IPSC Differentiation into Posterior Primitive Streak and Nephrogenic Intermediate Mesoderm

Commencez par laver les cellules souches pluripotentes induites ou cellules iPS sur la plaque à 6 puits revêtue d’une matrice membranaire avec deux millilitres de DPBS. Aspirez le DPBS à l’aide d’une pipette. Ensuite, ajoutez un millilitre de la solution de détachement cellulaire disponible dans le commerce pour détacher les cellules iPS.

Placez ensuite la cellule dans un incubateur à 37 degrés pendant cinq minutes. Pipetez maintenant un millilitre de mTeSR sur les cellules iPS, en vous assurant que les cellules se sont séparées de la surface en plastique. Centrifugez ces cellules à 400g pendant trois minutes à température ambiante.

Remettez la pastille cellulaire en suspension, puis comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Ensuite, ensemencez une gamme de densités cellulaires sur une plaque à 6 puits qui a été recouverte d’une matrice membranaire. Cultivez-les avec de la mTeSR complétée par un inhibiteur de la Rho-kinase à 10 micromolaires.

Cultivez les plaques pendant la nuit dans un incubateur à dioxyde de carbone réglé à 37 degrés Celsius. Le lendemain, aspirez le mTeSR et lavez les cellules avec deux millilitres de DPBS. Ensuite, ajoutez deux millilitres de milieu de stade 1 aux cellules.

Placez ensuite les cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant quatre jours. Le quatrième jour, retirez le milieu de stade 1 et lavez les cellules avec deux millilitres de DPBS. Ajoutez ensuite deux millilitres de milieu de stade 2 aux cellules avant d’incuber les cellules comme précédemment.

Du jour zéro au quatrième jour, les cellules iPS se sont rapidement développées et ont pris des formes rhomboïdales ou triangulaires. La confluence a atteint 90 à 100% et s’est accumulée uniformément jusqu’au septième jour. Lors de la culture en suspension, les agrégats forment spontanément des structures néphroniques après s’être dissociés au septième jour.