Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans une grande variété de domaines nécessitant l’inactivation conditionnelle et transitoire d’un gène d’intérêt en exprimant de façon réversible une version négative dominante de celui-ci. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ne permet qu’une ablation partielle de l’activité protéique, préservant ainsi une expression endogène résiduelle. Bien que, ici nous décrivons l’inactivation de condition de la protéine de RB, qui fonctionne dans un assemblage multimérique, cette méthodologie peut également être appliquée aux protéines monmériques.
Umesh Pyakurel, notre technicien de laboratoire et coauteur du manuscrit, démontrera les procédures. Pour commencer, cultivez des cellules NIH3T3, selon les spécifications du vendeur, à 37 degrés Celsius avec 5% de CO2, en utilisant le milieu de culture cellulaire recommandé contenant 10% de sérum bovin fœtal. Pour cotransfecter les cellules à l’aide de vecteurs pTet-Splice et pCMV-Tet3G, mélangez d’abord deux à quatre microlitres du réagent de transfection à base de lipides par puits, et un millilitre de DMEM incomplet par puits dans un tube de 15 millilitres, et incuber pendant cinq minutes à température ambiante.
Ajoutez deux à trois microgrammes d’ADN plasmatique par puits au mélange DMEM de ce réagrence transfection. Mélanger et incuber pendant 20 minutes à température ambiante. Ajouter un millilitre du mélange contenant de l’ADN et le réaccente de transfection dans le DMEM à chaque puits de plaque de six puits avec des cellules NIH3T3.
Après trois à quatre heures d’incubation à 37 degrés Celsius avec 5% de CO2, ajouter un millilitre de milieu complet. Ensuite, ajouter 2 microlitres de bouillon de doxycycline à chaque puits et marquer l’assiette comme plus-doxycycline. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de CO2.
Pour évaluer la fonctionnalité de la construction TetO-DN-CB-myc6-Rb1 dans la promotion de la prolifération cellulaire non reportée, la culture des cellules HEI-OC1 dans le DMEM contenant 10% de FBS, dans des conditions permissives. Pour les études sur la prolifération cellulaire, comptez les cellules HEI-OC1 à l’aide d’un compteur cellulaire. Plaque 10 000 cellules HEI-OC1 par puits sur une plaque de 96 puits en 200 microlitres de volume chacune.
Incuber les cellules pendant la nuit à 33 degrés Celsius avec 5% de CO2. Pour induire l’expression transgénique, ajoutez un microgramme par millilitre de doxycycline à un sous-ensemble de cellules HEI-OC1 transfectées. Utilisez l’autre sous-ensemble étiqueté comme moins-doxycycline et les cellules HEI-OC1 non transfectées comme témoins, et incuber les cellules comme 33 degrés Celsius avec 10% de CO2.
Pour évaluer la prolifération cellulaire, 48 heures après la transfection, retirez le milieu de culture cellulaire et ajoutez 100 microlitres de solution de liaison de colorant 1x d’un kit de prolifération cellulaire à chaque puits de la micro-plaque. Suivez le protocole du fabricant et incubez pendant une heure à 37 degrés Celsius. Utilisez un lecteur de microplaque de fluorescence pour mesurer l’intensité de fluorescence de chaque échantillon.
Pour évaluer davantage la prolifération cellulaire à l’aide de l’immunocytochimie, plaquez les cellules HEI-OC1 sur un verre de couverture placé dans chaque puits d’une plaque de 12 puits dans le DMEM. Incuber les cellules pendant la nuit à 33 degrés Celsius. Le lendemain, cotransfecter les cellules dans deux puits avec le pTet-Splice et les vecteurs pCMV-Tet3G, puis effectuer le traitement à la doxycycline sur un bon ainsi que fait avec les cellules NIH3T3.
