Soutenu par la FRDJ, le NIH (R01-DK081469), le Commonwealth de Pennsylvanie (Centre d&#39;excellence en médecine régénératrice octroi 4100043362), le Mars of Dimes (Basil O&#39;Connor Starter Award de bourses de recherche), et une université de Pennsylvanie DERC pilotes faisabilité et de subvention (DK19525).

1. Les tissus marquage avec CldU et UDI <ol><li> Dissoudre analogues de la thymidine (CldU ou UDI) dans l&#39;eau. Peser ml 1mg / de chaque produit chimique et d&#39;ajouter de séparer les bouteilles en verre d&#39;eau distillée. En général, nous préparer 1 litre de chacun à un moment. </li><li> Dissoudre les produits chimiques sur une plaque d&#39;agitation ou une autre forme d&#39;agitateur. CldU va se dissoudre dans 10 min. l&#39;agitation de la température ambiante. UDI nécessite plus d&#39;une heure d&#39;agitation à 37 ° C dans un shaker. Les sources d&#39;eau peuvent influer sur la solubilité des UDI. Si les UDI demeure sans sursis, après la nuit secouant, essayez une source d&#39;eau propre. Les solutions sont stockées à 4 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> Administrer la solution de thymidine premier contenant (soit CldU ou UDI) de la souris pour la période de marquage désiré. Ne laissez pas les souris pour avoir accès à l&#39;eau sans étiquette pendant la période de l&#39;étiquette. Lorsque la période de marquage désigné est terminée, commence un lavage avec de l&#39;eau non marqué pour au moins 24 heures (les analogues de la thymidine contenant le sérum ont des demi-vies de plusieurs heures). Administrer la solution de thymidine deuxième contenant (soit CldU ou UDI) de la souris pour la période de marquage désiré. Recharge des bouteilles d&#39;eau régulièrement pour éviter la déshydratation! </li><li> Alternativement, les souris peuvent être étiquetés par injection intrapéritonéale séquentielle de CdlU puis UDI. Préparer CldU ou UDI au 10mg / ml de concentration. UDI peut exiger addition goutte à goutte de solution d&#39;hydroxyde de sodium concentrée suivie par une agitation vigoureuse pour aller en suspension. Ne pas ajouter de l&#39;hydroxyde de sodium en excès. Ajouter une seule goutte d&#39;hydroxyde de sodium à une solution à 10 ml d&#39;UDI suivie par une heure d&#39;agitation à 37 ° C dans un shaker. Si ce n&#39;est pas en solution, répéter l&#39;addition d&#39;hydroxyde de sodium. Injecter 100mcg par g de poids corporel dans l&#39;espace intra-péritonéale. </li><li> Lames de contrôle sont indispensables pour ce protocole. En conséquence, nous suggérons fortement enquêteurs mener plusieurs variantes de l&#39;étiquetage analogue de la thymidine pour assurer la sensibilité et de spécificité. Ces mesures devraient comprendre 1. Les souris qui ont été étiquetés que sous leur CldU; 2. Les souris qui ont été étiquetés que sous leur UDI; 3. Les souris qui ont été étiquetés avec séquentielle CldU puis UDI; 4. Les souris qui ont été étiquetés de façon séquentielle dans l&#39;ordre inverse, d&#39;abord avec UDI et ensuite CldU; 5 souris qui sont étiquetés maquette avec de l&#39;eau seulement. Lors de l&#39;apprentissage d&#39;étiquette avec CldU et UDI, les enquêteurs devraient toujours effectuer l&#39;ensemble du protocole avec tous les 5 ensembles-dessus des lames de contrôle à partir du tissu d&#39;intérêt. </li></ol> 2. Préparation récolte de tissus, la fixation, et Slide <ol><li> L&#39;utilisation appropriée d&#39;anesthésie, effectuer surdose mortelle et le sacrifice de la souris via une exsanguination. Enlever les tissus frais et fixer avec paraformalehyde 4% à 4 ° C pendant 24 heures. Transfert des tissus à 01h04 tampon formol et conserver à 4 ° C pour les incorporer. </li><li> Sinon, effectuez surdose mortelle puis perfuser la souris via le ventricule cardiaque gauche avec une solution saline jusqu&#39;au sang est éliminé de l&#39;organisme; alors immédiatement perfuser avec 30-50 cc de paraformaldéhyde à 4%. Enlever les tissus d&#39;intérêt et de stocker dans Buffer 1h04 du formol à 4 ° C pour l&#39;intégration. </li><li> Après déshydratation des tissus et inclusion dans la paraffine, des coupes de tissus coupés de 5 microns et le lieu sur des lames chargées. Cuire les diapositives à 65 ° C pendant 16 heures pour assurer l&#39;adhérence des tissus à glisser (avec des étapes essentielles de récupération d&#39;antigène ci-dessous). </li></ol> 3. Retrieval Déshydratation, perméabilisation, et Antigen <ol><li> Retirer l&#39;excès de paraffine en immergeant coulisse dans deux bains de xylène pendant 5 min. chacun d&#39;eux. </li><li> Réhydrater les tissus en plongeant dans de l&#39;éthanol diapositives dilué avec de l&#39;eau: 100, 95, 90, 80 70 et 50%. Faire tremper les diapositives pendant 3 min. à chaque concentration, à partir de 100% et en allant vers 50% pour l&#39;immersion finale. </li><li> Laver les lames pendant 5 min. dans du PBS 1X. </li><li> Perméabiliser les cellules, en plongeant dans les diapositives de 0,2% de Triton-X solution pendant 5 min (fait frais tous les temps). </li><li> Préparez des diapositives pour la récupération d&#39;antigène à micro-ondes tissus. Placer les lames dans un récipient en verre avec un volume de 0,01 M pH 6,0 suffisante tampon citrate de sodium, de sorte que la solution couvre 5 cm au dessus du sommet de la glisse pour rendre compte de la perte par évaporation. </li><li> Micro-ondes jusqu&#39;à ce que la solution de diapositives est en ébullition (3-10 min. À pleine puissance). Réduire la puissance jusqu&#39;à