Récoltez les cellules MCF-7 par centrifugation à 560-G pendant trois minutes, à quatre degrés Celsius. Ajoutez 500 microlitres de RL-1 tamponné à cinq fois 10 aux six cellules et mélangez soigneusement jusqu’à ce qu’aucune masse cellulaire ne soit visible. Ensuite, transférez les homogénats cellulaires dans une colonne de nettoyage de l’ADN intégrée dans le tube de prélèvement.
Centrifuger les échantillons à 85-50-G pendant deux minutes, à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, retirez la colonne de nettoyage de l’ADN, en retenant le surnageant dans le tube de prélèvement. Ajouter 800 microlitres de tampon RL-2 et 500 microlitres de surnageant, et mélanger délicatement.
Ensuite, transférez 700 microlitres du mélange dans une colonne d’ARN uniquement intégrée dans le tube de collecte. Centrifugez le tube à 8, 550 G pendant une minute, à quatre degrés Celsius. Jetez ensuite l’écoulement dans le tube de collecte.
Lavez d’abord la colonne d’ARN uniquement avec 500 millilitres de tampon RW-1, puis avec 700 millilitres de tampon RW-2, en centrifugeant pendant une minute à 8 550 G et quatre degrés Celsius à chaque lavage. Après avoir retiré le RW-2 résiduel par centrifugation à nouveau, transférez la colonne d’ARN uniquement dans un nouveau tube de collecte. Ajoutez 100 microlitres d’eau déminéralisée sans ARN, préchauffée à 65 degrés Celsius au centre de la membrane dans la colonne d’ARN uniquement, et attendez deux minutes.
Ensuite, centrifugez à 8 550 G pendant une minute, à quatre degrés Celsius pour recueillir la solution d’ARN. Configurez le mélange réactionnel pour la PCR, puis définissez les conditions de réaction PCR du système. Exécutez la procédure de PCR QRT.
La PCR QRT a montré que le traitement par cylindricité favorisait l’expression génique des facteurs pro-apoptotiques, CC-9, CC-7, CC-3, vim et vax, tout en inhibant l’expression génique de l’anti-apoptotique BCL-2. De plus, l’administration de cylindricide a réduit les niveaux d’expression génique de PI-3K, AKT, M-tor, HIF1-Alpha et Fox-01.
