Cette méthode pourrait aider à résoudre les problèmes clés dans les domaines de la virologie et de la microbiologie liés à l’énumération des bactériophages à partir d’échantillons complexes et de diagnostics et thérapeutiques à base de bactériophage. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une quantification efficace et précise du temps d’un grand nombre d’échantillons provenant d’expériences de biopannage d’affichage de phages qui ne sont pas réalisables avec les essais traditionnels. Rashmi Mohanty et Jasmim Leal, étudiants diplômés de mon laboratoire, démontreront la procédure.
Après avoir conçu les amorces et créé une concentration de stock, obtenir l’ADN de phage T7 de référence à une concentration de 0,1 microgramme par microlitre. En utilisant de l’eau ultrapure, diluer en série cet ADN décuplé, d’un million de femtogrammes par microlitre à un femtogramme par microlitre dans des tubes PCR de 0,2 millilitre. Préparer 20 microlitres de chaque concentration, en s’assurant de changer les pointes de pipette et vortex les tubes entre chaque étape de la dilution.
Ensuite, convertir la concentration d’ADN de référence t7 phage des femtogrammes par microlitre en copies du génome par microlitre. Tout d’abord, pipette 200 microlitres du clone de phage T7 échantillon dans un tube de centrifugeuse micro de 1,5 millilitre pour chacun des 10 échantillons désirés. Ajouter deux microlitres de DNase un à chaque tube.
Capez les tubes et incubez à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes dans un bain sec chauffé. Puis incuber à 100 degrés Celsius pendant 15 minutes dans un bain sec chauffé. Centrifugeuse les tubes contenant les phages traités à la chaleur à 18, 534 fois g pendant 10 secondes.
Placez les tubes centrifugés sur un mélangeur vortex réglé en mode activation tactile pendant 10 secondes pour mélanger les phages. Tournez à nouveau à 18, 534 fois g pendant 10 secondes. Après cela, laissez les échantillons sur le banc de laboratoire environ une heure pour les refroidir à température ambiante.
Préparer le prémémix qPCR pour 10 échantillons de phages biopannés de concentration inconnue et sept échantillons de concentrations standard en triplicate. Résultant en un prémétrage pour 51 échantillons contenant 255 microlitres de mélange principal qPCR, 51 microlitres d’amorces et 102 microlitres d’eau. Aliquot huit microlitres du mélange PCR préparé en 51 puits d’une plaque qPCR de 96 puits.
Ajoutez ensuite deux microlitres d’échantillons de phages T7 traités à la chaleur à chacun de ces puits, en les distribuant sous la surface du prémémix qPCR. À l’aide d’un film adhésif, sceller la plaque. Envelopper la plaque dans du papier d’aluminium pour minimiser le blanchiment des photos de fluorescence, puis procéder à l’utilisation de la plaque sur l’équipement qPCR.
Configurer les conditions de cycle et les paramètres de la courbe de fusion tels qu’ils sont décrits dans le protocole texte. Une fois le qPCR exécuté, la parcelle d’amplification, la parcelle de courbe de fusion et la parcelle multicomposante sont analysées à partir des données brutes. La parcelle d’amplification indique si l’amplification PCR de chaque échantillon est réussie ou non.
La parcelle multicomposante représente l’amplification et la décomposition du signal fluorescent tout au long des cycles d’amplification. Alors que la parcelle de courbe de fusion est utilisée pour valider la spécificité des amorces, puisque chaque produit PCR a une température de fusion unique. La courbe standard est ensuite générée à partir de l’ADN de référence.
Ici, l’efficacité de l’amplification est calculée à 92,4% Les données représentatives d’une étude qPCR sont ensuite comparées au même phage qui ont été quantifiés par un essai de plaque à double couche à la gamme testée de 10 à 10 millions d’exemplaires du génome par microlitre. Comme on le voit ici, le nombre de phages dans la quantitation qPCR est plus élevé que dans l’analyse de plaque. La répétabilité de la méthode qPCR telle que représentée par le coefficient de variance est considérée comme avoir des valeurs allant de 2,85 à 27,2%Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler qu’il existe de nombreuses considérations dans le développement et l’utilisation de qPCR pour quantifier avec précision les phages, y compris le traitement soigneux et la préparation des échantillons et l’étalonnage de l’équipement pertinent.
Suivant cette méthode, d’autres techniques peuvent être réalisées afin d’énumérer les particules de phage dans une variété d’applications incluses dans le biopannage vivo, la préparation de l’ADN de la bibliothèque de phages et la détection de séquençage et de phage de prochaine génération dans des échantillons environnementaux complexes. N’oubliez pas que les phages sont considérés comme des dangers biologiques en laboratoire et que les précautions telles que l’équipement de protection individuelle, y compris les gants et les blouses de laboratoire, doivent toujours être portées pendant l’exécution de la procédure.
