Fractionnement cellulaire d’îlots pancréatiques de macaque rhésus pour le séquençage de l’ARN unicellulaire et la métabolomique

Pour commencer, décongelez le tissu isolé de l’îlot pancréatique du macaque rhésus sur de la glace. Ajoutez 500 microlitres de tampon de lyse 0,1X à la pastille de tissu. À l’aide d’un pilon à granulés jetable sans RNase, homogénéisez doucement le tissu 15 fois sur de la glace.

Incuber l’échantillon sur de la glace pendant 10 minutes. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de tampon de lavage à l’homogénat et mélangez doucement avec une pipette sur de la glace. Amorcez un filtre de pré-séparation de 30 micromètres avec 300 millilitres de tampon de lavage, puis filtrez un millilitre d’homogénat cellulaire dans un tube de cinq millilitres.

Faites tourner l’homogénat filtré à 500 g pendant cinq minutes dans une centrifugeuse à godets oscillants à quatre degrés Celsius. À l’aide d’une pipette, transférez un millilitre de surnageant dans un cryoflacon sur glace et congelez-le immédiatement à moins 80 degrés Celsius pour de futures expériences métabolomiques. Ajoutez un millilitre de tampon de lavage goutte à goutte à la pastille de noyau pour la remettre en suspension.

Faites tourner la pastille lavée à 1 000 g pendant cinq minutes dans une centrifugeuse à godet oscillant à quatre degrés Celsius. Après avoir répété le lavage, remettez les noyaux en suspension dans un millilitre de tampon de lavage. À l’aide d’une pipette, mélangez 10 microlitres de suspension de noyaux et 0,4 % de bleu de trypan dans un tube séparé, puis ajoutez le mélange à une lame de compteur de cellules automatisée.

Enfin, à l’aide d’un compteur de cellules, déterminez la concentration des noyaux. Un noyau intact idéal a été obtenu pour les expériences de séquençage. Sur la base d’études d’expression génique, le regroupement UMAP de sous-types cellulaires dans des îlots de primates fœtaux non humains isolés a été obtenu.

L’abondance de métabolites des îlots, tels que le phosphate de dihydroxyacétone, le 3-phosphate de glycérol, le 2-oxoglutarate, la créatine et le glutathion, a été obtenue à l’aide des fractions cytosoliques.