Cette méthode démontre l’étalonnage de la quantité de protéines quantifiantes dans l’échantillon liquide avec un processus de molécule unique pour le comptage. Plus précisément, il peut illustrer comment les populations de protéines peuvent être étiquetées fluorescentement à chaque niveau de molécule. Les méthodes précédentes ont effectué des mesures en vrac pour analyser les ratios molaire des molécules fluorescentes et protéiques, mais elles ne peuvent pas révéler comment les populations hétérogènes de protéines sont effectivement étiquetées.
Nos méthodes peuvent le faire directement au niveau d’une molécule unique. Notre méthode peut être étendue aux analyses de concentration moléculaire ultrasensibles et avancées, qui mèneront aux méthodes diagnostiques futures, permettant des résultats efficaces des molécules pathogènes dans les spécimens. Notre méthode peut être appliquée à l’analyse des espèces de protéines à l’aide d’anticorps fluorescents, ainsi qu’à l’analyse de plusieurs espèces à l’aide d’étiquettes non spécifiques pour toutes les protéines séparées par électrophoresis ou chromatographie.
Le point le plus critique de la technique est l’obtention de la reproductibilité des données. Je recommande de garder la même condition expérimentale autant que possible lors de la mesure de plusieurs échantillons. Démonstration visuelle de cette technique fournira comment rendre chaque étape expérimentale stable et reproductible.
Il montrera également une certaine étape rare dans les protocoles de biochimie, tels que le spin-enduit et le lavage des couvertures de microscope. Pour commencer cette procédure, préparez le tampon de lysing et 1%Tween-20 tel que décrit dans le protocole de texte. Utilisez de l’hydroxyde de sodium pour ajuster le pH à 12.
Mélangez 100 microlitres de tampon de lysing avec un microlitre d’un DDT molaire et quatre microlitres de 50%CHAPS. Ajoutez un microlitre de la culture cellulaire préparée et homogénéisez la solution en letant le pipetting pour éviter les bulles. Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant cinq minutes avec une légère agitation.
Ensuite, réhomogènez la solution en la pipetage de haut en bas lentement. Ajouter un microgramme de colorant Cy3 NHS ester et homogénéiser la solution en ralentissant le pipetage pour éviter les bulles. Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 10 minutes avec une légère agitation.
Répétez ce processus, en ajoutant la même quantité de colorant et en couveant l’échantillon une fois. Ajouter 100 microlitres d’hydroxyde HEPES-sodium molaire de 0,8 molaire pour ajuster le pH de la solution à 7,2 et étancher la réaction. Pipette lentement de haut en bas pour homogénéiser la solution.
Ensuite, ajoutez 20 microlitres de biotine-2-amine et cinq microlitres d’EDC. Homogénéisez la solution en faisant monter et descendre lentement. Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant une heure avec une légère agitation.
Après cela, utilisez une colonne d’ultrafiltration avec une coupure de 10 kiloDalton pour enlever les réetrions d’étiquetage non réagis et concentrer l’échantillon. Après avoir effectué la norme SDS-PAGE pour l’échantillon de protéines et une échelle moléculaire, imagez le gel pour identifier l’emplacement des bandes protéiques. Utilisez une lame tranchante pour découper les portions de gel qui comprennent des fractions de protéines d’intérêt en fonction de l’emplacement des bandes.
Tout d’abord, définissez des glissements de couverture de 22 millimètres par 22 millimètres et d’une épaisseur de 0,15 millimètre. Utilisez un nettoyant plasma pour exposer les coverslips au plasma d’air pendant une minute pour nettoyer et activer leurs surfaces. Ensuite, utilisez un revêtement spin pour faire tourner les coverslips avec 200 microlitres de tampon avadin pendant cinq secondes à 500RPM, suivie de 30 secondes à 1000RPM.
