Dans cette procédure, nous montrons comment passer d’une poudre de petite molécule à une structure tridimensionnelle en quelques minutes. Il s’agit d’une technique transformatrice pour la communauté de la chimie. De nombreux composés ne se développent pas facilement en gros cristaux.
Avec MicroED, nous pouvons déterminer des structures de résolution atomique à partir de cristaux de taille nanométrique. La démonstration de la procédure sera le Dr Mike Martynowycz, professeur à l’UCLA. Pour commencer, transférez une petite quantité de poudre, de liquide ou de solides dans un petit flacon ou un tube.
Pour les échantillons déjà sous forme de poudre, scellez le tube à l’aide du bouchon jusqu’à ce que l’échantillon soit nécessaire. De même, sécher les échantillons liquides en poudres. Enroulez un film plastique autour d’une extrémité d’une lame de couvercle en verre.
Placez les grilles TEM sur le film au-dessus de la diapositive de couverture avec le côté carbone de couleur marron vers le haut. Ensuite, placez la glissière avec des grilles dans la chambre de décharge luminescente et déchargez la lame de couvercle pendant environ 30 secondes en utilisant le réglage négatif à 15 picoampères. Rangez les grilles sur la lame de couverture dans une boîte de Petri en verre tapissée de papier filtre avant d’ajouter l’échantillon aux grilles.
Retirez la grille TEM à décharge luminescente de la boîte de Petri couverte à l’aide d’une pince à épiler et placez-la sur un papier filtre circulaire avec le côté carbone vers le haut. À l’aide d’une petite spatule, retirez une très petite cuillère de poudre et placez-la sur un petit couvercle carré en verre juste à côté de la grille TEM sur le papier filtre. Placez une autre petite lame de verre carrée ou un couvercle sur la poudre.
Avec les doigts, frottez doucement les deux lames de verre ensemble pour faire une poudre fine. Inclinez les lamelles de couverture et placez-les juste au-dessus de la grille TEM sur le papier filtre et continuez à frotter les lamelles de couverture ensemble à quelques centimètres au-dessus de la grille TEM déchargée par lueur. Observez si la poudre tombe vers la grille.
Découvrir la poudre finement broyée en retirant l’un des deux couvercles en verre. Ensuite, brosser doucement la poudre fine du couvercle sur la grille TEM à l’aide d’un morceau de papier filtre. Saisissez le bord de la grille TEM à l’aide d’une pince à épiler, en vous assurant que les pointes ne perforent aucun des carrés de la grille.
Soulevez la grille d’un à deux centimètres au-dessus du papier filtre et inclinez la grille à 90 degrés par rapport au papier en dessous. Tapotez doucement la pince à épiler tout en gardant la grille fermement serrée pour enlever toute poudre en vrac. Congelez la grille en déplaçant la pointe de la pince à épiler directement dans un récipient d’azote liquide à la main et attendez que la grille et la pince à épiler cessent de bouillir.
Sous azote liquide, placer la grille dans le porte-échantillon avec le côté carbone orienté de telle sorte que l’échantillon soit frappé par le faisceau avant le film de support de carbone. Charger le porte-échantillon dans le TEM en s’assurant que la grille est toujours maintenue à la température de l’azote liquide. Pour les systèmes de chargement automatique, placez les grilles clipsées dans une cassette dans un récipient refroidi à l’azote liquide, ce qui permet à la robotique du chargeur automatique d’accepter la cassette tout en gardant les échantillons en sécurité pour la navette entre le chargeur automatique et la colonne.
Ouvrez les vannes de colonne TEM et réglez le grossissement à l’aide des panneaux manuels au grossissement le plus bas possible. Trouvez le faisceau en ajustant le bouton d’intensité sur les panneaux manuels de sorte qu’une zone lumineuse ronde soit visible sur l’écran fluorescent. Prenez un atlas de grille à faible grossissement à l’aide d’un logiciel approprié garantissant que le microscope est bien aligné pour l’imagerie à faible et à fort grossissement avant de collecter des données MicroED haute résolution.