ce qu&#39;une solution est lentement bouillante (10-80%) et se poursuivre pendant encore 20 min. Vérifiez périodiquement à micro-ondes à garantir la solution reste à une ébullition lente. </li><li> Placez bécher contenant des diapositives sur une paillasse et laisser doucement refroidir à température ambiante (environ 2 heures). </li><li> Vérifiez que les lames sont à la température ambiante à l&#39;aide d&#39;un thermomètre. </li><li> Immerger les lames dans 1.5N HCl pendant 40 min. à température ambiante. </li><li> Laver les lames à deux reprises dans du PBS 1X, 5 min. par lavage. </li></ol> 4. Anticorps primaires et secondaires <ol><li> Il est important que les lames restent très humide à travers l&#39;ensemble du protocole. Tissus secs auront beaucoup plus d&#39;automobilesFluorescence, ce qui rend les images résultantes inutilisable. Pour éviter de mourir, un processus d&#39;une diapositive à la fois. </li><li> Cercle chaque section sur les lames avec un liquide de blocage (ie, cire) stylo. Placer les lames dans le récipient de 1x PBS. </li><li> Faire une chambre d&#39;incubation humide en plaçant des serviettes en papier humide posé à plat sur le fond d&#39;un récipient en plastique hermétique. </li><li> Maquillage solution de blocage de sérum d&#39;âne à 10% dilué dans du PBS 1x. Il est important de couvrir entièrement chaque section avec la solution. Pour des coupes de tissus qui sont 1 x 1,5 centimètres, un volume de 50 micro-litres de solution par la section est suffisante. </li><li> Ajouter la solution de blocage de la glisse. Supprimer page de 1x PBS et d&#39;éliminer l&#39;excès de liquide en tapotant doucement le bord de diapositives sur une pile de serviettes en papier sec. Placer la lame dans la chambre d&#39;incubation et d&#39;ajouter 50 micro-litres de solution de bloc de 10% à chaque section. Lorsque toutes les lames sont terminés fermer le récipient et laisser incuber à température ambiante pendant 1 heure. </li><li> Préparer la dilution des anticorps primaires pour détecter UDI. Diluer la souris anti-BrdU à une concentration de 1:250 âne 5% de sérum faite dans du PBS 1X. Secouez solution de pâté de maisons de glisser et placer de nouveau dans la chambre d&#39;incubation. Ajouter l&#39;anticorps ci-dessus primaire à chaque section et incuber une nuit à 4 ° C. </li><li> Préparer lavez stringence élevée (ce qui minimise les contraignant par la souris anti-BrdU antiserums CldU). Maquillage frais de tampon TBST peu de sel (36mm Tris, 50 mM NaCl, 0,5% Tween-20; pH 8,0). Vous aurez besoin de 40 ml de tampon par paire de glissières. Ajouter 40 ml de tampon à chaque tube conique de 50 ml. Avant l&#39;ajout de diapositives, préchauffer la solution à 37 ° C. </li><li> Deux à un moment, retirer les lames de la chambre d&#39;incubation, les placer dos à dos (afin que les échantillons de tissus visage loin les uns des autres) et tapez sur l&#39;excès d&#39;anticorps primaires. Placer les lames dans les tubes remplis de TBST faible teneur en sel et couvrir. Agiter les tubes pendant 20 min. dans une culture bactérienne secouant incubateur avec la température à 37 ° C, et la vitesse fixée à 225 rpm. </li><li> Laver les lames deux fois dans l&#39;eau douce du PBS 1X. 5 min. par lavage. </li><li> Préparer la solution d&#39;anticorps primaires suivante pour la détection des antigènes tissulaires CldU et, si désiré. Diluer de rat anti-BrdU à une concentration de 1:250 âne 5% de sérum faite dans du PBS 1X. Diluer l&#39;antisérum primaire contre l&#39;antigène tissulaire à travailler la concentration dans la solution d&#39;anticorps primaire. </li><li> Tap excès de PBS 1x hors des diapositives, et les placer dans la chambre d&#39;incubation. Ajouter anticorps primaire à chaque section et incuber une nuit à 4 ° C. </li><li> Laver les lames deux fois dans l&#39;eau douce du PBS 1X. 5 min. par lavage. </li><li> Préparer la solution d&#39;anticorps secondaire. Diluer Cy2 âne anti-rat à 1:250 et Cy5 âne anti-souris à 1:500 dans une solution de PBS 1X contenant du sérum d&#39;âne de 5%. Ajouter Cy3 secondaires pour détecter les espèces primaires d&#39;antisérums antigènes tissulaires. Aussi, diluer une solution stock de 0,4 mg / mL de DAPI à 1:150 dans une solution d&#39;anticorps secondaire. </li><li> Tap excès de diapositives hors 1X PBS et placer dans la chambre d&#39;incubation. Ajouter une solution d&#39;anticorps secondaire pour chaque section et incuber pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Laver les lames deux fois dans l&#39;eau douce du PBS 1X. 5 min. par lavage. </li><li> Tap excès de PBS 1X hors des diapositives et adhèrent couvercle en verre avec Prolongez Or anti-fade supports de montage (NE PAS utiliser avec des colorants Vectashield dyanine!). Appuyer sur lamelles pour éliminer les bulles d&#39;air. Conserver à 4 ° C. </li></ol> 5. Imagerie et analyse <ol><li> L&#39;image du tissu d&#39;intérêt avec un microscope à fluorescence équipé d&#39;une source de lumière de haute énergie, le plan-apochromatique objectifs, et une caméra à haute efficacité microscope (ex Hamamatsu Orca ER). Capture d&#39;images dans l&#39;AMCA (DAPI), Cy2 (CldU), Cy3 (antigène tissulaire), et Cy5 (UDI) des canaux. Fusionner des images pour créer un seul fichier image multi-couches. </li><li> Si exécuté correctement, DAPI noyaux colorés sera homogène lumineux. Antigène tissulaire (insuline par exemple) devrait révéler les cellules d&#39;intérêt. Si la coloration avec DAPI ou tissu-antigène est