Incuber les coverslips à température ambiante pendant 15 minutes pour les laisser sécher à l’air libre. Pour préparer des coverslips pour l’échantillon de protéine, utilisez un échantillon de protéine qui a été dilué. Placer 100 microlitres de l’échantillon dilué sur le centre des couvre-t-ils recouverts d’avadin.
Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 15 minutes. Pour préparer le contrôle positif, placez 100 microlitres de biotine fluorescente purifiée dans cinq hydroxyde micromolaire HEPES-sodium au pH 7.2 au centre d’un coverslip recouvert d’avadin. Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 15 minutes.
Pour préparer le contrôle négatif, spin coat plasma coverslips avec 200 microlitres de cinq hydroxyde HEPES-sodium avec deux milligrammes par millilitre de BSA sans avadin. Ajouter 100 microlitres à la biotine fluorescente purifiée dans cinq hydroxyde micromolaire HEPES-sodium au pH 7,2. Incuber dans l’obscurité pendant 15 minutes à température ambiante.
Après cela, rincer chaque coverslip avec 200 microlitres d’eau distillée par pipetting sur les bords, en s’assurant de ne pas toucher le milieu de la coverslip avec la pointe pipette. Répétez ce lavage trois fois. Ensuite, exposez un nombre égal de nouvelles couvertures au plasma d’air pendant une minute.
Placez un coverslip nettoyé sur chaque coverslip lié à l’échantillon pour éviter le séchage. Démarrez un microscope à fluorescence à champ large ou évanescent. Réglez un coverslip sur le microscope et trouvez la mise au point.
Ensuite, effectuez un balayage de tuile pour obtenir au moins 100 images. Dans cette étude, l’homogénéité d’étiquetage de chaque espèce de protéine étiquetée dans les cellules est quantifiée après séparation avec SDS-PAGE. Les données brutes d’image pour différentes fractions de poids moléculaire des protéines du lysate de cellules HeLa, ainsi que les contrôles positifs et négatifs, sont vus ici.
Bien que l’échantillon de protéines et le contrôle positif présentent entre 100 et 500 taches par image, le contrôle négatif présente très peu ou pas. Cela montre que le processus inhibe suffisamment la liaison non spécifique des tétines à la surface du coverslip. Les histogrammes d’intensité ponctuelle pour les échantillons de protéines et le contrôle positif présentent de multiples pics, qui représentent la liaison stochastique des tétines aux amines primaires dans les protéines et les structures de tétramer d’avadin respectivement.
Tous les spots ont montré des photobleaching clignotants et stepwise avec l’excitation continue de laser, mettant en évidence l’observation au niveau simple de molécule. L’occupation de l’étiquetage, ou LO, est ensuite calculée à partir du rapport entre le nombre de taches dans chaque échantillon de protéines et celui du contrôle positif. Le LO mesuré à partir de l’échantillon de lysate de cellules HeLa varie de 50% pour la plus petite fraction de poids moléculaire, à 90% pour la fraction de poids moléculaire plus élevée.
Le LO pour l’échantillon protéome entier sans séparation est considéré comme 72%Il est essentiel d’utiliser des réaménageurs fraîchement faits et d’éviter toute poussière, en particulier pendant la préparation des coverslips. À la suite de cette procédure, une seule molécule comptant l’analyse dans un certain volume peut être effectuée pour quantifier les concentrations de chaque protéine. Par exemple, l’analyse sur n’importe quel produit brut, ou gel et produits d’électrophoresis capillaires, peut être effectuée.
Cette technique ouvre la voie à l’utilisation de l’imagerie par fluorescence à molécule unique à la médecine moléculaire, à la chimie organique et à l’analyse omique. En comblant le concept entre concentration et nombres. L’hydroxyde de sodium concentré est corrosif, et une protection adéquate doit être portée lors de sa manipulation.
En outre, le rayonnement laser de haute puissance peut causer des dommages oculaires, ainsi les lunettes protectrices peuvent être portées.
