Commencez par télécharger les demi-cartes non affûtées de l’apo-énolase à partir de données supplémentaires dans EMDB. Ouvrez ensuite ChimeraX et cliquez sur Ouvrir dans la barre d’outils. Sélectionnez les demi-cartes d’apo-enolase.
Tapez ceci dans la ligne de commande pour combiner les demi-cartes et obtenir la carte non netteté apo-énolase. Ajustez le seuil de la carte à 0,0595 pour réduire le bruit. Tapez ensuite cette commande pour renommer la carte combinée.
Cliquez sur Ouvrir. Sélectionnez les demi-cartes non nettes PEP enolase et tapez cette commande dans la ligne de commande. Ajustez le seuil de la carte à 0,0721 pour réduire le bruit et renommer la carte.
Affichez ensuite les cartes non nettes apo-enolase et PEP enolase et cliquez sur Ajuster dans le panneau Carte pour calculer une carte de différence. Tapez cette commande dans la ligne de commande pour soustraire la carte PEP énolase de la carte apo-énolase et ajuster le seuil. Colorez la carte soustraite en vert, pour indiquer une densité positive.
Ensuite, ouvrez PDB et téléchargez les coordonnées de mycobacterium tuberculosis octameric enolase. Ensuite, dans ChimeraX, cliquez sur Ouvrir dans la barre d’outils et sélectionnez le nom du fichier. Cliquez sur Affichage des molécules, Masquer les atomes et Afficher le dessin animé.
Tapez cette commande pour renommer le modèle. Sélectionnez le modèle dans le panneau Modèle. Cliquez avec le bouton droit de la souris dans la barre d’outils.
Cliquez ensuite sur Déplacer le modèle et positionnez le modèle à proximité de la carte énolase PEP. Alignez le modèle par rapport à la carte. Intégrez ce modèle dans la carte non accentuée PEP enolase en tapant cette commande dans la ligne de commande.
Vérifiez l’ajustement. Ajustez la représentation des couleurs et de la structure. Ouvrez Coot depuis le terminal en tapant coot&Cliquez sur Fichier, puis Ouvrir les coordonnées, et sélectionnez Apo-enolase.pdb.
Ensuite, téléchargez la carte aiguisée de l’énolase liée au PEP sur EMDB. Affichez cette carte dans Coot en cliquant sur Fichier et Ouvrir la carte. Faites défiler le bouton central de la souris pour définir le seuil sur 7,00 sigma.
Cliquez sur Valider, puis sur Unmodeled Blobs. Dans la nouvelle fenêtre, tapez 7.00 comme RMSD et cliquez sur Rechercher des objets blob. Localisez la densité de ligands non modélisée près des résidus du site actif, sérine 42, lysine 386 et arginine 364.
Ensuite, cliquez sur Fichier, Obtenir le monomère, et entrez PEP pour obtenir le fichier de modèle du monomère PEP à partir de la bibliothèque Coot Monomer. Déplacez la molécule PEP jusqu’à la densité à l’aide de l’option Rotation Traduire la molécule de la chaîne de zones dans le menu latéral. Cliquez ensuite sur Zone raffinée de l’espace réel dans le menu latéral pour adapter la molécule de PEP à la densité.
Évaluez l’ajustement et cliquez sur Accepter lorsque vous avez terminé. Utilisez l’option Fusionner la molécule de l’onglet Modifier pour fusionner le ligand ajusté avec le modèle apo-énolase et enregistrer le modèle sous le nom PEP enolase.pdb. Cliquez ensuite sur Calculer, Outils NCS, puis sur Ligands NCS pour ajouter des ligands au reste des monomères dans le fichier de coordonnées.
Pour l’option protéine avec NCS, sélectionnez le fichier de coordonnées apo-énolase. pdb et l’ID de chaîne A en tant que chaîne maîtresse NCS. Ensuite, pour la molécule contenant le ligand, sélectionnez l’apo-énolase.
pdb comme fichier de coordonnées, ID de chaîne J et numéro de résidu 121. Cliquez sur Trouver des postes candidats. Cliquez sur les ligands candidats individuels et analysez visuellement l’ajustement.
Modélisez ensuite deux ions magnésium dans la densité du site actif en cliquant sur Placer l’atome au pointeur et en sélectionnant MG dans la liste Type d’atome du pointeur. Ajoutez également les ions magnésium dans les monomères liés à la symétrie. Évaluez l’ajustement des atomes de magnésium liés à la symétrie.
Enregistrez le modèle en cliquant sur Fichier, puis sur Enregistrer les coordonnées. Sélectionnez le nom du fichier et tapez enolase plus PEP plus MG.pdb. Ouvrez ensuite l’interface graphique de Phoenix.
Exécutez un véritable travail d’affinement de l’espace à l’aide des paramètres par défaut avec le modèle enregistré et la carte affinée liée à PEP. Pour visualiser le ligand modélisé, ouvrez PyMOL, cliquez sur Fichier et Ouvrir pour charger le modèle affiné à partir de la tâche de raffinement Phoenix. Chargez également la carte affinée liée à PEP.
Renommez la carte en PEP sharped en cliquant sur Actions, puis sur Renommer. Sélectionnez ensuite les ligands en cliquant sur Affichage puis sur Séquence. Tapez ceci dans la ligne de commande et appuyez sur Entrée.
Cela découpe la densité de la carte autour de la sélection. Cliquez sur la dernière case, C, à côté de l’objet mesh_ligand pour changer la couleur du maillage du ligand en bleu. Affichez les résidus du site actif interagissant avec les ions PEP et magnésium dans la représentation en bâtonnet et en sphère et l’enzyme énolase dans la représentation de dessin animé.
Définissez la taille du maillage. Saisissez-le dans la ligne de commande pour effectuer le ray tracing et enregistrer l’image en tant que fichier PNG. Au cours de la glycolyse, l’énolase convertit deux phosphoglycérates en phosphoénolpyruvate, un intermédiaire vital pour diverses voies métaboliques.
La carte des différences entre l’enzyme apo et l’enzyme liée à la PEP a montré une densité de ligand distincte. De plus, une densité supplémentaire a été observée dans le site actif de la protéine modélisée. Le phosphoénolpyruvate et deux ions magnésium ont été modélisés dans la densité observée au voisinage du ligand.
Le phosphoénolpyruvate a formé des liaisons hydrogène avec plusieurs résidus de sites actifs, tels que la lysine 386 et l’arginine 364. Les ions magnésium ont formé des liaisons de coordination métallique avec l’aspartate 241, le glutamate 283, l’aspartate 310 et le phosphate de phosphoénolpyruvate.