Identifiez les carrés de grille sans carbone cassé et les grains noirs ou foncés visibles sur le film. Naviguez autour de la grille soit physiquement à l’aide du joystick sur les panneaux de main, soit virtuellement sur l’atlas collecté pour rechercher des carrés de grille qui ne sont pas cassés et contiennent des microcristaux. Ajoutez le centre de chacun de ces carrés à une liste d’emplacements de grille pour l’investigation, qui peut être ajoutée à un ordinateur portable dans l’interface utilisateur du microscope ou dans le logiciel d’automatisation du microscope.
Réglez le grossissement entre 500 et 1300x. Ajustez la hauteur centrale à chaque emplacement de grille stocké et mettez à jour la valeur z enregistrée aux positions notées. Recherchez sur l’écran fluorescent ou sur une caméra plate de petites taches noires ou des grains sur la grille.
Un bon échantillon aura souvent des arêtes vives à fort grossissement suggérant le cristal dans l’ordre. Déplacez un cristal de potentiel localisé vers le centre de l’écran et augmentez le grossissement de sorte que le TEM passe en mode de grossissement élevé. Insérez une ouverture de zone sélectionnée et modifiez l’ouverture pour une taille plus grande ou plus petite pour vous assurer que la zone sélectionnée est plus grande que le cristal.
Passez en mode défraction en appuyant sur le bouton de défraction sur les panneaux manuels TEM pour vous assurer que l’écran fluorescent est inséré. Ajustez la longueur de la caméra à l’aide du bouton d’agrandissement de sorte que le bord ait au moins une résolution angström. Ajustez la mise au point de diffraction de manière à ce que la tache centrale soit aussi nette et petite que possible.
À l’aide des boutons de changement de vitesse de diffraction, déplacez le faisceau central vers le centre de l’écran fluorescent. Insérez l’arrêt de poutre en vous assurant que le faisceau est derrière lui. Soulevez l’écran fluorescent et prenez une courte exposition sur l’appareil photo.
Inspectez le motif de défraction correspondant, en vous assurant que le motif aura des points tranchants qui sont régulièrement disposés en colonnes et en lignes. Enregistrez les coordonnées cristallines dans l’interface utilisateur TEM ou en les écrivant, puis répétez le criblage par diffraction pour tous les cristaux potentiels d’intérêt sur le carré de la grille actuelle. Centrez le cristal grillagé à un grossissement supérieur à 1000x et ajustez la hauteur centrale du cristal à l’aide d’une routine automatique ou à la main.
Insérez l’ouverture de zone sélectionnée qui correspond le mieux à la taille et à la forme du cristal. Inclinez la scène dans les directions négative et positive jusqu’à ce que l’image soit obstruée par les barres de grille. Et notez ces angles à des fins de collecte de données en lisant les données toutes les secondes sur un appareil photo moderne avec un mode de lecture à obturateur roulant.
Réglez la vitesse de rotation en spécifiant le pourcentage de la vitesse d’inclinaison maximale et le moment de l’arrêt dans l’interface utilisateur du microscope ou dans un logiciel dédié. Enregistrer les données dans une variété de formats dit soit des images individuelles ou sous forme d’une pile d’images. Un film de défraction en format cristallographique recueilli à partir de microcristaux montre un ensemble de données MicroED à rotation continue à partir d’un microcristal de carbamazépine identifié sur une grille MET.
Après la collecte, l’intégration et la solution de structure, une structure haute résolution est déterminée et sa clarté dépend de la qualité et de l’exhaustivité des données. L’application de l’échantillon à la grille est essentielle pour acquérir de bonnes données. En suivant cette méthode, les données peuvent être traitées ultérieurement à l’aide d’un logiciel cristallographique standard.
La démonstration que MicroED est une méthode puissante pour les petites molécules a ouvert son utilisation dans le monde entier pour résoudre de nouvelles structures de molécules d’importance critique.
