Cette méthode permet de perturber la structure et la fonction cellulaires par la fusion de deux types de cellules différents pour répondre à des questions telles que la façon dont les cellules réagissent aux changements dans le nombre d’organelles. En élisant les protéines étiquetées fluorescentes dans les cellules fusionnées, les structures cellulaires peuvent être référencées à leur type d’origine cellulaire pour étudier les mécanismes de l’homéostasie et de la fonction organelles. Pour l’étiquetage des colorants fluorescents, voir les populations de cellules cancéreuses humaines d’intérêt de telle sorte que chaque culture aura augmenté à au moins six fois 10 à la sixième cellule à une confluence de 70 à 90% d’ici le lendemain matin.
Le jour de l’étiquetage, laver deux fois les cellules de rootletine eGFP et de rootletin-mScarlet avec 10 millilitres de PBS par lavage. Diluer le colorant violet à 500 nanomolaires dans le colorant PBS et Far Red cell à 200 nanomolar dans PBS. Étiquetez les cellules eGFP de rootletin avec le colorant dilué de cellules violettes et les cellules de rootletin-mScarlet avec le colorant dilué de globule rouge lointain pendant une minute à la température ambiante.
À la fin des incubations, arrêter les réactions avec 10 millilitres de DMEM pendant cinq minutes. Lavez les deux cultures cellulaires étiquetées et une culture cellulaire parentale non étiquetée avec 10 millilitres de PBS frais avant d’incuber toutes les cultures avec un millilitre de trypsine préchaurée. À la fin de l’incubation, transférer les solutions cellulaires détachées dans des tubes coniques individuels de 15 millilitres pour centrifugation et résusuer doucement les granulés étiquetés de teinture dans un millilitre de PBS et les cellules non étiquetées dans un millilitre de DMEM.
Retournez ensuite tous les échantillons de cellules à l’incubateur de culture cellulaire. Pour l’expérience de fusion cellulaire, mélanger 500 microlitres de colorant violet étiquetés cellules avec 500 microlitres de colorants far red étiquetés cellules dans un nouveau tube de 15 millilitres et sédimenter les cellules non mélangées restantes étiquetées par centrifugation. Resuspendez les granulés dans un millilitre de DMEM frais et placez les cellules dans l’incubateur.
Recueillir les cellules mélangées par centrifugation et ajouter 700 microlitres de 50%1450 PEG d’une manière drop-wise à la pastille sur une période de 30 secondes. Après 3,5 minutes à température ambiante, ajouter 10 millilitres de DMEM sans sérum sur une période de 30 secondes et placer les tubes dans l’incubateur pendant 10 minutes. À la fin de l’incubation, sédimenter les cellules mélangées par centrifugation et resuspendre doucement la pastille en un millilitre de milieu complet.
Pour enrichir pour la population cellulaire fusionnée par FACS, filtrez doucement toutes les cellules dans des tubes FACS individuels à travers une passoire de 70 micromètres et créez des diagrammes de dispersion vers l’avant par rapport à la dispersion latérale et à la discrimination des doublets dans le logiciel de cytomètre. Exécutez les cellules non étiquetées pour enregistrer leur intensité de fluorescence et créer des barrières pour identifier les cellules fusionnées. Ensuite, exécutez les cellules étiquetées de colorant violet positif unique pour confirmer qu’il n’y a pas de débordement du signal violet dans le canal rouge lointain et les cellules étiquetées de colorant far red positif unique pour confirmer qu’il n’y a pas de signal rouge lointain dans le canal violet.
Ensuite, exécutez brièvement l’échantillon de fusion pour confirmer que les cellules fusionnées sont visibles avec ces portes. Lorsque les paramètres de tri ont été définis, alignez le flux de tri centralement dans un plat d’imagerie de huit puits contenant 100 microlitres de milieu de croissance et triez les cellules fusionnées doublement positives directement dans le plat. Lorsque toutes les cellules ont été triées, placez immédiatement le plat dans l’incubateur de culture cellulaire pendant deux à 16 heures.
Pour la coloration immunofluorescente, remplacez d’abord le supernatant de culture cellulaire par 200 microlitres de 4% de paraformaldéhyde pour une incubation de 15 minutes à température ambiante. À la fin de la fixation, laver les cellules trois fois avec 200 microlitres de PBS par lavage avant de perméabiliser les cellules dans 200 microlitres de 0,1% de surfactant non ionique pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, bloquez la liaison non spécifique avec 200 microlitres d’albumine de sérum 3% bovin dans PBS pendant 30 minutes à température ambiante, suivi de l’étiquetage avec les anticorps d’intérêt dans 150 microlitres de tampon de coloration.
Après une heure à température ambiante, laver les cellules deux fois dans 300 microlitres de PBS pendant cinq minutes par lavage. Après le dernier lavage, remplacer le lavage par 200 microlitres de PBS frais. Pour obtenir des images des cellules fusionnées, utilisez un microscope à fluorescence approprié capable d’imagerie en quatre couleurs et de recueillir des images tridimensionnelles.
Les cellules dûment étiquetées sont visibles pendant la cytométrie du flux par signal fluorescent à un niveau plus élevé que les cellules de contrôle non étiquetées. Les portes peuvent être fixées pour le tri à enrichir pour la population de cellules double positif directement dans les plats d’imagerie pour une analyse microscopique plus approfondie. La fusion induit un réarrangement majeur de l’architecture cellulaire par le mélange de deux cellules en une seule.
Les heterokaryons sont identifiés comme des cellules contenant les deux signaux fluorescents de colorant mélangés à l’intérieur d’une seule cellule sans intervenir dans les membranes plasmatiques. En outre, deux noyaux peuvent également être visibles dans les cellules fusionnées par imagerie Brightfield. La structure et la fonction cellulaires peuvent faire l’objet d’études plus approfondies grâce à la fusion de cellules contenant des protéines étiquetées meGFP et mScarlet.
La fusion entraîne un doublement du nombre centrosome à l’intérieur des heterokaryons visibles comme au moins quatre foyers matériels péricentriolaires lorsque le composant péricentriolaire centrosome NEDD1 est étiqueté fluorescentement. La fusion des cellules avec de la rootlétine taguée de façon endogène permet d’identifier la cellule d’origine de chaque centrosome dans un hétérokaryon. Ce protocole montre comment fusionner les lignées cellulaires étiquetées différemment et comment imager leurs organites pour comprendre leur structure et leur fonction.
Ce protocole robuste est à la fois relativement facile et relativement peu coûteux à exécuter par rapport à des méthodes similaires. Cette technique peut être utilisée pour poser une série de questions telles que la façon dont la fusion organelle est réglementée et comment les cellules réagissent aux changements dans le nombre d’organelles subcellulaires.
