Ce travail a été partiellement financé par le gouvernement espagnol &quot;Ministerio de Educación y Ciencia&quot; (projet AGL2008-05275-C01/ALI), par la Commission européenne cadre sur l&#39;union de recherche 7 projets financés VIROBATHE (contrat n ° 513648), VIROCLIME (contrat n ° 243923 ) et par l&#39;Agence Catalane de l&#39;Eau, Agencia Catalana de l&#39;Aigua (ACA), Departament de contrôle i dels Millora Ecosistemes Aquatics. Au cours de l&#39;étude ont développé Marta Rusiñol était un membre de la Generalitat &quot;AGAUR&quot; (FI-DGR).

1. La concentration des particules virales présentes dans les échantillons d&#39;eau <ol><li> Collecte et conditionnement des échantillons d&#39;eau <ol><li> Recueillir un minimum de 2 répétitions de 10 L par échantillon dans des contenants en plastique à fond plat et un échantillon supplémentaire comme un contrôle de processus. Ce dernier échantillon sera dopé avec une quantité connue de particules virales et utilisé comme contrôle. Note: Il est recommandé d&#39;avoir du matériel spécial séparé (bouteilles, tubes, etc) pour les échantillons dopés. </li><li> Vérifiez l&#39;étalonnage du conductimètre et recalibrer si nécessaire. Préparer un témoin négatif en utilisant l&#39;eau du robinet préalablement ajusté à la conductivité adéquate (voir ci-dessous 1.6) dans un récipient en plastique 10 supplémentaires L. </li><li> Pour des échantillons enrichis: Ajouter le volume standard du virus de la commande (environ 10 5 copies du génome par 10 L d&#39;eau) à l&#39;échantillon. Mélanger en remuant éclaboussures éviter et les aérosols. Les contrôles positifs pourrait consister en une souche rare de l&#39;adénovirus sUCH que HAdV-35 ou un bactériophage, comme MS2. </li><li> Si l&#39;échantillon présente la quantité élevée de matières en suspension (sable ou autres matériaux), il laisse des sédiments pendant 15 minutes. Transfert de l&#39;eau dans un nouveau récipient. </li><li> Ajuster le pH de l&#39;échantillon d&#39;eau à 3,5 (± 0,1) par l&#39;ajout de HCl 1 N. Cette étape est importante pour la concentration des virus, alors assurez-vous que le pH a été ajusté correctement. Mélangez soigneusement l&#39;eau par une agitation vigoureuse, tout en ajoutant de l&#39;HCl. (Remarque: Si le pH est inférieur à 3,5 ajouter du NaOH 1 M). </li><li> Ajuster la conductivité. Si l&#39;échantillon possède une conductivité de 1500 uS / cm ou plus, cette étape n&#39;est pas nécessaire. Si la conductivité est inférieure à 1500 uS / cm la formation de matière floculée (flocs) n&#39;est pas garanti pour ajuster la conductivité à 1500 uS / cm par l&#39;ajout de sels de mer artificielle (Sigma). Mélanger vigoureusement par l&#39;agitation tout en ajoutant le sel marin. </li><li> Notez le pH des échantillons avant et après le conditionnement ainsi unes le volume de HCl utilisé. La conductivité devrait également être enregistré après ajustement du pH. Toujours désinfecter les électrodes pH-mètre et conductimètre avec une solution fraîche HCl, avec une solution de sodium déchlorer tiosulphate 10% et enfin rincer à l&#39;eau distillée. </li></ol></li><li> Préparation de la pré-floculées lait écrémé 1% (PSM) <ol><li> Vérifiez l&#39;étalonnage du pH-mètre et le conductimètre et recalibrer si nécessaire. </li><li> Préparer pré-floculées solution de lait écrémé (1% du PSM, p / v) en dissolvant 10 g de poudre de lait écrémé (Difco) dans une eau de mer artificielle L (dissoudre 33,3 g de sels de mer artificielle dans 1 L d&#39;eau du robinet déchlorée et autoclave) et soin d&#39;ajuster le pH à 3,5 avec HCl 1N. Les flocs doit être visible. Préparer la solution juste avant d&#39;être utilisés ou conserver à 4 ° C pendant 24 h. Pour déchloration utiliser 1 ml de solution tiosulphate 10% par 100 ml d&#39;eau. </li></ol></li><li> La floculation des particules virales présentes dans les échantillons d&#39;eau<ol><li> Ajouter 100 ml de PSM 1% à l&#39;échantillon d&#39;eau de 10 L. </li><li> Incorporer les échantillons pour les 8-10 h pour permettre à des virus à adsorber