faible ou incompatibles, toboggan plonger dans la nuit 1X PBS pour éliminer lamelle et répéter l&#39;application des antisérums secondaires. </li><li> Focus sur l&#39;antigène tissulaire dans Cy3. Vérifiez CldU et coloration UDI dans Cy2 et Cy5 canaux, commutation entre les canaux. Cherchez la réactivité croisée potentielle entre les marqueurs, comme indiqué par excès de drogues injectables et la co-CldU positivité. Regarde pour les tissus qui ne contiennent que CldU ou UDI. Manque de noyaux ou de CldU UDI séropositifs peut indiquer un problème technique avec l&#39;étiquetage ou la coloration. Dans ce cas, optez pour un tissu hautement réplicative (ganglions lymphatiques, par exemple). </li><li> Analyser les images. Affichage des couches contenant du DAPI et l&#39;antigène tissulaire. Utiliser un marqueur tableau blanc dans la main dominante et un compteur de cellules dans la main non dominante, marquer chaque noyau avec une marque contrastant avec un marqueur effaçable à sec (aka Marqueur à tableau blanc). Compter les cellules DAPI positives dans le tissu d&#39;intérêt. Enregistrement nombre total de cellules. Utilisez une gomme à sec pour enlever les marques. Couche d&#39;affichages contenant DAPI, antigène tissulaire, et CldU. Compter les cellules CldU positifs au sein du tissu d&#39;intérêt. Le nombre d&#39;enregistrements cellulaires CldU, mais ne pas effacer les marques. Modifier l&#39;affichage pour visualiser les couches contenant l&#39;antigène tissulaire, CldU et UDI. Comptez CldU UDI cellules doublement positives. Valeur record, effacer toutes les marques, et l&#39;affichage des couches contenant du DAPI, antigène tissulaire, et UDI. Compter le nombre total de cellules UDI séropositifs au sein du tissu d&#39;intérêt. Le nombre d&#39;enregistrements de cellules UDI. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Nous séquentielle étiqueté 6 semaines vieilles souris femelles avec CldU pendant une semaine puis UDI pour deux semaines, suivie par le sacrifice immédiat. Pancréas ont été colorées pour détecter CldU, les UDI, et l&#39;insuline (un antigène tissulaire), ainsi que DAPI. Les îlots étaient uniformément colorés avec l&#39;insuline. CldU noyaux colorés étaient distincts des noyaux colorés UDI (figure 2). Beaucoup de noyaux en dehors de l&#39;îlot ont été CldU UDI co-positif (figure 2, en bas à droite, flèches blanches). Une cellule d&#39;insuline seule positifs avaient une coloration nucléaire pour les deux CldU et UDI (figure 2, en bas à droite, flèche magenta). Souris. Toutes les expériences avec des souris ont été effectués selon les directives du comité IACUC de l&#39;Hôpital pour enfants de Philadelphie. Femme B6.129 F1 souris de type sauvage ont été achetés auprès de Taconic (Germantown New York), logé à l&#39;animalerie de laboratoire à l&#39;Hôpital pour enfants de Philadelphie, et nourris de la souris diète 5015 du PMI Nutrition International (Richmond. Indiana). Étiquetage stratégie. En qualifiant l&#39;événement de cellules de première division avec CldU (marquées en vert dans ce schéma) et la division cellulaire deuxième UDI (marquées en rouge dans ce schéma), séquentielle des résultats de la division cellulaire dans les cellules co-labellisé avec les deux CldU et UDI (vert / rouge) . Les résultats représentatifs de la thymidine étiquetage du chiffre d&#39;affaires au sein de cellules pancréatiques chez la souris. L&#39;image d&#39;immunofluorescence d&#39;un pancréas de souris avec des îlots de Langerhans dans le centre. Souris a été infusé avec CldU pour 1 semaine et ensuite UDI pendant 2 semaines dans l&#39;eau potable avant de sacrifice immédiat. Échantillon de pancréas a été traitée comme décrit dans le protocole. 40x images objectives, avec des couches distinctes affiché adaptés pour le comptage. Images fusionnées contiennent DAPI (blanc) CldU (vert), l&#39;UDI (rouge), l&#39;insuline (jaune). (Supérieure, à gauche) DAPI et l&#39;insuline. (Supérieure, à droite) CldU et l&#39;insuline. (En bas, à gauche) UDI et l&#39;insuline. (En bas, à droite) CldU, les UDI, et l&#39;insuline. Barre d&#39;échelle: 100 microns. <img src="/files/ftp_upload/2166/2166fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Stratégie d&#39;étiquetage. En qualifiant l&#39;événement de cellules de première division avec CldU (marquées en vert dans ce schéma) et la division cellulaire deuxième UDI (marquées en rouge dans ce schéma), séquentielle des résultats de la division cellulaire dans les cellules co-labellisé avec les deux CldU et UDI (vert / rouge) . <img src="/files/ftp_upload/2166/2166fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Les résultats représentatifs de la thymidine étiquetage du chiffre d&#39;affaires au sein de cellules pancréatiques chez la souris. L&#39;image d&#39;immunofluorescence d&#39;un pancréas de souris avec des îlots de Langerhans dans le centre. Souris a été infusé avec CldU pour 1 semaine et ensuite UDI pendant 2 semaines dans l&#39;eau potable avant de sacrifice immédiat. Échantillon de pancréas a été traitée comme décrit dans le protocole. 40x images objectives, avec des couches distinctes affiché adaptés pour le comptage. Images fusionnées contiennent DAPI (blanc) CldU (vert), l&#39;UDI (rouge), l&#39;insuline (jaune). (Supérieure, à gauche) DAPI et l&#39;insuline. (Supérieure, à droite) CldU et l&#39;insuline. (En bas, à gauche) UDI et l&#39;insuline. (En bas, à droite) CldU, les UDI, et l&#39;insuline. Barre d&#39;échelle: 100 microns.

