Nous reconnaissons Melissa Grunlan pour des discussions utiles sur la formation de SAM. Cette recherche a été financée en partie par la Fondation Robert A. Welch (A-1585).

Préparation des réactifs Préparer un tampon PIPES (80 mM PIPES, 1 mM de MgCl2, 1 mM EGTA, ajusté à pH 6,8 avec KOH). Aliquoter et glucose oxydase magasin, la catalase et de glucose à -70 ° C et le taxol à -20 ° C selon les protocoles existants. Aliquoter et 1,2 tubuline conserver à -70 ° C selon les instructions fournies par le fournisseur. Motif microélectrodes Au utilisant la lithographie <ol><li> Couper des tranches de silicium de 1 cm &#39;1,5 cm en utilisant des substrats un scribe ou un cutter plaquette. Nettoyer les substrats en les plaçant dans un bécher avec de l&#39;acétone suffisante pour les couvrir et soniquer pendant 5 minutes. Sans laisser sécher les substrats, les rincer dans de l&#39;acétone fraîche, puis rincer immédiatement dans de l&#39;azote à l&#39;aide d&#39;isopropanol et sec. </li><li> Fabriquer microélectrodes Au sur les substrats propre en utilisant la norme, positive-ton photolithographie ou lithographie par faisceau d&#39;électrons, en fonction de la taille des fonctionnalités souhaitées. 3 Lors de la conception de la géométrie modèle, garder le diamètre de chaque motif d&#39;électrode en dessous de 100 microns afin d&#39;assurer la couverture par les PEG SAM (décrits dans la section suivante). Inclure des plots de contact (~ 300 mm 2) positionnée 300 à 500 mm du modèle avec une ligne de 1 mm reliant le pad avec l&#39;électrode (fig. 1). Placez les motifs lithographiques près du milieu du substrat pour permettre à l&#39;espace autour du modèle pour l&#39;assemblage de la chambre d&#39;écoulement. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1390/1390fig1thumb.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Géométrie de l&#39;échantillon. S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1390/1390fig1.jpg">cliquez ici</a> pour voir une version agrandie de la figure 1. </li><li> Après le développement du motif dans la couche résister, rayer une ligne dans la résistance de la plage de contact sur le bord du substrat en utilisant une pince à épiler (Fig. 1). Dès le dépôt de métal, le scratch va permettre le contact électrique entre l&#39;électrode et le bord du substrat. Une chambre de dépôt, de préférence avec deux sources, est utilisé pour déposer la couche de métal. Les électrodes sont formées par des dépôts de 2 nm de Cr (pour adhésion) suivie de 6 nm d&#39;Au, sans casser le vide. Une microbalance à quartz équipée intérieur de la chambre peut être utilisée pour mesurer l&#39;épaisseur des films lors du dépôt. </li></ol> Préparer le SAM <ol><li> Préchauffer le four et dans un endroit bien aéré à 75 ° C. Préparer la solution de silanisation en ajoutant 20 ml de toluène dans un bécher de verre de 250 ml. Puis ajoutez 1 ml de PEG-silane (soit 5% v / v) pour le toluène à l&#39;aide d&#39;une pipette en plastique. Mélanger dans le PEG-silane bien par aspiration et une baisse de 5 à 10 fois et ensuite en remuant avec la pipette pendant 30 secondes. </li><li> Placer les échantillons à motifs dans le bécher avec le côté à motifs vers le haut, en s&#39;assurant qu&#39;ils sont complètement immergés dans la solution de PEG-silane toluène et sont espacés uniformément sur tout le fond du bécher. Placer le bécher dans le four et faire cuire 18 à 21 heures à 75 ° C. Alors que le SAM est en forme, de préparer la contre (voir ci-dessous) et monter les composants supplémentaires requis pour les étapes restantes. </li><li> Après 18 à 21 heures dans le four, le toluène doit s&#39;évaporer en laissant les échantillons motifs dans une visqueuse de PEG-silane résidus. Ajouter 20 ml de toluène dans le bécher et laisser tremper les échantillons pendant 1-2 minutes. Retirer les échantillons du bécher et rincer avec du toluène, puis l&#39;isopropanol, et enfin sèche à l&#39;azote. A ce point, les échantillons doivent look propre et la couche SAM devrait être invisible à l&#39;œil nu. SAM préparés de cette façon sont utilisables pour jusqu&#39;à deux jours lorsqu&#39;il est entreposé dans des conditions sèches fraîches (25 ° C, humidité modérée). Échec des résultats de formation SAM dans un revêtement de résidus teintes nuageuses ou inégale à la surface. </li></ol> Fabriquer la contre- Dans la configuration même chambre de dépôt utilisé pour le dépôt de microélectrodes, faire une contre en déposant 1 nm de Cr, suivie de 4 nm de Au sur un 22 x 50 mm n ° 1 ou n ° lamelle de verre 0. La contre-devrait être presque transparent avec une légère teinte grise ou rose. Magasin de la contre-couché côte dans une boîte de Pétri pour le garder propre. Tubuline polymérise dans MTS <ol><li> Décongelez sans étiquette de la tubuline et la tubuline rhodamine et immédiatement se combinent à un ratio de 1:2 étiquetés sans étiquette pour obtenir brillante MTs. Mélanger à la pipette et à plusieurs reprises. Polymérisent la tubuline pendant 20-40 minutes dans un bain d&#39;eau chauffée à 37 ° C. La longueur de la SMT sera plus grande