les flocs. Utilisez une minuterie pour arrêt de l&#39;agitation après 8-10 h. </li><li> Arrêtez l&#39;agitation et laisser les sédiments des flocs par gravité pour les 8-10 h. </li></ol></li><li> Collecte et re-dissoudre les flocs. Centrifugation <ol><li> Eliminer le surnageant à l&#39;aide d&#39;une pompe péristaltique et une pipette en plastique relié à un tube en plastique. Pour des échantillons dopés le surnageant doit être recueilli dans une bouteille et désinfectés conformément aux procédures internes. Dans tous les cas prendre soin de ne pas recueillir le culot. </li><li> Recueillir les sédiments avec les flocs (environ 500 ml) dans une bouteille centrifugeuse. </li><li> Équilibre les pots par l&#39;ajout de 3,5 pH PSM. </li><li> Centrifuger les pots dans une centrifugeuse à grande vitesse à 8000 xg pendant 30 min à 4 ° C. Dès que la centrifugeuse s&#39;arrête, retirez soigneusement les pots à centrifuger de la centrifugeuse. </li><li> Très gently égoutter et jeter le surnageant. Suivez les mesures appropriées pour le matériel infectieux. </li><li> Ajouter 7 ml de tampon phosphate de dissoudre le culot dans chaque bouteille centrifugeuse. </li><li> Une fois les flocs ont été dissous, de mesurer et ajouter un tampon phosphate pour atteindre un volume total de 10 ml. </li><li> Homogénéiser le concentré virale par vortex et de distribuer les 10 ml dans des microtubes propres qui doivent être congelés à -80 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire dans l&#39;analyse plus loin. </li></ol></li></ol> 2. Extraction des acides nucléiques <ol><li> Effectuer une extraction des acides nucléiques avec le kit QIAamp Viral RNA Mini en suivant les instructions du fabricant. Ce kit permet l&#39;utilisation d&#39;une plate-forme automatisée (comme QIAcube, Qiagen). </li></ol> 3. PCR quantitative des adénovirus humains (HAdV), polyomavirus JC (JCPyV), adénovirus porcins (PADV) et polyomavirus bovin (BPYV) <ol><li> Quantification des copies du génome dans les échantillons <ol><li> Préparerle mix de qPCR dans un endroit propre séparé en utilisant l&#39;environnement TaqMan PCR Master Mix 2x (Applied Biosystems). La réaction a lieu dans une plaque de réaction de 96 puits recouverts de couvertures optiques colle optique. Les concentrations de l&#39;Mix Master, les amorces et les sondes sont décrites dans le Tableau 1. </li><li> Une fois le mélange a été préparé, 15μl aliquotes dans chaque puits, y compris les contrôles (voir 3.2). Le volume total pour une réaction après addition de 25 pi cible sera (mélange 15μl d&#39;échantillon + 10 ul ou standard). </li><li> Ajouter les extractions d&#39;acides nucléiques à partir des échantillons (10 pi) dans une zone séparée. Exécuter direct et une dilution au dixième dans l&#39;eau purifiée de chaque échantillon en double. Couvrir les puits contenant les échantillons avec une partie d&#39;un couvercle adhésif, gardez l&#39;autre partie de la couverture pour l&#39;étape suivante. </li><li> Ajouter des dilutions de la suspension standard de l&#39;ADN (10 ul) de 10 0 à 10 6 GC/10μl par trois exemplaires, et en utilisant une micropipette utilisée exclusivement pour le stanl&#39;ADN standard. Il est conseillé d&#39;ajouter des normes dans un secteur équipé de rayons UV pour détruire l&#39;ADN plasmidique et de nettoyer la micropipette après chaque utilisation. Couvrir les puits contenant les normes avec le couvercle adhésif pré-coupés. Remarque: Pour préparer des suspensions standard pour être utilisée dans la quantification de copies du génome, la région d&#39;ADN cible doit être cloné dans un plasmide et linéarisé. Dans l&#39;adresse suivante, vous trouverez une procédure détaillée sur la façon de créer des courbes standard avec les modèles d&#39;ADN plasmidique à être utilisés dans qPCR: <a href="http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf">http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf</a> </li><li> Effectuez la qPCR dans un système adéquat sélectionnant les paramètres appropriés (en considérant