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Toutes les expériences avec des souris ont été effectuées dans l&#39;animalerie à l&#39;Hôpital pour enfants de Philadelphie selon les directives de la protection des animaux et du Comité institutionnel d&#39;utilisation (IACUC).

Notre approche de la thymidine approche fondée sur l&#39;étiquetage le renouvellement des cellules a de nombreuses applications potentielles dans la recherche biomédicale. À ce jour, nous nous sommes concentrés sur le pancréas, mais nous avons également appliqué cette stratégie pour examiner le renouvellement des cellules de la peau, intestin, foie, glandes surrénales, reins, testicules, des ovaires, la thyroïde, des ganglions lymphatiques, de l&#39;hématopoïèse, et le cerveau 1. Parce que le renouvellement des cellules varie d&#39;un tissu à des stratégies d&#39;étiquetage doivent être personnalisées afin d&#39;obtenir les informations les plus convaincantes de l&#39;organe d&#39;intérêt. Morrison et ses collègues ont utilisé CldU et UDI pour 1 journée chacun d&#39;étiqueter hématopoïèse 2. Kuhn et ses collègues utilisent CldU et UDI pour 4 jours chacun pour détecter la division cellulaire dans la régénération du myocarde 3. En revanche, nous avons utilisé CldU et UDI pour 9 mois au total pour étiqueter le renouvellement des cellules basales dans les îlots pancréatiques, un tissu avec le renouvellement des cellules minimes que l&#39;animal vieillit 1,4-6. L&#39;application la plus évidente le potentiel de notre stratégie d&#39;étiquetage est pour des études pour définir le renouvellement des cellules au sein de l&#39;homéostasie tissulaire. Mais notre technique a plusieurs autres applications potentielles. Par exemple, nous avons récemment appliqué cette technique pour identifier la transformation oncogénique dans les tissus, où des zones focales de réplication accrue peut être facilement identifié par incorporation accrue de CldU ou UDI 5. Morrison et ses collègues ont utilisé CldU et UDI pour 1 journée de dépistage de comportements étiquette conservant des cellules souches hématopoïétiques 2. Nous avons également appliqué séquentielle étiquetage analogue de la thymidine afin de déterminer si le transit d&#39;amplification des cellules contribuent à la croissance ou le renouvellement des tissus 1. Dans cette administration séquentielle de l&#39;application analogues de la thymidine représente une nouvelle approche pour étudier les origines et la survie des cellules impliquées dans l&#39;homéostasie tissulaire. Analogues de la thymidine ne doivent pas être utilisés sans précaution. Analogues de la thymidine synthétiques ont des toxicités potentielles pour les cellules en division, et leur utilisation pourrait théoriquement nuire renouvellement cellulaire chez les animaux en croissance. Analogues de la thymidine ont été utilisés comme agents radiosensibilisant pour les patients cancéreux, et peut ralentir le renouvellement des cellules. Ainsi, nous demandons aux enquêteurs de prudence enquêter pour toxicités potentielles dans leur tissu d&#39;intérêt. Par exemple, Trumpp et ses collègues constatent que systémique BrdU peut forcer les cellules souches hématopoïétiques pour entrer 7 du cycle cellulaire. Par exemple, Rutter et ses collègues ont observé que la dose élevée analogues de la thymidine sont toxiques pour le développement du pancréas 8. Plus récemment, Hellerstein et ses collègues de KineMed, Inc constaté que l&#39;administration de BrdU ralentit intra-îlot prolifération par 16-25% en utilisant une technique de propriétaires lourds étiquetage de l&#39;eau 9. Les préparations d&#39;îlots entiers utilisés par des collègues Hellerstein et contenait de nombreuses autres glandes endocrines et les types de cellules non endocriniennes, qui pourrait comprendre jusqu&#39;à 50% du total des préparations d&#39;îlots. Cependant, nous constatons que la perfusion prolongée de BrdU n&#39;influence pas la prolifération des cellules bêta chez les souris adultes jeunes, tel que mesuré par l&#39;expression de Ki67 4. De même, à long terme et de l&#39;administration de CldU UDI ne semble pas nuire à l&#39;expansion massive de cellules beta 1. Par ailleurs, le bêta taux de prolifération cellulaire sont équivalentes entre les deux souris étiqueté avec BrdU pendant de longues périodes de temps et de souris qui ne sont étiquetés pour quelques heures (les taux sont normalisés à des périodes de temps ou équivalent). Ensemble, ces résultats suggèrent que les souris peuvent en toute sécurité tolérer à long terme de faibles doses d&#39;administration d&#39;analogues de la thymidine. Pourtant, nous ne pouvons pas exclure une toxicité potentielle par des analogues de la thymidine dans la croissance des cellules bêta pancréatiques. En conséquence, nous continuons à effectuer des contrôles lors de l&#39;étiquetage des souris avec des analogues de la thymidine, et nous demandons instamment d&#39;autres chercheurs à le faire aussi bien. Notre technique de l&#39;étiquetage des analogues de la thymidine séquentiel n&#39;est pas sans embûches et de défis techniques. En conséquence, lames de contrôle sont particulièrement importants. Nous avons généré des lames de contrôle qui se composent de divers tissus de 1) Les souris qui ont été étiquetés que sous leur CldU;.. 2) Les souris qui ont été étiquetés que sous leur UDI;. 3) Les souris qui ont été étiquetés avec séquentielle CldU puis UDI; 4.) Les souris qui ont été étiquetés de façon séquentielle dans l&#39;ordre inverse, d&#39;abord avec UDI et ensuite CldU;. 