pour les temps de polymérisation plus long. Alors que la polymérisation de la tubuline est, préparer un tampon PIPES-taxol en ajoutant le taxol à 20 mm dans un tube à centrifuger contenant un tampon PIPES. Mélanger le taxol bien par aspiration et refoulement à plusieurs reprises et vortex, puis placer le tube dans le bain chauffé à 37 ° C. Après polymérisation, diluer le SCM en 1 / 100 dans chaude TUBES-taxol tampon et le bouclierde la lumière. MT préparés de cette façon seront allongés au fil du temps et du faisceau, qui peut être réduite par une dilution supplémentaire. </li><li> Préparer un mélange d&#39;oxygène 10x balayage (OS) en combinant 30 ml de tampon PIPES froide (0-4 ° C), 5 ml de 50% de 2-mercaptoéthanol, 5 glucose oxydase ml, 5 ml de catalase, et 5 ml de glucose à 2. Le glucose devrait être ajouté en dernier. Mélanger par aspiration et refoulement 3-5 fois après l&#39;ajout de chaque composant. Placer le mélange sur la glace OS, il restera en vigueur pendant environ 2 heures. </li><li> Vérifiez que la polymérisation MT a été un succès et que les MTS sont stables sous plusieurs minutes d&#39;excitation de fluorescence par l&#39;imagerie de la MT préparés avec 1x OS mix. Pour l&#39;imagerie des MTs préparés de cette façon, veillez à utiliser une combinaison d&#39;excitation / émission filtre approprié pour la fluorescence rhodamine. Déterminer la dilution mieux travailler pour les filaments individuels d&#39;imagerie en poursuivant la dilution de la SCM en 1 / 10-1 / 100 en utilisant un tampon PIPES et l&#39;imagerie avec 1x OS mix. </li><li> Préparer une chambre d&#39;écoulement en sandwich une lamelle de verre de grande taille (22 x 50 mm) et petites (22 x 22 mm) avec deux morceaux de scotch double-face placé 2-3 mm d&#39;intervalle. La bande est facilement coupé en lanières en le plaçant sur une lame de verre et la coupe avec une lame de rasoir. Présentez quelques microlitres de MTS dans la cellule de flux en utilisant une micropipette. Pour l&#39;imagerie à fort grossissement, les objectifs à longue distance de travail peuvent être nécessaires pour l&#39;imagerie de la surface supérieure de la chambre de flux. La distance de la surface de la lamelle / échantillon à la surface supérieure de la chambre d&#39;écoulement est déterminée par l&#39;épaisseur de la bande et devrait être de 60 à 100 mm. </li></ol> Motif MTS à l&#39;aide d&#39;électrophorèse <ol><li> Préparer une chambre d&#39;électrophorèse en plaçant deux fines bandes de scotch double-face à travers l&#39;échantillon à motifs, SAM-revêtement tels que l&#39;électrode est entre les bandes avec le chemin reliant perpendiculaire à la bande (Fig. 2). Placer la contre sur la bande double-face avec le côté métallique de toucher la bande de telle sorte que le bord de la surplombe l&#39;échantillon de la contre-d&#39;environ 3 mm (Fig. 2). Coupez plusieurs longueurs de 15 cm de fil de cuivre isolé aimant et la bande de 1 cm de l&#39;isolation hors des deux extrémités. Attacher un fil à la zone exposée au pair du substrat en utilisant une petite goutte de peinture argentée tout en prenant soin d&#39;éviter de faire un contact électrique avec la contre-(ceci peut être vérifié avec un multimètre). Fixez un second fil à la contre avec de la peinture argentée. Fils attachés avec de la peinture d&#39;argent peut être encore fixé sur les échantillons avec du ruban adhésif. <img src="/files/ftp_upload/1390/1390fig2thumb.jpg" border="0" alt="Figure 2" /> Figure 2. Ensemble de la cellule de débit pour un microscope inversé à fluorescence. S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1390/1390fig2.jpg">cliquez ici</a> pour voir une version agrandie de la figure 2. </li><li> Présentez-MT à la dilution désirée en utilisant un tampon PIPES combinée avec l&#39;OS à 1x concentration finale. Image à un grossissement de 20x et de localiser le motif sur la plaquette de silicium avant d&#39;appliquer une tension. Optionnellement, la chambre de circulation peuvent être scellés à l&#39;aide de vernis à ongles pour empêcher l&#39;écoulement du fluide et la migration MT dans le plan de la chambre d&#39;écoulement. </li><li> Appliquer une tension de 1 V et observer la migration de MTS. Basse tension (jusqu&#39;à environ 0,5 V) peut être utilisé si le piégeage réversible de MTS est souhaitée, mais cela nécessite d&#39;étanchéité de la chambre d&#39;écoulement pour éviter la dérive latérale. Vernis à ongles fonctionne bien pour sceller les extrémités ouvertes de la chambre d&#39;écoulement. Des tensions supérieures à environ 0,7 V, une certaine adhérence MT peut être vu sur le schéma, mais il sera faible. Des tensions supérieures à environ 0,9 V, la migration MT sera plus rapide, et l&#39;adhésion sera plus forte. Au-dessus de 1,2 V la probabilité pour l&#39;électrolyse induisant (formation de bulles de gaz) et aussi pour détruire les micro-électrodes augmente considérablement. La migration peut être suivi en ajustant le plan vertical du foyer du microscope. Si elle est effectuée correctement, le MTS de localiser à la surface des électrodes. </li></ol>

