Pour commencer, préparez la solution d’enrobage appropriée dans un tampon Tyrode modifié et enduisez une microlame de huit puits en l’incubant pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Ensuite, lavez deux fois la microlame enrobée avec un tampon Tyrode modifié. Incuber la microlame dans un tampon Tyrode modifié contenant cinq milligrammes par millilitre de BSA pendant au moins 30 minutes pour éteindre l’adhérence non spécifique.
Pour préparer les plaquettes lavées, centrifugez le citrate de sang total anticoagulant à 200 G pendant 20 minutes pour obtenir un plasma riche en plaquettes. Ajoutez ensuite de l’indométacine et de la PGE1 au plasma riche en plaquettes et centrifugez à 500 G pendant 10 minutes. Remettez en suspension la pastille plaquettaire résultante dans le tampon HEPES modifié de Tyrode à 37 degrés Celsius pour atteindre une densité de quatre fois 10 à la puissance sept plaquettes par millilitre.
Laissez reposer les plaquettes isolées pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez la solution de DHE à la suspension plaquettaire pour obtenir une concentration finale de 10 micromolaires et incubez à 37 degrés Celsius pendant une minute. Après l’incubation, retirez la solution bloquante de la microlame et placez-la sur la platine du microscope pour l’imagerie.
Ensuite, distribuez doucement les plaquettes. Utilisez une lentille à immersion dans l’huile 40X sur un microscope confocal inversé pour surveiller la conversion de la DHE en 2-hydroxyéthidium. Image pendant 10 minutes, en collectant des images toutes les 10 secondes.
Pour surveiller la génération d’anions superoxyde en réponse à un agoniste, ajoutez un agoniste soluble 10 minutes après la distribution des plaquettes et collectez des images de fluorescence pendant 10 minutes supplémentaires. À l’aide de ce protocole, la génération de radicaux superoxydes a été étudiée lors de l’adhésion des plaquettes au collagène ou au fibrinogène, et à partir des plaquettes adhérant à la LPL stimulées par la thrombine.