5) Les souris qui sont étiquetés maquette avec de l&#39;eau seulement. Lors de l&#39;apprentissage d&#39;étiquette avec CldU et UDI, les enquêteurs devraient toujours effectuer l&#39;ensemble du protocole avec tous les 5 ensembles-dessus de diapositives à partir du tissu d&#39;intérêt. Une réactivité croisée légère entre CldU et UDI est un inconvénient regrettable, mais inévitable pour le marquage avec deux analogues de la thymidine. La technique CldU et UDI est basé sur les différences entre les deux antisérums affinités qui ont été initialement dérivée contre le BrdU dans différentes espèces (souris et rats). Notre protocole, tout en lourdeur, est conçu pour minimiser ces réactions croisées. Par conséquent, nous inciter à la prudence chez les enquêteurs qui considèrent sauter étape (s) du protocole. En particulier, nous avonsrencontré des problèmes avec les antisérums secondaires qui sont une réaction croisée entre la souris et le rat. Ceci peut être minimisée par l&#39;utilisation d&#39;antisérums Jackson qui sont totalement inter-adsorbé entre la souris et le rat. Nous faisons parfois ne parviennent pas à détecter adéquatement l&#39;incorporation de thymidine. Dans de tels cas, il est extrêmement important d&#39;utiliser des lames de contrôle positif à déterminer quel réactif ou pas n&#39;a pas de travail. Les difficultés sont généralement dues à des aliquotes mauvaise antisérums, lames sèches, ou inadéquates perméabilisation nucléaire. Nous avons échoué à développer avec succès l&#39;étiquette embryons avec UDI. Ainsi, tous les tissus peuvent être perméables à l&#39;UDI. Alternatives à CldU et UDI pour l&#39;étiquetage analogiques doubles thymidine sont à l&#39;horizon. Edu (5-éthinyl-2 désoxyuridine) peut être un substrat pour le cuivre catalyse chimie clic de détection 10,11. Méthodes de détection EdU ne nécessitent pas de séparation des brins d&#39;ADN, et donc très favorable à l&#39;analyse par 12 cytométrie en flux. Edu est compatible mais pas traverser réactif avec BrdU 10. Edu a été utilisé pour quantifier le renouvellement des cellules des différents tissus de souris dont les cellules bêta du pancréas 13, les cellules L intestinales et de l&#39;épiderme 14 15. Edu est assez cher pour le moment (1000 $ US par 500mg). Pourtant, la détection d&#39;Edu semble être beaucoup plus sensible que la détection de BrdU 10. Ainsi, il pourrait être économiquement faisable de combiner Edu et BrdU lieu de CldU et UDI. Cette méthode pourrait également permettre la détection de trois différents cycles de division cellulaire chez la souris triplement étiquetés pour Edu, CldU et UDI. En résumé, notre technique de marquage analogues de la thymidine séquentielle est une nouvelle approche pour détecter le renouvellement cellulaire. Nous espérons que notre approche permet aux scientifiques d&#39;autres à plus de quantifier avec précision la division cellulaire, et s&#39;attendre à ce qu&#39;il va ouvrir de nouveaux paradigmes dans l&#39;homéostasie tissulaire.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>5-chloro-2-deoxyuridine (CldU)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedical</td>
<td>0210547891</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedical</td>
<td>0210035701</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>4% Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USB</td>
<td>19943</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10% Buffered Formalin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>23-427-098</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XYLENES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>EM-XX0060-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethanol, Anhydrous (Histological)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>A405P-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS, 10X Powder Concentrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP665-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton &#x2013;X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP151-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrochloric Acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>BDH3028-2.5LG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal Donkey Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>017-000-121</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse Anti BrdU</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Pharmingen</td>
<td>347580</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat mab anti BrdU</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Accurate Chemical</td>
<td>OBT0030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy2 donkey anti-rat</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Immuno</td>
<td>712-225-153</td>
<td>Fully adsorbed secondaries from Jackson (minimal cross reactivity).</td>
</tr>
<tr>
<td>Cy5 donkey anti-mouse</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson immuno</td>
<td>715-175-151</td>
<td>See above</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass Cover Slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C9056-1CS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>YFP Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>49003 ET EYFP</td>
<td>Reduces auto-fluorescence in Cy2 channel</td>
</tr>
<tr>
<td>Cy3 Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>49004 ET Cy3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy5 Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>49006 ET Cy5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ORCA ER Microscope Camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>C4742-95-12ER</td>
<td>Excellent detection of fluorophores</td>
</tr>
<tr>
<td>ProLong Gold antifade reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36930</td>
<td>Do not use Vectashield (toxic to cyanine dyes).</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