l&#39;utilisation de la couverture adhésif et le volume total dans chaque puits, etc.) Après activation de l&#39;AmpliTaq Gold pendant 10 min à 95 ° C, 40 cycles d&#39;amplification sont effectués comme suit: 15 s à 95 ° Cet 1 min à 60 ° C pour HAdV, JCPyV et BPYV, et 15 s à 95 ° C, 20s à 55 ° C et 20s à 60 ° C pour PADV. </li><li> Une fois les réactions terminées, stocker des données et des résultats tels que décrits dans le manuel de l&#39;utilisateur de l&#39;équipement utilisé. La quantité d&#39;ADN va être définie comme la médiane des données obtenues après la correction du facteur de dilution si nécessaire. </li></ol></li><li> Contrôles <ol><li> Utiliser des contrôles positifs et négatifs. Le dosage doit inclure plus d&#39;un non-modèle de contrôle (NTC) pour prouver mélange ne produit pas de fluorescence. Il est conseillé d&#39;exécuter le contrôle des processus positifs en vue d&#39;évaluer le potentiel d&#39;inhibition enzymatique due aux inhibiteurs présents dans les échantillons étudiés. </li><li> Consigner les résultats des analyses qPCR de deux différentes dilutions de l&#39;ADN standard et du contrôle de processus. Utiliser les résultats pour préparer les cartes de contrôle pour le contrôle qualité (CQ) des programmes liés à la sensibilité et l&#39;efficacité des tests. </li></ol></li><li> Confirmation desles résultats <ol><li> Des résultats positifs peuvent être encore confirmés par séquençage PCR nichée et nucléotidiques des amplicons, la production de données supplémentaires sur les séquences nucléotidiques des souches détectées 1,5,6,7,9,12. </li></ol></li></ol> Suite à la procédure décrite, les virus humains et animaux ont été détectés et quantifiés dans les eaux de baignade, l&#39;eau de mer et des eaux fluviales 2,3. Comme un exemple représentatif, des échantillons d&#39;eau souterraine des zones présentant des niveaux élevés de nitrates ont été évalués pour définir les sources de la contamination. Échantillons d&#39;eau de dix litres ont été collectés à partir de 4 différents puits dans les zones rurales d&#39;une région du nord de l&#39;Espagne. Cinq répétitions ont été collectées dans chaque puits étant une répétition ensemencé avec deux adénovirus humain utilisé comme contrôle de processus. Les échantillons ont été traités selon le protocole représenté dans la figure 1. Les quatre répétitions analysé dans l&#39;un des quatre sites étudiés ont montré des résultats positifs pour PADV (valeur moyenne 7,74x10 2 GC / L) qui serait lié à la présence de boues de porc dans les zones entourant le site d&#39;échantillonnage et appuierait la contamination fécale porcine comme la source de nitrates dans les eaux souterraines (tableau 2). 4. Les résultats représentatifs: <img src="/files/ftp_upload/2820/2820fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Procédure pour la détection et la quantification des virus dans l&#39;eau. <img src="/files/ftp_upload/2820/2820table1.jpg" alt="Tableau 1" /> Tableau 1. Concentration des amorces et des sondes pour les tests qPCR. <img src="/files/ftp_upload/2820/2820table3.jpg" alt="Tableau 3" /> Tableau 2. Détection et quantification des adénovirus humains et animaux et les polyomavirus dans les échantillons d&#39;eau souterraine. n nombre de répétitions analysées Pourcentage% de positifs se réplique (-) Non détecté

<ol>
	<li>Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Major, E. O., Curfman, B., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+excreted+JC+virus+strains+and+their+potential+oral+transmission.">Analysis of the excreted JC virus strains and their potential oral transmission.</a> J. Neurovirol. 9 (4), 498-507 (2003).</li><li>Bofill-Mas, S., Albinana-Gimenez, N., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Rodriguez-Manzano, J., Allard, A., Calvo, M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+stability+of+human+adenoviruses+and+polyomavirus+JCPyV+in+wastewater+matrices.">Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7894-7896 (2006).