Nucléofection de cultures de la neurosphère obtenue à partir de cellules souches neurales murines dérivées de la zone sous-ventriculaire

À l’aide du kit recommandé, procédez à la préparation de 95 microlitres de solution de nucléofection dans un tube de 1,5 millilitre pour chaque condition de nucléofection souhaitée. Préparez également une fiole T25 remplie de quatre millilitres de milieu complet préchauffé par condition et conservez-la dans l’incubateur jusqu’à utilisation. Pour effectuer la nucléofection, centrifugez le nombre souhaité de cellules pendant cinq minutes à 300 G avant de retirer le surnageant.

Ajoutez un millilitre de DPBS et remettez la pastille en suspension de manière homogène en pipetant 10 fois de haut en bas. Après avoir répété la centrifugation, remettre la pastille en suspension dans 95 microlitres de solution de nucléofection. Combinez les 95 microlitres de cellules avec une solution pré-mélangée contenant cinq microlitres de chaque plasmide sélectionné pour la nucléofection.

Après avoir transféré cette solution dans une cuvette, placez-la dans le dispositif nucléofecteur pour nucléoficter les cellules avec les plasmides à l’aide du programme optimisé de cellules souches neurales du système nucléofector. Une fois l’électroporation terminée, à l’aide de la pipette Pasteur fournie dans le kit, introduisez soigneusement le milieu complet chaud dans la cuvette. Transférez le contenu de la cuvette dans la fiole T25 préalablement préparée contenant le milieu complet préchauffé.

Incuber les cellules nucléofectées dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant trois à cinq jours et visualiser les neurosphères nucléofectées.