L’objectif global de cette procédure est d’étudier la désensibilisation et la récupération de sensibilité des photorécepteurs d’écrevisses en fonction du temps circadien, en utilisant des enregistrements électriques intercellulaires de cellules photoréceptrices dans des stocks oculaires isolés, en utilisant la configuration discontinue de pince à tension unique commutée. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurobiologie, telles que la dépendance circadienne du temps de tant de propriétés électrophysiologiques des photorécepteurs dans l’inactivation et la récupération. Le principal avantage de cette technique, c’est qu’elle permet de mesurer l’activité électrique des photorécepteurs.
Malgré la difficulté d’isoler les cellules et sans déranger le milieu intracellulaire. Les docteurs Carolina Barriga-Montoya et Araceli de la O-Maritnez, collègues de notre laboratoire, feront la démonstration de cette procédure. Pour préparer l’électrode intracellulaire, tirez sur le tube capillaire en verre à l’aide d’un puller micropipette pour obtenir une pointe fine avec une petite ouverture.
Ensuite, remplissez le verre capillaire tiré avec une solution de chlorure de potassium de 2,7 molaires par capillarité, puis remplissez la moitié de la pipette avec une aiguille d’injection fine. Si nécessaire, appuyez sur la pipette d’électrode pour éliminer les bulles d’air. Après cela, placez l’électrode sur son support.
Connectez le support à l’étage avant de l’amplificateur avec l’amplificateur. Par la suite, placez le premier étage du support d’électrode avec un micromanipulateur 3D stable. Baisser l’électrode jusqu’à ce que la solution de bain couvre sa pointe.
Sélectionnez le mode pont de l’amplificateur et mesurez la résistance aux électrodes. Assurez-vous que la résistance est d’environ 50 mégaohms. Annulez le courant offset et compensez les transitoires capacitifs à l’aide du bouton de position de fixation dans la pince de tension de section de l’amplificateur et du bouton neutralisation de capacitance dans la section Microelectrode 1 de l’amplificateur.
Pour construire le système de super fusion, versez la solution de bain dans un réceptacle approprié et connectez-le à un ensemble de tubes d’irrigation, reliant ainsi la chambre d’enregistrement. Utilisez un système de superfusion par gravité. Réglementez le débit à 0,5 millilitres par seconde.
Connectez la chambre à un dispositif d’aspiration. Réglementez le système d’aspiration de solution avec une pompe à vide de telle sorte que le volume total de la chambre d’enregistrement ne varie pas. Pour isoler le stock oculaire d’une écrevisse adulte, détachez-le de la base avec une paire de ciseaux fins.
Faire une ouverture d’un millimètre carré dans la cornée dorsale à l’aide d’une lame de rasoir pour accéder à la rétine. Ensuite, placez le stock oculaire au centre de la chambre d’enregistrement avec l’ouverture de la rétine face vers le haut. Gardez le stock d’yeux dans l’obscurité pendant 20 minutes.
Placez la microélecrodée parallèlement à l’axe longitudinal des stocks oculaires de telle sorte que la microélecrode soit centrée pour accéder à la rétine. Utilisez un microscope stéréoscopique pour placer les appareils dans la bonne configuration. Ensuite, surveillez la différence de tension entre les électrodes de référence et d’enregistrement en sélectionnant le mode pont de l’amplificateur.
Abaissez l’électrode dans le bain et placez-la juste au-dessus de la rétine. Retirez le microscope et placez la lampe photostimulateur parallèle à l’axe longitudinal des stocks oculaires. Ensuite, abaissez lentement la microélecrode jusqu’à ce qu’une chute de tension soudaine soit détectée.
Par la suite, fournir un flash de lumière d’essai pour enregistrer le potentiel récepteur du photorécepteur. Pour obtenir des enregistrements appropriés des courants lumineux, il est essentiel de faire une bonne déficience d’une cellule photoréceptrice saine. Dans cette procédure, serrez la tension au potentiel mesuré de membrane de repos de la cellule en sélectionnant l’amplitude de fixation dans le logiciel d’acquisition de données.
Ensuite, sélectionnez le mode DSEVC de l’amplificateur. Dans la section mode de l’amplificateur, sélectionnez le bouton SEVC et passez le levier au Discont. position SEVC.
Réglez le taux de commutation à 500 à 1000 hertz, tel que déterminé par la vitesse de l’électrode. Après cela, livrer un flash de lumière et d’observer le flux d’ion évoqué. Ensuite, livrer une paire d’impulsions lumineuses et appliquer le deuxième flash après un intervalle de temps désiré.
Numérisez les courants à l’échantillonnage de 10 kilohertz avec le logiciel d’acquisition de données et enregistrez les données pour analyse hors ligne. Il est indiqué ici un protocole à deux impulsions. Des stimulus légers ont été appliqués à zéro millisecondes et 700 millisecondes.
Ce chiffre montre la récupération de la désensibilisation. Voici la reprise de la latence, voici le pic de récupération actuelle, et voici le temps de désensibilisation constante tau récupération. Des expériences ont été réalisées à zéro heure circadienne.
Ce chiffre montre la récupération de la désensibilisation en fonction du temps circadien. Il s’agit de la récupération iP, c’est la récupération L, et c’est la récupération tau, et ce graphique montre les constantes de temps pondérées. Les processus biphasiques sont marqués d’une flèche.
Une fois maîtrisée, cette technique peut être effectuée en deux heures, si elle est faite correctement. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de viser un faible bruit et un faible courant de fuite, l’affaiblissement photorécepteur. Suivant cette procédure, d’autres méthodes, comme les analyses pharmacologiques, peuvent être faites afin de répondre à d’autres questions, comme la participation de canaux particuliers, récepteurs ou voies de signalisation.
Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la neurobiologie pour explorer la dépendance circadienne du temps des propriétés électrophysiologiques des cellules photoréceptrices. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’étudier la désensibilisation et la récupération du courant de transduction activé par la lumière en utilisant la technique d’enregistrement intracellulaire.