immunofluorescent detection of two thymidine analogues (cldu and idu) in primary tissue

La mesure précise de la division cellulaire est un enjeu fondamental en biologie expérimentale qui devient de plus en plus complexe lorsque les cellules à division lente sont analysés. Les méthodes établies pour détecter la division cellulaire incluent une visualisation directe par microscopie en continu en culture cellulaire, la dilution des colorants vitaux tels que carboxyfluorescéine ester di-Aetate succinimidyle (CFSE), immuno-détection des antigènes mitogènes tels que Ki67 ou PCNA, et analogues de la thymidine. Analogues de la thymidine peut être détecté par une variété de méthodes, y compris la radio-détection pour la thymidine tritiée, l&#39;immuno-détection pour bromo-désoxyuridine (BrdU), chloro-désoxyuridine (CldU) et iodo-désoxyuridine (UDI), et la détection chimique de l&#39;éthinyl-désoxyuridine (UDE). Nous avons tiré une stratégie afin de détecter l&#39;incorporation séquentielle des analogues de la thymidine différents (CldU et UDI) dans les tissus de souris adultes. Notre méthode permet aux enquêteurs de quantifier avec précision deux tours successifs de la division cellulaire. En optimisant les protocoles immunomarquage notre approche peut détecter de très faibles analogues de la thymidine dose administrée via l&#39;eau potable, sûre d&#39;administrer à des souris pendant des périodes prolongées. Par conséquent, notre technique peut être utilisée pour détecter le renouvellement des cellules dans les tissus de très longue durée. Optimal résultats de coloration immunofluoresent peuvent être réalisés dans différents types de tissus multiples, y compris le pancréas, peau, intestin, foie, glandes surrénales, les testicules, les ovaires, la thyroïde, des ganglions lymphatiques, et le cerveau. Nous avons également appliqué cette technique pour identifier la transformation oncogénique dans les tissus. Nous avons encore appliqué cette technique pour déterminer si le transit d&#39;amplification des cellules contribuent à la croissance ou le renouvellement des tissus. En ce sens, l&#39;administration séquentielle des analogues de la thymidine représente une nouvelle approche pour étudier les origines et la survie des cellules impliquées dans l&#39;homéostasie tissulaire.