Utilisez-en un non transmis ainsi qu’un contrôle. Pour traiter les cellules pour l’étiquetage Ki-67, fixez-les avec 4% de paraformaldéhyde dans PBS pendant 10 minutes à température ambiante. Après cela, lavez-les trois fois avec du PBS glacé pendant cinq minutes chacun.
Ajouter 0,25% de détergent non ionique dans PBS, et incuber pendant 10 minutes. Répétez le lavage trois fois dans PBS pendant cinq minutes chacun. Utilisez 10% sérum pour bloquer les cellules.
Dans une chambre humidifiée pendant une heure à température ambiante. Ajouter 500 microlitres d’anticorps primaires Ki-67 et incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius. Lavez les cellules à nouveau trois fois dans PBS pendant cinq minutes chacun.
Ajouter un millilitre de l’anticorps secondaire et incuber les cellules pendant une heure à température ambiante dans l’obscurité. Après avoir enlevé la solution d’anticorps secondaire, lavez les cellules à nouveau trois fois pendant cinq minutes dans PBS dans l’obscurité. Pour étiqueter les cellules HEI-OC1 avec de la phalloidine, incubez-les en 1:200 phalloidin pendant 30 minutes à température ambiante.
Pour étiqueter les noyaux cellulaires, incuber les cellules avec cinq microgrammes par millilitre de DAPI pendant 10 minutes à température ambiante. Après la livraison des souris transgéniques, génotyper les chiots à l’aide d’un amorce spécifique à la région de fusion CBRb1 tel que décrit dans le manuscrit. Élever des souris adultes TetO-DN-CB-myc6-Rb1 à la ligne d’inducteur ROSA-CAG-rtTA et tetrecycline pour générer des souris expérimentales DN-CBRb, et génotyper leur progéniture comme décrit dans le manuscrit.
NIH3T3 n’exprime pas la protéine RB1 endogène, de sorte que l’expression RB1 robuste observée ici est due à l’induction transgénique en présence de Dox, mais pas en son absence, confirmant l’activation efficace de la construction TetO-DN-CB-myc6-Rb1 mix RB1. En revanche, les cellules HEK293 ont l’expression endogène rb1. L’ajout de doxycycline a conduit à l’activation de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 et à une régulation à la baisse de la RB1.
L’expression rb1 a été reprise 21 heures après que la doxycycline ait été enlevée des médias. Les cellules HEI-OC1 cotransfectées avec les mêmes vecteurs, ont montré une augmentation modeste mais significative du nombre de cellules suivent le traitement de doxycycline comparé aux cellules transfected non traitées avec la doxycycline, et aux cellules nontransfected. L’hybridation in situ fluorescente a confirmé l’insertion génomique du transgène TetO-DN-CB-myc6-RB1 chez la souris.
Il y avait une augmentation initiale de l’expression totale de protéine RB1 dans la cochlée des souris transgéniques traitées avec la doxycycline pendant trois jours comparée au groupe témoin. Cependant, dans les groupes traités avec la doxocycline pendant sept et 10 jours, une réduction significative de l’expression de RB1 a été observée. Indépendamment du tissu analysé, une réduction significative de la protéine RB1 a été observée chez les souris transgéniques traitées avec de la doxocycline, mais pas dans le groupe témoin, confirmant l’efficacité de la construction TetO-DN-CB-myc6-RB1.
Tout en essayant cette procédure, il est important de vérifier que chacun des éléments de codage du transgène sont en cadre les uns avec les autres. Si les régions codantes de cathepsine B et de rétinoblastome décrites dans ce rapport étaient, par hasard, reliées hors cadre, elles ne donneraient pas la protéine de fusion prévue. Ainsi, la vérification de la séquence d’ADN doit être effectuée avant d’injecter le transgène dans des embryons de souris unicellulaires.
Suivant cette procédure, le promoteur omniprésent de CAG peut être remplacé par des promoteurs spécifiques afin d’étudier la fonction génétique de la manière spécifique d’une cellule.
