Commencez par remettre en suspension le peptide lyophilisé MOG 35 55 dans l’eau. Diluez le stock peptidique à 10 microgrammes par millilitre dans un tampon de revêtement avant l’expérience. Maintenant, pipetez 100 microlitres de la solution finale dans les puits d’une plaque de 96 puits.
Enduire simultanément un nombre égal de puits avec 100 microlitres de BSA dissous dans un tampon de revêtement. Scellez la plaque avec un film adhésif pour éviter l’évaporation et incubez la plaque pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, effectuez trois lavages de la plaque avec 200 microlitres de PBS complétés par 0,5% entre 20.
Ajouter ensuite 100 microlitres par puits d’une solution de blocage composée de 3% de BSA dans du PBS. Incuber la plaque scellée pendant une heure à 37 degrés Celsius dans un four d’hybridation. Après l’incubation, laver la plaque trois fois avec 200 microlitres par puits de PBST.
Diluer chaque échantillon de sérum obtenu à partir du sang de souris immunisées par l’EAE dans une solution bloquante et ajouter 100 microlitres par puits aux puits enrobés de MOG 35, 55 et BSA. Ajouter le même volume de solution de blocage aux puits vierges désignés. Incuber la plaque scellée pendant deux heures à température ambiante en secouant constamment.
Après l’incubation, retirez la plaque de l’incubateur et rincez-la trois fois avec 200 microlitres par puits de PBST. Diluez l’anticorps secondaire conjugué HRP dans une solution composée de 0,2 % de BSA dans du PBST et ajoutez 100 microlitres dans chaque puits. Incuber la plaque scellée pendant une heure à température ambiante en maintenant une agitation constante.
Laver la plaque trois fois avec 200 microlitres par puits de PBST. Ajoutez 100 microlitres de substrat de tétraméthylbenzidine à trois, trois primes, cinq, cinq premières dans chaque puits. Incuber dans l’obscurité pendant une à cinq minutes en surveillant le développement d’une couleur bleue.
Ajouter 100 microlitres de solution d’arrêt dans chaque puits. Ensuite, utilisez un lecteur de plaques réglé à une longueur d’onde de 450 nanomètres pour mesurer la densité optique dans chaque puits. Les valeurs de densité optique des échantillons EAE étaient significativement plus élevées que celles des échantillons témoins, indiquant une réponse robuste d’immunoglobuline G contre le peptide MOG.
