poiché il livello di calcio intracellulare non è più in competizione con l'afflusso di Ca2+ , raggiungendo infine l'omeostasi cellulare64.

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Figura 4: L'afflusso di calcio si verifica quando la membrana plasmatica di una cellula HEK293T viene rotta dalla termoplasmonica. Una serie di immagini confocali mostra due cellule (la cellula di interesse e una cellula non lesa utilizzata come controllo positivo) che esprimono la sonda di calcio legata alla membrana, GCaMP6s-CAAX. La barra della scala misura 10 μm. (A) Prima dell'irradiazione, alle 00:00 s, l'impronta delle due celle è visualizzata dalla linea tratteggiata grigia e il sito di irradiazione è indicato dal cerchio giallo. Dopo l'irradiazione laser, si osserva un rapido afflusso di Ca2+ , che raggiunge l'intensità massima a ~ 6,6 s, indicata dalla linea tratteggiata arancione, un punto temporale che si presume corrisponda al momento di chiusura della ferita64. (B) Il profilo di intensità del calcio ottenuto dalla sonda GCaMP6s-CAAX nella cellula lesa (linea blu) è stato confrontato con l'intensità di Ca2+ in una cellula vicina non danneggiata (linea tratteggiata grigia), mostrando un chiaro afflusso di Ca2+ esclusivamente in caso di interruzione del PM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Lo studio evidenzia l'approccio termoplasmonico come una tecnica promettente per esplorare le risposte proteiche nelle cellule viventi e modellare le membrane a seguito della rottura della membrana. Questo metodo non solo fornisce ampie informazioni sul reclutamento delle proteine, ma anche sulla funzione biofisica delle proteine coinvolte nella dinamica proteina-membrana. Di conseguenza, facilita l'identificazione dei componenti molecolari responsabili della riparazione superficiale e fa progredire la comprensione del complesso ma vitale meccanismo di riparazione della membrana plasmatica. Sebbene esistano vari metodi per indurre la rottura della membrana, come tecniche meccaniche, chimiche e ottiche, questi metodi soffrono di limitazioni, come essere non specifici per le cellule, generare lesioni multiple alla membrana cellulare o causare danni significativi alla membrana e ablare il materiale cellulare interno lungo il percorso laser quando si utilizzano laser pulsati ad alta potenza. Sebbene l'integrazione della microscopia confocale e delle pinzette ottiche offra le informazioni più complete, potrebbero essere utilizzate anche modalità di imaging alternative. Ad esempio, poiché l'imaging della nanoparticella plasmonica si ottiene utilizzando la microscopia a riflessione, una modalità di imaging incorporata nei microscopi confocali Leica, ulteriori tecniche di imaging, come la microscopia in campo oscuro65,66, altri metodi di scattering come iSCAT67,68 o la marcatura fluorescente della nanoparticella, potrebbero essere impiegate per la visualizzazione AuNP, anche se ciò potrebbe limitare l'applicabilità del metodo.

Il metodo presentato è inoltre in grado di indurre fori nanoscopici nelle membrane modello, consentendo lo studio degli effetti sinergici tra diverse annessine. Ciò si ottiene incapsulando annessine ricombinanti marcate in modo diverso, ad esempio RFP e GFP, rispettivamente, seguite da puntura termoplasmonica. Questo sistema modello fornisce informazioni su come le annessine interagiscono con le membrane in prossimità dei bordi liberi, come dimostrato nella Figura 2D. Tuttavia, a differenza delle cellule, i fori inflitti ai GUV continuano ad espandersi, seguiti dalla destabilizzazione della vescicola. L'imaging dell'evoluzione del foro mediante microscopia confocale può essere difficile a causa della rapida espansione del diametro del foro, ma può essere ottenuto catturando diverse pile z nel tempo. Un metodo alternativo sarebbe quello di utilizzare un disco rotante confocale per un imaging più veloce. Inoltre, l'approccio termoplasmonico produce in genere un numero limitato di risultati ottimali all'ora quando viene applicato a singole cellule o esperimenti GUV, di solito da due a tre, a temperature del campione comprese tra 20 °C e 30 °C. Per ottenere un'osservazione più accurata della dinamica proteina-membrana, si raccomanda di conservare le cellule in un tampone contenente HEPES e di sostituire il campione ogni ora. In alternativa, la finestra sperimentale potrebbe essere estesa eseguendo gli esperimenti in una camera di incubazione cellulare, cioè a una temperatura costante di 37 °C con il 5% di CO2 . Inoltre, la combinazione di questo approccio con altre tecniche di imaging, come la microscopia stocastica a ricostruzione ottica (STORM), potrebbe fornire una comprensione più approfondita della funzione biofisica e dell'interazione delle proteine chiave coinvolte nella riparazione della membrana a livello di singola molecola. Ciò potrebbe fornire informazioni dettagliate sul sito della lesione, compresa la geometria della ferita e la posizione delle proteine annessina, nonché identificare altri attori chiave coinvolti nella riparazione della superficie della membrana.