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Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

Nous avons tiré une stratégie afin de détecter l&#39;incorporation séquentielle des analogues de la thymidine (CldU et UDI) dans les tissus de souris adultes de quantifier deux tours successifs de la division cellulaire. Cette stratégie est utile pour détecter le renouvellement des cellules de la longue durée de vie des tissus, la transformation oncogène, ou de transit d&#39;amplification des cellules.

Détection d&#39;immunofluorescence Deux analogues de la thymidine (CldU et UDI) dans les tissus primaires

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

immunofluorescent-detection-two-thymidine-analogues-cldu-idu-primary

Research

JoVE Journal

Biology

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

30.4K vues.  University of Pennsylvania-School of Medicine. Nous avons tiré une stratégie afin de détecter l'incorporation séquentielle des analogues de la thymidine (CldU et UDI) dans les tissus de souris adultes de quantifier deux tours successifs de la division cellulaire. Cette stratégie est utile pour détecter le renouvellement des cellules de la longue durée de vie des tissus, la transformation oncogène, ou de transit d'amplification des cellules.

Vidéo: Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

L&#39;isolement et la culture primaire de cellules de foie de rat

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Recherche

Biologie

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Isolation des myofibroblastes primaires de souris et de tissus du côlon humain

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

Accurate identification and location of epithelial cells along the intestinal mucosal lining are essential to define different cell lineages. Proper imaging of intestinal tissues is crucial for identification of protein expression patterns with maximum resolution. This study aims to delineate the optimal methods and conditions for processing mouse intestinal tissues.

Amélioration Technique Swiss-laminage pour la préparation Intestinal des tissus pour immunohistochimique et immunofluorescence Analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

Coloration immunofluorescente in situ de l&#39;autophagie dans les cellules souches musculaires

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of these methods to non-model organisms. A series of protocols to optimize tissue collection from bats has been developed for a series of high-throughput sequencing approaches. Outlined here are protocols for the capture of bats, desired demographics to be collected for each bat, and optimized methods to minimize stress on a bat during tissue collection. Specifically outlined are methods for collecting and treating tissue to obtain (i) DNA for high molecular weight genomic analyses, (ii) RNA for tissue-specific transcriptomes, and (iii) proteins for proteomic-level analyses. Lastly, also outlined is a method to avoid lethal sampling by creating viable primary cell cultures from wing clips. A central motivation of these methods is to maximize the amount of potential molecular and morphological data for each bat and suggest optimal ways to preserve tissues so they retain their value as new methods develop in the future. This standardization has become particularly important as initiatives to sequence chromosome-level, error-free genomes of species across the world have emerged, in which multiple scientific parties are spearheading the sequencing of different taxonomic groups. The protocols outlined herein define the ideal tissue collection and tissue preservation methods for Bat1K, the consortium that is sequencing the genomes of every species of bat.