<ol>
	<li>Rai-Choudhury, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Microlithography, Micromachining, and Microfabrication: Microlithography. , (1997).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

La migration des MTS est facilement visualisée en utilisant la microscopie à fluorescence en raison de leur luminosité et la fluorescence de fond faible. La méthode est généralement applicable à la structuration de biomolécules, comme il exige seulement que les biomolécules être amené à porter une charge nette par un ajustement approprié du pH tampon. L&#39;électro-osmose est évitée dans cette configuration, car il n&#39;ya pas de surfaces chargées tels que les murs de la silice utilisée en électropho...

N ° 1 des lamelles de verre borosilicate (22 x 50 mm) ont été achetés auprès de VWR. Poli de qualité électronique de type p &lt;111&gt; des plaquettes de silicium ont été achetés auprès d&#39;Addison Engineering, Inc haute pureté peinture argentée a été obtenu à partir de structure de la sonde, Inc (Catalogue # 5001 AB). Isolé fil fin en cuivre de calibre aimants (~ 0,08 mm (0,003) de diamètre) peuvent être obtenus auprès de sociétés d&#39;approvisionnement électronique.

antifouling self-assembled monolayers on microelectrodes for patterning biomolecules

Nous présentons une procédure pour former un poly (éthylène glycol) (PEG) triméthoxysilane monocouche auto-assemblées (SAM) sur un substrat de silicium avec des microélectrodes d&#39;or. Le PEG-SAM est formé dans une étape d&#39;assemblage simple et évite l&#39;encrassement biologique sur des surfaces de silicium et de l&#39;or. Le SAM est utilisé pour microélectrodes robe à motifs à la norme, positive-ton lithographie. Utilisation de la microtubules comme un exemple, nous appliquons une tension continue de provoquer la migration électrophorétique à l&#39;électrode de SAM enduit de manière réversible. Une chambre d&#39;écoulement est utilisé pour l&#39;imagerie de la migration électrophorétique et de structuration des microtubules<em&gt; In situ</em&gt; En utilisant la microscopie à épifluorescence. Cette méthode est généralement applicable à la structuration de biomolécules, comme il emploie électrophorèse d&#39;immobiliser des molécules cibles et ne nécessite donc pas d&#39;interactions moléculaires spécifiques. En outre, elle évite les problèmes rencontrés en tentant de configuration des molécules SAM directement en utilisant des techniques de lithographie. La compatibilité avec la lithographie par faisceau d&#39;électrons permet que cette méthode soit utilisée pour des biomolécules modèle à l&#39;échelle nanométrique.

