Ce protocole permet une détection rapide et facile des cils primaires dans les cellules de culture, dans une variété d’efforts de recherche. La méthode pourrait être utilisée dans le désordre qui affectent les corps basiques des cils primaires. Cette procédure peut également être appliquée pour colorer les cils primaires dans les tissus incorporés paraffine ou pour d’autres expériences où la fluorescence est nécessaire.
Commencez par autoclaving 22 par 22 millimètres de glissements de couverture, et la préparation des matériaux pour l’expérience. Décongeler le FBS et la streptomycine de pénicilline, et réchauffer la culture à température moyenne à ambiante. Passer les cellules avec trypsine EDTA et PBS.
Préparez du paraformaldéhyde frais à 4 %, un milieu de culture et une solution de gélatine à 1 %, selon les directives manuscrites. Nettoyez ensuite le capot d’écoulement laminaire avec 70 % d’éthanol et placez tous les matériaux nécessaires à l’intérieur. Le paraformaldéhyde est extrêmement dangereux.
L’EPI approprié doit être porté en tout temps, et il ne doit être manipulé que dans une hotte chimique. Après avoir augmenté les cellules désirées à 70%confluence les enlever de l’incubateur, et les placer dans le capot d’écoulement laminaire. Retirer le milieu de culture et rincer les cellules deux fois avec PBS.
Ajouter environ deux millilitres de 0,25% trypsine EDTA à la fiole de culture, et l’incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Vérifiez périodiquement les cellules sur le microscope inversé pour surveiller le détachement. Lorsque les cellules se sont détachées doucement les resuspendre en 10 millilitres de milieu de culture, pipetting soigneusement pour créer une suspension à cellule unique.
Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 millilitres et la centrifuger à 200 fois G’pendant cinq minutes. Décanter le supernatant puis ajouter 10 millilitres de milieu de culture, et doucement resuspendre la pastille. Prenez 20 microlitres de la suspension cellulaire et mélangez-le avec du bleu trypan à un rapport volume un pour un.
Comptez ensuite les cellules à l’aide de l’hémocytométrie standard. Placez un glissement de couvercle à l’intérieur de chaque puits d’une plaque de six puits, et enrober le bordereau de couverture de deux millilitres de la solution de gélatine, ce qui aidera les cellules attachées à la feuille de couverture. Retirer la gélatine et laisser sécher l’assiette à l’air libre pendant quelques minutes.
Ensemencer 100 000 fibroblastes dans chaque puits et ajouter deux millilitres de milieu de culture. Puis incuber les cellules pendant 24 heures à 37 degrés Celsius, cinq pour cent de dioxyde de carbone, et 90% d’humidité relative. Après l’incubation traiter les cellules pour induire la ciliation.
Réchauffez le paraformaldéhyde de 4% à température ambiante, et préparez une pipettes de pâturage, ABS, un récipient de déchets, tubes coniques de 15 millilitres, micro pipettes, et bouts. Prenez les cellules de l’incubateur, et placez-les sur le banc du laboratoire. Retirez les supports de chaque puits, en laissant le bordereau de couverture.
Lavez doucement les cellules trois fois avec deux millilitres de PBS. Ajoutez ensuite deux millilitres de la PFA de 4% dans chaque puits pour fixer les cellules. Incuber la plaque pendant 10 minutes à température ambiante, puis retirer le PFA, et répéter les lavages avec PBS.
Ajouter deux millilitres de 0,5% Triton X-100 à chaque puits, et incuber la plaque pendant 15 minutes. Ensuite, lavez les puits quatre fois avec PBS. Pour faire la solution de blocage, décongeler un sérum de chèvre pendant cinq minutes, et le diluer dans PBS à un rapport d’un à 20.
Ajouter 150 microlitres de cette solution à chaque glissement de couvercle, et incuber la plaque pendant 20 minutes. Décongeler les anticorps primaires pendant cinq minutes, et les diluer séparément dans PBS, tel que décrit dans le manuscrit du texte. Retirez la solution de blocage des feuillets de couvercle et ajoutez 150 microlitres des deux solutions d’anticorps.
Ensuite, incuber la plaque pendant 60 minutes à température ambiante. Retirez les anticorps primaires et lavez doucement les feuillets de couverture trois fois avec deux millilitres de PBS. Diluer cy3 mouton anti-souris et Alexa fluor 488 chèvre anti-lapin en PBS, à un rapport de un à 300, et ajouter 150 microlitres des deux solutions d’anticorps secondaires à la feuille de couverture.
Préparez une solution DAPI de travail en diluant 10 microlitres du stock en 50 millilitres de PBS, et ajoutez deux millilitres de cette dilution aux glissements de couverture. Incuber la plaque pendant cinq minutes dans l’obscurité, à température ambiante. Avant de placer les feuillets de couverture sur les glissières, préparez deux aiguilles, pinces à épiler et supports de montage, et étiquetez toutes les diapositives.
Retirez la solution DAPI des puits et lavez-les trois fois avec du PBS. Mettez une goutte de supports de montage sur chaque diapositive. Utilisez l’aiguille pour soulever doucement le glissement du couvercle du fond du puits.
Ensuite, retournez-le et placez-le doucement sur la goutte de supports de montage à l’aide de la pince à épiler. Retirez soigneusement les bulles. Protégez les glissières de la lumière et rangez-les toute la nuit à quatre degrés Celsius.
Le lendemain, utilisez un microscope fluorescent ou confocal avec un grossissement élevé pour visualiser les cils primaires. Ce protocole a été utilisé pour fixer l’immunostain, et l’image de diverses lignées cellulaires exprimant des cils primaires. Quand les myoblastes de souris ont été exposés au rayonnement ionisant à diverses doses, il a été constaté que des doses plus élevées induisent l’aspect des cils primaires multiples.
Tandis que de faibles doses ont eu comme conséquence l’aspect des cils primaires simples. De même, quand les fibroblastes humains de poumon ont été rayonné à une basse dose, les cils primaires simples ont été détectés par immunofluorescence. Une augmentation des cils primaires a été observée chez les fibroblastes embryonnaires de souris qui étaient affamés, démontrant que le stress métabolique affecte les incidents des cils primaires.
Quand les fibroblastes de peau ont été traités avec 120 doxorubicine nanomolaire, ils ont exprimé un cil primaire simple. Des doses plus élevées induisent l’apparition de cils primaires multiples. Les fibroblastes traités avec 1,25 nanomolaire Taxol ont également exprimé un seul cil primaire.
Mais les cils multiples n’ont pas été détectés après traitement avec des doses plus élevées. Lors de l’ouverture de ce protocole assurez-vous de suivre tous les règlements PPE. Gardez à l’esprit les besoins culturels de votre lignée cellulaire de choix et choisissez soigneusement vos anticorps.
Cette procédure ne peut pas être suivie directement par d’autres procédures, puisque les cellules sont irrécupérables. Au lieu de cela, des expériences parallèles devraient être programmées.