This is a protocol for the optimal tissue preparation for genomic, transcriptomic, and proteomic analyses of bats caught in the wild. It includes protocols for bat capture and dissection, tissue preservation, and cell culturing of bat tissue.

Collection de tissus de chauves-souris pour -Analyses d'omics et culture cellulaire primaire

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

Analyse du microbiote à l'aide de PCR en deux étapes et de la prochaine génération 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological substances or characterization of specific biological activities. However, due to the lack of universally applicable cell culture media and protocols, well described cell culture methods for marine organisms are still limited. Meanwhile, the commonly occurring microbial contamination and polytropic properties of marine invertebrate cells further impede the establishment of an effective cell culture strategy for marine invertebrates. Here, we describe an easy-to-handle method for culturing intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus; additionally, we provide an example of in vitro apoptosis induction and detection in primary cultured intestinal cells. Moreover, this experiment provides details about the appropriate culture medium and cell collection method. The described protocol is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea, and it can provide sufficient cells for multiple in vitro experimental applications. This technique would enable researchers to efficiently manipulate primary cell cultures from marine invertebrates and to facilitate the functional evaluation of targeted biological materials on cells.

This protocol provides an easy-to-handle method to culture the intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus and is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea.

Induction et détection d'apoptosis dans une culture primaire des cellules intestinales de concombre de mer

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to mitosis. Primary cilia can be visualized with highly sophisticated methods, including transmission electron microscopy, 3D imaging, or using software for the automatic detection of primary cilia. However, immunofluorescent staining of primary cilia is needed to perform these methods. This publication describes a protocol for the easy detection of primary cilia in vitro by staining acetylated alpha tubulin (axoneme) and gamma tubulin (basal body). This immunofluorescent staining protocol is relatively simple and results in high-quality images. The present protocol describes how four cell lines (C2C12, MEF, NHLF, and skin fibroblasts) expressing primary cilia were fixed, immunostained, and imaged with a fluorescent or confocal microscope.

Primary cilia are extracellular structures associated with the centriole. Primary cilia detection by immunofluorescent staining is a relatively simple procedure that results in extremely high-quality images. In this protocol, fibroblasts expressing primary cilia were fixed, immunostained, and imaged in a fluorescent or confocal microscope.

Détection simple des cils primaires par immunofluorescence

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related disorders continue to be a major contributor of deaths around the world, necessitating the need for even greater understanding of their pathobiology. Traditional antibody-based techniques like western blotting or immunohistochemistry suffer from being low-throughput besides being labor-intensive and qualitative or semi-quantitative. Even conventional mass spectrometry-based shotgun approaches fail to provide conclusive evidence to support a certain hypothesis. Targeted proteomics approaches are largely hypothesis driven and differ from the conventional shotgun proteomics approaches that have been long in use. Multiple reaction monitoring is one such targeted approach that requires the use of a special mass spectrometer called the tandem quadrupole mass spectrometer or triple quadrupole mass spectrometer. In the current study, we have systematically highlighted the major steps involved in performing a successful tandem quadrupole mass spectrometry-based proteomics workflow using human brain tissue with an aim to introduce this workflow to a broader research community.

The protocol aims to introduce the use of a triple quadrupole mass spectrometer for Multiple Reaction Monitoring (MRM) of proteins from clinical samples. We have provided a systematic workflow starting from sample preparation to data analysis for clinical samples with all the necessary precautions to be taken.

Flux de travail protéomique quantitative utilisant la détection basée sur la surveillance des réactions multiples des protéines du tissu cérébral humain

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are highly efficient at virus transmission plays a key role in virus epidemics in fields. Studying virus-insect vector interactions can advance our understanding of virus transmission and epidemics with the aim of designing novel strategies to control plant viruses and their vector insects. Immunofluorescence labeling has been widely used to analyze interactions between pathogens and hosts and is used here in the white-backed planthopper (WBPH, Sogatella furcifera), which efficiently transmits the southern rice black streaked dwarf virus (SRBSDV, genus Fijivirus, family Reoviridae), to locate the virions and insect proteins in the midgut epithelial cells. Using laser scanning confocal microscopy, we studied the morphological characteristics of midgut epithelial cells, cellular localization of insect proteins, and the colocalization of virions and an insect protein. This protocol can be used to study virus activities in insects, functions of insect proteins, and interactions between virus and vector insect.

This protocol for immunofluorescent labeling of both plant virus proteins and vector insect proteins in excised insect guts can be used to study interactions among virus and vector insects, insect protein functions and molecular mechanisms underlying virus transmission.

Marquage immunofluorescent de protéines de virus végétaux et d’insectes vecteurs dans les intestins d’hémiptères

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...