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Antifouling Self-assembled Monolayers on Microelectrodes for Patterning Biomolecules

Nous présentons une procédure pour former un poly (éthylène glycol) monocouche auto-assemblées (PEG-SAM) sur un substrat de silicium avec des microélectrodes d&#39;or. Le PEG-SAM est formé en une seule étape et prévient l&#39;encrassement biologique sur des surfaces de silicium et de l&#39;or. L&#39;électrophorèse est ensuite utilisé pour des biomolécules patterning jusqu&#39;à l&#39;échelle nanométrique.

Antifouling monocouches auto-assemblées sur les microélectrodes pour des biomolécules Modélisation

We present a procedure for forming a poly(ethylene glycol) (PEG) trimethoxysilane self-assembled monolayer (SAM) on a silicon substrate with gold ...

antifouling-self-assembled-monolayers-on-microelectrodes-for

Research

JoVE Journal

Biology

11.4K vues.  Texas A&M University (TAMU). Nous présentons une procédure pour former un poly (éthylène glycol) monocouche auto-assemblées (PEG-SAM) sur un substrat de silicium avec des microélectrodes d'or. Le PEG-SAM est formé en une seule étape et prévient l'encrassement biologique sur des surfaces de silicium et de l'or. L'électrophorèse est ensuite utilisé pour des biomolécules patterning jusqu'à l'échelle nanométrique.

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Patterning Cells on Optically Transparent Indium Tin Oxide Electrodes

The ability to exercise precise spatial and temporal control over cell-surface interactions is an important prerequisite to the assembly of multi-cellular constructs serving as in vitro mimics of native tissues.  In this study, photolithography and wet etching techniques were used to fabricate individually addressable indium tin oxide (ITO) electrodes on glass substrates.  The glass substrates containing ITO microelectrodes were modified with poly(ethylene glycol) (PEG) silane to make them protein and cell resistive.  Presence of insulating PEG molecules on the electrode surface was verified by cyclic voltammetry employing potassium ferricyanide as a redox reporter molecule.  Importantly, the application of reductive potential caused desorption of the PEG layer, resulting in regeneration of the conductive electrode surface and appearance of typical ferricyanide redox peaks.    Application of reductive potential also corresponded to switching of ITO electrode properties from cell non-adhesive to cell-adhesive. Electrochemical stripping of PEG-silane layer from ITO microelectrodes allowed for cell adhesion to take place in a spatially defined fashion, with cellular patterns corresponding closely to electrode patterns.  Micropatterning of several cell types was demonstrated on these substrates.   In the future, the control of the biointerfacial properties afforded by this method will allow to engineer cellular microenvironments through the assembly of three or more cell types into a precise geometric configuration on an optically transparent substrate.

Non-fouling PEG silane monolayer was desorbed from individually addressable ITO electrodes on glass by application of a reductive potential. Electrochemical stripping of PEG-silane layer from ITO microelectrodes allowed for cell adhesion to take place in a spatially defined fashion, with cellular patterns corresponding closely to electrode patterns.

Cellules Patterning sur des électrodes d&#39;indium optiquement transparents Tin Oxide

The ability to exercise precise spatial and temporal control over cell-surface interactions is an important prerequisite to the assembly of multi-cellular ...