Al fine di ottenere la massima efficacia e precisione nell'indurre lesioni alla membrana, è imperativo verificare la posizione del fuoco laser prima di ogni esperimento e assicurarsi che la posizione assiale del fuoco laser coincida con il fuoco confocale. Questo allineamento ottimizza l'intensità durante l'imaging AuNP, il che porta a un massimo aumento della temperatura locale e alla conseguente lesione della membrana a una potenza laser inferiore. Questo processo viene eseguito manualmente e quindi suscettibile di variabilità nell'efficienza di rottura della membrana poiché il fuoco viene tradotto manualmente in una posizione che coincide con la posizione della particella. Nei microscopi che non dispongono di una modalità di riflessione, come in alcuni sistemi commerciali, la co-localizzazione del fuoco laser e della particella può essere impegnativa. In questi casi, è possibile utilizzare modalità di imaging alternative (ad esempio, campo chiaro) e eseguire una scansione raster lenta intorno alla posizione prevista della particella. Va notato che è probabile che una bassa potenza laser induca solo la permeabilizzazione della membrana, mentre un'elevata potenza laser può generare temperature intorno al NP che superano il punto di ebollizione dell'acqua, anche se la superficie del vetro ha un effetto di raffreddamento. Si stima che la formazione di nanobolle che circondano le NP avvenga tra 200 °C e 300 °C25,48, dove il calore esplosivo può provocare lo spostamento delle particelle dal fuoco laser o la frammentazione delle particelle. Inoltre, la formazione di nano o microbolle durante il riscaldamento rappresenta una sfida per questo metodo. Poiché l'aria si interfaccia con le membrane deumidificate e può causare la destabilizzazione delle proteine, il che è indesiderabile, è imperativo limitare il riscaldamento quando si studia la riparazione della membrana. In particolare, i nanogusci d'oro non tollerano le alte temperature e si degradano in queste condizioni, come dimostrato dalla microscopia ad alta risoluzione58.

Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per l'utilizzo della termoplasmonica per eseguire punture altamente localizzate nelle membrane, applicabile sia alle cellule che alle membrane modello. Per ridurre ulteriormente l'entità del riscaldamento, è possibile utilizzare nanoparticelle più piccole che risuonano con la luce NIR, consentendo punture intracellulari negli endosomi, nel reticolo endoplasmatico e nell'involucro nucleare. Tali nanoparticelle, tra cui bastoncelli e nanomatrioske48, possono essere utilizzate per studiare la riparazione dell'involucro nucleare prendendo di mira le nanoparticelle d'oro endocitate che vengono prontamente assorbite sulla superficie cellulare e trafficate verso il nucleo69. Nel complesso, questa tecnica consente l'identificazione e l'esame dei componenti molecolari chiave coinvolti nella PMR, chiarendo la loro funzione biofisica e il loro ruolo, preservando al contempo la vitalità delle cellule.

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Desideriamo ringraziare Jesper Nylandsted per averci fornito le proteine annessine ricombinanti e i plasmidi che codificano per le annessine. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal Consiglio danese per la ricerca indipendente, Scienze naturali (DFF-4181-00196), dal Programma di sinergia interdisciplinare della Fondazione Novo Nordisk 2018 (NNF18OC0034936), dal Comitato scientifico della Società danese per il cancro (R90-A5847-14-S2), dalla Fondazione Lundbeck (R218-2016-534) e dal Centro di eccellenza della Fondazione Lundbeck (Biomembrane in nanomedicina).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1064 nm trapping laserSpectra PhysicsN/ASpectra Physics J201-BL-106C, Nd: YVO4 NIR laser
160 nm Gold NanoshellsNanoComposixNCXGSIR150
200 nm Gold NanoparticlesBBI SolutionsEM.GC200/7
35 mm glass surface MatTex microwellMATTEKP35G-1.5-14-C
Amber-glass vialsSupelco Sigma Aldrich243438
Annexin A2 plasmidsN/AN/AReceived from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
Annexin A4 recombinant-protein N/AN/AN-terminal GFP tagged ANXA4 received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
Annexin A5 recombinant-protein N/AN/AN-terminal GFP tagged ANXA5 received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
beta-caseinSigma Life ScienceC6905-1G
CaCl2Suprlco (sigma Aldrich)10035-04-8
Centrifuge 5702Eppendorf5702
ChloroformVWR Chemicals67-66-3
Culture dish (Nunclon Delta Surface)Thermo scientific150460
DID cell-labelling SolutionInvitrogen 7757
Distilled waterGibco15230-089
DOPCAvanti Polar Lipids850375CDissolved in chloroform 
DOPSAvanti Polar Lipids840035CDissolved in chloroform
Dulbecco's Modified Eage's MediumThermo Fisher Scientific11995065
FIJI ImageJ distributionImageJ2N/A
GCaMP6s-CAAXN/AReceived from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
Gibco Fetal Bovine SerumFisher Scientific1157339710% of the culture medium
GlucosePROLABO24 374.297
Hamilton syringesHamilton CompanyN/A50 and 500 microliters
Harrick Plasma Cleaner PDG-002Harrick PlasmaN/A
HEK293T cellsN/AReceived from our collaborator at the Danish Cancer Research Center
Leica Acousto-Optical Beam Splitter (AOBS)LeicaN/A
Leica PL APO 63x water immersion objective, NA = 1.2LeicaN/A
Leica SP5 confocal scanning microscopeLeicaN/A
LipofectamineFisher Scientific15338030
MatLabThe Mathworks, Inc., Natick, Massachusetts, United StatesN/A
NaClVWR Chemicals7647-14-5
Opti-MEM Reduced-Serum MediumThermo Fisher Scientific11058021
ParafilmBemisPM-992
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific151401221% of the culture medium
Phosphate Buffered Saline (PBS)Thermo Fisher Scientific10010023
Piezoelectric stage (PI 731.20) Physik Instrumente (Germany)N/A
Poly-L-LysineSigma-AldrichP8920-100ML0.01-0.1% for coating
Polyvinyl alcoholSigma-Aldrich363065-25G
round glass slide 25 mm ØVWR631-1584
Sonicator Brandson 2800BrandsonN/A
sucroseSigma Life Science57-50-1
T25 tissue culture flaskFalcon353108Blue Vented cap
Tris-HClInvitrogen 15567-027
TrypLEThermo Fisher ScientificA1285901
Trypsin-EDTAFisher Scientific11590626
 VWR Mixer mini vortex 230V EUVWR 12620-84 ECN: 444-2790, SN: 150713022

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