Cette méthode permet la quantification de la consommation d’oxygène à partir d’un petit nombre d’îlots provenant d’espèces pertinentes, telles que les primates non humains et les humains, permettant l’évaluation de la fonction mitochondriale. Cette technique peut être effectuée avec un petit nombre d’îlots primaires, augmentant les répliques techniques, permettant l’essai de conditions multiples, et améliorant la rigueur et la reproductibilité de l’analyse. Cette technique évalue la santé mitochondriale, une fonction déterminée majeure de la fonction d’îlot et de sécrétion d’insuline qui est souvent altérée dans le diabète et est un prédicteur significatif de la transplantation réussie d’îlot.
Il est essentiel de s’assurer que les îlots sont localisés au centre des puits après le transfert. Si vous ne le faites pas, il n’y a pas de mesures incohérentes de la consommation d’oxygène. Valerie Ricciardi, étudiante de premier cycle travaillant dans mon laboratoire, fera la démonstration de cette procédure.
La veille de l’analyse, ajouter 200 microlitres d’adhésif cellulaire et tissulaire à 2,8 millilitres de solution bicarbonate de sodium molaire de 0,1 molaire et ajouter 20 microlitres de la solution résultante au fond de chaque puits d’une microplaque sphéroïde bien sphéroïde de 96 puits. Assurez-vous que toutes les bulles d’air sont retirées de la pointe de la pipette. Lorsque tous les puits ont été chargés, placez la plaque dans un incubateur de 37 degrés Celsius sans dioxyde de carbone.
Après une heure, aspirer la solution adhésive cellulaire de la plaque dans un environnement stérile et laver chaque puits deux fois avec 400 microlitres d’eau stérile de 37 degrés Celsius. Ensuite, laissez les puits sécher à l’air libre pendant 30 à 40 minutes avant de couvrir la plaque pour un stockage de nuit à quatre degrés Celsius. Pour hydrater la cartouche du capteur, dans un environnement stérile, ouvrez l’emballage de la cartouche du capteur et retirez le contenu.
Placez la cartouche du capteur à l’envers à côté de la plaque utilitaire et remplissez chaque puits de la plaque utilitaire de 200 microlitres d’eau stérile. Lorsque tous les puits ont été chargés, abaissez la cartouche du capteur dans la plaque d’utilité et placez la cartouche de capteur et la plaque d’utilité assemblées dans l’incubateur de dioxyde de carbone de 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le jour de l’analyse, retirez le couvercle de la cartouche du capteur et démentez l’eau des puits de la plaque d’utilité.
Ajouter 200 millilitres de calibrant préchauré à chaque puits et remplacer le couvercle de la cartouche du capteur. Ensuite, placez la cartouche du capteur dans l’incubateur pendant environ une heure. Pour préparer les îlots pour le transfert, cueillez à la main les îlots dans un plat de culture cellulaire de 60 x 15 millimètres contenant du milieu assemblé à une pureté proche de 100 %.
Lorsque tous les îlots ont été collectés, chargez chaque puits de la microplaque sphéroïde préparée avec 175 microlitres de milieu assemblé et utilisez une pipette P20 réglée sur 15 microlitres pour aspirer 15 îlots dans 15 microlitres de milieu provenant du plat de culture cellulaire. Pour ensemencer les îlots sur la microplaque sphéroïde, abaissez la pointe de la pipette au fond du puits, soulevez à peine la pointe et distribuez lentement environ cinq microlitres de milieu. Pour charger les îlots dans les puits, laissez les îlots s’installer dans la pointe de la pipette avant de les relâcher doucement directement au-dessus du fond du centre du puits dans un petit volume de milieu.
Confirmez que tous les îlots ont quitté la pointe pipette, vérifiant occasionnellement la microplaque sphéroïde au microscope pour vérifier que les îlots sont ensemencés au fond de la plaque et ne sont pas collés sur les côtés des puits. Lorsque tous les îlots ont été transférés, placez la microplaque dans l’incubateur de 37 degrés Celsius sans dioxyde de carbone. Avant d’entamer la procédure d’analyse, chargez le port A de la cartouche du capteur avec 20 microlitres d’oligomycine de 45 micromolaires fraîchement préparés, le port B avec 22 microlitres de FCCP 10 micromolaires fraîchement préparés, et le port C avec 25 microlitres de rotenone aa de 25 micromolaires fraîchement préparés. Ensuite, programmez un analyseur de flux extracellulaire pour une période de respiration de base de 30 minutes, une période de mesure de l’oligomycine de 42 minutes, une période fccp de 30 minutes et une période de rotenone AA de 30 minutes.
Ensuite, exécutez l’analyse en suivant les instructions sur l’écran pour calibrer le capteur et insérer la microplaque. Pour la livraison d’îlots à la plaque d’analyse, 15 îlots doivent être aspirés dans 15 microlitres de milieu comme illustré. Cette technique se traduira par le placement constant des îlots au centre inférieur de chaque puits de microplaque permettant des mesures précises de la consommation d’oxygène.
Dans cette expérience représentative montrant la consommation d’oxygène des puits individuels, les puits étaient mal chargés, ce qui a entraîné un niveau de consommation d’oxygène très faible et peu ou pas de réponse au FCCP. Dans cette expérience, la plupart des puits ont démontré une respiration et une réponse de base significatives aux drogues. Cependant, deux puits n’ont montré aucune réponse à la rotenone, suggérant que le médicament n’a pas été correctement libéré dans le puits.
Ces puits ont été exclus d’autres analyses. Ici, les résultats d’un essai réussi dans lequel les puits ont été correctement chargés avec des îlots et correctement injectés avec des drogues peuvent être observés. Il est avantageux de préparer les reagents et les plaques la veille de l’analyse afin de permettre aux îlots d’être utilisés peu de temps après leur isolement ou leur reçu.
Après l’analyse, les îlots peuvent être récupérés pour l’extraction de protéines ou d’ADN afin de normaliser les données sur la consommation d’oxygène ou de quantifier la teneur en ADN mitochondrial. La capacité de mesurer la fonction mitochondriale en petit nombre d’îlots primaires de primates permet l’essai de plusieurs médicaments et d’autres manipulations en une seule réplique biologique. Les personnes qui travaillent avec des îlots primaires de primates devraient être sûres d’être formées à la manipulation appropriée et sécuritaire avec ces tissus.
En particulier, l’utilisation d’équipement de protection individuelle approprié et l’élimination appropriée de ces échantillons.