Recherche

Biologie

Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such as tumor growth, stem cell differentiation, and stem cell self-renewal. A number of methods currently exist to modulate cell signaling in vitro. One method of modulating the total amount of diffusible signaling is to vary the cell seeding density during culture. Due to the random nature of cell seeding, this results in considerable variation in the actual cell-cell spacing and amount of cell-cell contact, and cannot prescribe the local environment. A more specific approach for modulating cell signaling is to use molecular inhibitors or genetic approaches to knock down specific signaling proteins, but both of these methods are best suited to manipulating small numbers of molecules. Here, we demonstrate a new approach to modulating cell-cell signaling that modulates the local environment of a cluster of cells by placing different numbers of cells at desired locations on a substrate. This method provides a complementary way to control the local diffusible and juxtacrine signaling between cells. Our method makes use of the Bio Flip Chip (BFC), a microfabricated silicone chip containing hundreds-to-thousands of microwells, each sized to hold either a single cell or small numbers of cells. We load the chip with cells simply by pipetting them onto the array of wells and washing unloaded cells off the array. The chip is then flipped onto a substrate, whereby the cells fall out of the wells and onto the substrate, maintaining their patterning. After the cells have attached, the chip can be removed (or left on). This approach to cell patterning is unique in that it: 1) doesn't alter the chemistry of the substrate, thus allowing cells to proliferate and migrate; 2) allows patterning onto any substrate, including tissue-culture polystyrene, glass, matrigel, and even feeder cell layers; and 3) is compatible with traditional microcontact printing, allowing the creation of extracellular matrix islands with cells placed inside those islands. In this video, we demonstrate the patterning of mouse embryonic stem cells onto tissue-culture polystyrene using the BFC.

We demonstrate a simple method for placing cells at desired locations on a substrate. This method patterns cells by flipping a silicone chip containing microwells filled with cells onto the substrate. This method provides a new way to modulate diffusible and juxtacrine signaling between cells.

Modélisation des cellules souches embryonnaires utilisant la puce Bio Retourner

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such ...

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, such as nucleic acids and proteins. Single molecule FRET (sm-FRET) measurements on immobilized molecules permit long observations of the system -effectively until both dyes photobleach- resulting in time-traces that report on biomolecular dynamics with a broad range of timescales from milliseconds to minutes. To facilitate the acquisition of large number of traces for statistical analyses, the process must be automated and the sample environment should be tightly controlled over the entire measurement time (~12 hours). This is accomplished using an automated scanning confocal microscope that allows the interrogation of thousands of single molecules overnight, and a microfluidic cell that permits the controlled exchange of buffer, with restricted oxygen content and maintains a constant temperature throughout the entire measuring period. Here we show how to assemble the microfluidic device and how to activate its surface for DNA immobilization. Then we explain how to prepare a buffer to maximize the photostability and lifetime of the fluorophores. Finally, we show the steps involved in preparing the setup for the automated acquisition of time-resolved single molecule FRET traces of DNA molecules.

In this article we describe how we obtain FRET traces from individual DNA molecules immobilized to a surface using an automated scanning confocal microscope.

Système automatisé pour les simples mesures de fluorescence de la molécule de surface immobilisée Biomolécules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

Profilage Single Cell transcriptionnelle des cardiomyocytes de souris adultes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific properties, such as binding affinity, agonist or antagonist behavior, or stability, relative to the native sequence. Protein design lies at the center of current advances drug design and discovery. Not only does protein design provide predictions for potentially useful drug targets, but it also enhances our understanding of the protein folding process and protein-protein interactions. Experimental methods such as directed evolution have shown success in protein design. However, such methods are restricted by the limited sequence space that can be searched tractably. In contrast, computational design strategies allow for the screening of a much larger set of sequences covering a wide variety of properties and functionality. We have developed a range of computational de novo protein design methods capable of tackling several important areas of protein design. These include the design of monomeric proteins for increased stability and complexes for increased binding affinity.
To disseminate these methods for broader use we present Protein WISDOM (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>), a tool that provides automated methods for a variety of protein design problems. Structural templates are submitted to initialize the design process. The first stage of design is an optimization sequence selection stage that aims at improving stability through minimization of potential energy in the sequence space. Selected sequences are then run through a fold specificity stage and a binding affinity stage. A rank-ordered list of the sequences for each step of the process, along with relevant designed structures, provides the user with a comprehensive quantitative assessment of the design. Here we provide the details of each design method, as well as several notable experimental successes attained through the use of the methods.

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

We developed computational de novo protein design methods capable of tackling several important areas of protein design. To disseminate these methods we present Protein WISDOM, an online tool for protein design (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>). Starting from a structural template, design of monomeric proteins for increased stability and complexes for increased binding affinity can be performed.

