Chargement de lymphocytes T CD4⁺ primaires de souris et revêtement de billes magnétiques de protéine G avec des anticorps pour l’imagerie locale Ca²⁺

Pour commencer, prenez des lymphocytes T CD4 positifs isolés des ganglions lymphatiques et de la rate de souris. Centrifugez deux à cinq millions de cellules pendant cinq minutes à 300 g. Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 480 microlitres de milieu de cellules T contenant 10 micromolaires Fluo-4 AM et 20 micromolaires Fura Red AM. Couvrez le tube Falcon avec du papier d’aluminium et incubez les cellules pendant 20 minutes à température ambiante dans l’obscurité.

Ajoutez ensuite deux millilitres de milieu de cellules T aux cellules et continuez à incuber pendant 30 minutes supplémentaires. Mélangez délicatement la suspension de billes magnétiques de protéine G et transférez 12,5 microlitres dans un nouveau tube. Placez le tube sur un support magnétique pour permettre aux billes de migrer vers l’aimant.

Pipetez doucement le tampon de stockage par le côté opposé de l’aimant pour le retirer. Pour retirer toute mémoire tampon de stockage restante, ajoutez 500 microlitres de PBST et vortex pendant 10 secondes. Replacez le tube sur le support magnétique et retirez le tampon.

Pour enrober les billes d’anticorps, mettez-les en suspension dans 7,5 microlitres de PBST et ajoutez cinq microlitres chacun d’anti-CD3 et d’anti-CD28. Incuber pendant 30 à 60 minutes en mélangeant continuellement à température ambiante. Laver les billes enrobées trois fois avec 500 microlitres de PBST, puis un lavage avec 500 microlitres de tampon de calcium à l’aide du support magnétique, puis remettre les billes en suspension dans 200 à 400 microlitres de tampon de calcium.