De nombreux allergènes se lient aux molécules hydrophobes. Ce protocole permet l’élimination complète et le remplacement de ces ligands, nous permettant d’étudier leur impact sur la structure et l’immunogénicité de manière systématique. L’utilisation de la CLHP en phase inverse, associée à un recuit thermique, présente deux avantages.
Il élimine les ligands endogènes, et il aide à solubiliser les ligands pour ouvrir des sites de liaison autrement inaccessibles. Si nous pouvons déterminer les facteurs qui contribuent à l’allergénicité, nous pourrions être en mesure de concevoir des thérapies qui évitent ces facteurs. De nombreuses protéines se lient aux ligands lipidiques, qui sont fortement retenus et peuvent influencer à la fois la structure et la fonction.
Notre méthode permet l’étude systématique de ces interactions. La solubilité et l’accessibilité limitées de nombreuses cargaisons lipidiques peuvent inhiber le processus de chargement. Assurez-vous de prendre soin de lors de la préparation de ces ligands, et de considérer la nécessité d’adaptations spécifiques au système.
Comme travailler avec des ligands hydrophobes et insolubles est un ajustement pour certains allergologues et biochimistes, il peut être utile de voir à quoi ressemblent les échantillons à différents stades. Après clonage d’expression et de purification, appliquer 12 millilitres du Bla g 1 clivé sur une unité filtrante centrifuge avec une limite de poids moléculaire inférieure à 10 kilodaltonnes pour de multiples centrifugations dans un rotor à godet oscillant jusqu’à ce que le volume total ait été réduit à moins de deux millilitres. Chargez le concentré résultant sur un système HPLC de 250 par 10 millimètres équipé d’une colonne de chromatographie en phase inverse C18 équilibrée avec un tampon A à 97% et un tampon B.Elute Bla g 1 à un débit de 1,5 à 4 millilitres par minute, comme indiqué dans le tableau, en utilisant l’absorbance de fluorescence à 280 nanomètres pour surveiller le processus d’élution.
A partir d’environ 34 à 40 minutes et une concentration en B tampon supérieure à 74% ne collectent pas plus de quatre millilitres de chaque fraction Bla g1. Aliquote la fraction Bla g 1 groupée en tubes à essai en verre. Couvrir les tubes avec un film de paraffine et perforer le film avec deux trous.
Ensuite, congelez les échantillons à moins 80 degrés Celsius pendant une heure et utilisez un lyophilisateur pour sécher les échantillons de protéines délipalées résultants. Pour déterminer le rendement prévu de Bla g 1, suspendre à nouveau une aliquote d’essai dé-lipidisée lyophilisée dans cinq millilitres de tampon de repliement. Chauffer le mélange dans un bécher de 500 millilitres contenant 250 millilitres d’eau à 95 degrés Celsius sur une plaque chauffante avec agitation et vortex intermittent.
Maintenez la solution à 95 degrés pendant 30 à 60 minutes avant de laisser le bain-marie s’équilibrer lentement à la température ambiante. Lorsque la solution a refroidi, passez le mélange de lipides Bla g 1 recuit à travers un filtre à seringue de 0,22 micron pour éliminer les particules, et utilisez un nouveau filtre centrifuge avec une coupure de 10 kilodaltons pour tamponner l’échange de la protéine filtrée trois fois dans le PBS pour éliminer les acides gras libres résiduels et le solvant organique. Ensuite, évaluez la concentration en protéines à l’aide d’un test d’analyse protéique standard pour déterminer le rendement prévu pour les aliquotes Bla g 1 restantes.
Pour reconstituer l’Apo-Bla g1, suspendre à nouveau les aliquotes Bla g 1 dans cinq millilitres de tampon de repliement par partie aliquote, et recuit les échantillons comme démontré. Pour charger le Bla g 1 avec des phospholipides, ajouter 10 milligrammes de la cargaison souhaitée à un tube à essai en verre et dissoudre dans le chloroforme, et évaporer le chloroforme pour produire un film lipidique. Ensuite, ajoutez du PBS au tube pour produire une concentration finale de phospholipides de 20 millimolaires.