Protéines SAGESSE: un plan de travail pour<em&gt; In silico</em&gt;<em&gt; De novo</em&gt; Conception de biomolécules

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing molecules of interest to fluorescent proteins such as GFP to study their expression, localization and function. However, GFP and its derivatives are significantly larger and less photostable than organic fluorophores generally used for in vitro experiments, and this can limit the scope of investigation. 
We recently introduced a straightforward, versatile and high-throughput method based on electroporation, allowing the internalization of biomolecules labeled with organic fluorophores into living microorganisms. Here we describe how to use electroporation to internalize labeled DNA fragments or proteins into Escherichia coli and Saccharomyces cerevisi&#230;, how to quantify the number of internalized molecules using fluorescence microscopy, and how to quantify the viability of electroporated cells. Data can be acquired at the single-cell or single-molecule level using fluorescence or FRET. The possibility of internalizing non-labeled molecules that trigger a physiological observable response in vivo is also presented. Finally, strategies of optimization of the protocol for specific biological systems are discussed.

Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.

Internalisation et l&#39;Observation des Biomolécules Fluorescent In Living micro-organismes par électroporation

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Mesure et analyse de la production extracellulaire acide pour Déterminer glycolytique Taux

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

Isolement des régions génomiques spécifiques et l&#39;identification des molécules associées par enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein functions, for example, by changing enzymatic activity or by mediating interactions. Precise quantification of site-specific protein acylation occupancy, or stoichiometry, is essential for understanding the functional consequences of both global low-level stoichiometry and individual high-level acylation stoichiometry of specific lysine residues. Other groups have reported measurement of lysine acetylation stoichiometry by comparing the ratio of peptide precursor isotopes from endogenous, natural abundance acylation and exogenous, heavy isotope-labeled acylation introduced after quantitative chemical acetylation of proteins using stable isotope-labeled acetic anhydride. This protocol describes an optimized approach featuring several improvements, including: (1) increased chemical acylation efficiency, (2) the ability to measure protein succinylation in addition to acetylation, and (3) improved quantitative accuracy due to reduced interferences using fragment ion quantification from data-independent acquisitions (DIA) instead of precursor ion signal from data-dependent acquisition (DDA). The use of extracted peak areas from fragment ions for quantification also uniquely enables differentiation of site-level acylation stoichiometry from proteolytic peptides containing more than one lysine residue, which is not possible using precursor ion signals for quantification. Data visualization in Skyline, an open source quantitative proteomics environment, allows for convenient data inspection and review. Together, this workflow offers unbiased, precise, and accurate quantification of site-specific lysine acetylation and succinylation occupancy of an entire proteome, which may reveal and prioritize biologically relevant acylation sites.

Here, we present unbiased quantification of site-specific protein acetylation and/or succinylation occupancy (stoichiometry) of an entire proteome through a ratiometric analysis of endogenous modifications to modifications introduced after quantitative chemical acylation using stable isotope-labeled anhydrides. In combination with sensitive data-independent acquisition mass spectrometry, accurate site occupancy measurements are obtained.

Quantification des protéines spécifiques au site Lysine acétylation et stoechiométrie Succinylation spectrométrie de masse indépendante des données Acquisition

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell culture, termed senolytics, can reduce the senescent cell burden in vivo and extend healthspan. Multiple classes of senolytics have been identified to date including HSP90 inhibitors, Bcl-2 family inhibitors, piperlongumine, a FOXO4 inhibitory peptide and the combination of Dasatinib/Quercetin. Detection of SA-&#946;-Gal at an increased lysosomal pH is one of the best characterized markers for the detection of senescent cells. Live cell measurements of senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) activity using the fluorescent substrate C12FDG in combination with the determination of the total cell number using a DNA intercalating Hoechst dye opens the possibility to screen for senotherapeutic drugs that either reduce overall SA-&#946;-Gal activity by killing of senescent cells (senolytics) or by suppressing SA-&#946;-Gal and other phenotypes of senescent cells (senomorphics). Use of a high content fluorescent image acquisition and analysis platform allows for the rapid, high throughput screening of drug libraries for effects on SA-&#946;-Gal, cell morphology and cell number.

SA-&amp;#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cellular senescence is the key factor in the development of chronic age-related pathologies. Identification of therapeutics that target senescent cells show promise for extending healthy aging. Here, we present a novel assay to screen for the identification of senotherapeutics based on measurement of senescence associated &#946;-Galactosidase activity in single cells.

Essai de dépistage basé sur sA-MD-Galactosidase pour l'identification des médicaments sérothérapeutiques

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...