Chauffer le phospholipide au-dessus de la température de transition de phase de la cargaison lipidique pour réhydrater le film lipidique, et vortex jusqu’à ce que la solution devienne trouble. Ensuite, ajoutez la cargaison de lipides phospho pour produire un excès molaire de ligands 20X par rapport à Bla g 1 en fonction du rendement prévu. Un précipitant peut se former.
Vortex à mélanger avant de recuit la protéine comme démontré. Pour confirmer l’enlèvement ou le chargement de la cargaison par RMN au phosphore 31, utilisez un filtre centrifuge pour concentrer l’échantillon à plus de 100 micromolaires, comme démontré. Préparer des échantillons de phospholipides de référence des concentrations connues dans le tampon PBS comme indiqué, et diluer la référence d’extrémité Bla g 1 à un rapport de 1:1 avec tampon cholate à un volume total d’environ 600 microlitres.
Utilisez une sonde à large bande pour acquérir des spectres RMN unidimensionnels de 31 phosphores des échantillons Bla g 1 solubilisés collat et des étalons de phospholipides de référence, et comparez les spectres RMN de phosphore Bla g 1 31 à ceux obtenus pour les échantillons de référence de phospholipides afin de confirmer l’élimination des ligands liés de manière endogène et/ou la liaison des ligands souhaités en fonction des décalages chimiques des pics visibles, puis comparez l’intensité maximale du spectre Bla g 1 à celle des étalons de référence des phospholipides pour permettre la confirmation de la stœchiométrie de liaison complète. En utilisant la chromatographie d’affinité, gst Bla g 1 recombinant peut être facilement isolé à un haut niveau de pureté, produisant un rendement de deux à quatre milligrammes par litre de culture cellulaire. L’incubation pendant la nuit avec de la TEV protéase à quatre degrés Celsius est suffisante pour enlever l’étiquette GST, ce qui donne le produit final à environ 24 kilodaltons.
L’application du Bla g 1 à une colonne C18 en phase inverse donne un profil d’élution distinctif, avec deux grands pics à 50% tampon B, et un deuxième grand pic à 75% tampon B.Phosphore-31 Les spectres RMN d’Apo-Bla g 1 ne montrent aucun phospholipide détectable. Une courbe standard peut être produite à partir de la RMN à l’aide d’échantillons de référence de concentrations connues de DSPC. La comparaison de l’intensité du signal phosphore 31 obtenue à partir de DSPC Bla g1 par rapport à cette courbe standard peut être utilisée pour obtenir la stœchiométrie de liaison des lipides par protéine.
Les spectres de dichroïsme circulaire pour Bla g 1 chargé d’apo et de lipides montrent des minima de 220 et 210 nanomètres, indiquant une structure principalement alpha-hélicoïdale. Les analyses thermiques dichroïsme-basées circulaires de dnaturation montrent également une perte coopérative de structure secondaire alpha-hélicoïdale, indicative d’un domaine globulaire plié. De plus, l’analyse des températures de fusion résultantes révèle une augmentation significative sur la liaison au ligand nMix, compatible avec Bla g1 obtenu à partir de sa source naturelle d’allergènes.
Le succès de ce protocole repose sur la capacité de surmonter à la fois la solubilité limitée des ligands hydrophobes, et la nature inaccessible de la cavité de liaison Bla g 1. Ce procédé jette les bases pour des études immunologiques, telles que des essais à cellule T de prolifération, pour évaluer l’effet des ligands de lipide sur la sensibilisation et les mécanismes moléculaires par lesquels ceci se produit. Couplant ce procédé avec d’autres analyses biophysiques, nous avons prouvé que la liaison des ligands hydrophobes améliore la stabilité de Bla g 1, avec des implications en aval potentielles pour la génération d’épitope et l’allergénicité.