</li><li>Calgua, B., Mengewein, A., Grunert, A., Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Wyn-Jones, A. P., López-Pila, J. M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+a+one-step+low+cost+procedure+to+concentrate+viruses+from+seawater+samples.">Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples.</a> J. Virol. Methods. 153 (2), 79-83 (2008).</li><li>Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+factors+influencing+human+viral+pathogens+and+their+potential+indicator+organisms+in+the+blue+mussel,+Mytilus+edulis:+the+first+Scandinavian+report.">Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 4523-4533 (2002).</li><li>Hundesa, A., Bofill-Mas, S., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Rodriguez-Manzano, C., Bach, J., Casas, A., M, ., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+quantitative+PCR+assay+for+the+quantitation+of+bovine+polyomavirus+as+a+microbial+source-tracking+tool.">Development of a quantitative PCR assay for the quantitation of bovine polyomavirus as a microbial source-tracking tool.</a> J. Virol. Methods. 163 (2), 385-389 (2010).</li><li>Hundesa, A., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Albinana-Gimenez, C., Rodriguez-Manzano, N., Bofill-Mas, J., Suñen, S., E, ., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+qPCR+assay+for+the+quantification+of+porcine+adenoviruses+as+an+MST+tool+for+swine+fecal+contamination+in+the+environment.">Development of a qPCR assay for the quantification of porcine adenoviruses as an MST tool for swine fecal contamination in the environment.</a> J. Virol. Methods. 158 (1-2), 130-135 (2009).</li><li>Hundesa, A., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Bofill-Mas, C., Albinana-Gimenez, S., N, ., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+and+animal+adenoviruses+and+polyomaviruses+for+determination+of+sources+of+fecal+contamination+in+the+environment.">Identification of human and animal adenoviruses and polyomaviruses for determination of sources of fecal contamination in the environment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7886-7893 (2006).</li><li>Layton, B. A., Walters, S. P., Lam, L. H., Boehm, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterococcus+species+distribution+among+human+and+animal+hosts+using+multiplex+PCR.">Enterococcus species distribution among human and animal hosts using multiplex PCR.</a> J. Appl. Microbiol. 109, 539-547 (2010).</li><li>de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Clemente-Casares, C., Hundesa, P., Mart&#237;n, M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+bovine+and+porcine+adenoviruses+for+tracing+the+source+of+fecal+contamination.">Detection of bovine and porcine adenoviruses for tracing the source of fecal contamination.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70 (3), 1448-1454 (2004).</li><li>Pal, A., Sirota, L., Maudru, T., Peden, K., Lewis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+assays+for+the+detection+of+virus-specific+DNA+in+simples+with+mixed+populations+of+polyomaviruses.">Real-time PCR assays for the detection of virus-specific DNA in simples with mixed populations of polyomaviruses.</a> J. Virol. Methods. 135 (1), 32-42 (2006).</li><li>Stapleton, C. M., Kay, D., Wyer, D. a. v. i. e. s., Watkins, C., Kay, J., McDonald, C., Porter, A. T., J, ., Gawler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+operational+utility+of+a+Bacteroidales+quantitative+PCR-based+MST+approach+in+determining+the+source+of+faecal+indicator+organisms+at+a+UK+bathing+water.">Evaluating the operational utility of a Bacteroidales quantitative PCR-based MST approach in determining the source of faecal indicator organisms at a UK bathing water.</a> Water Res. 43, 4888-4899 (2010).</li><li>Wang, J., Horner, G. W., Keef, O., S, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+molecular+characterization+of+bovine+polyomavirus+in+bovine+sera+in+New+Zealand.">Detection and molecular characterization of bovine polyomavirus in bovine sera in New Zealand.</a> N. Z. Vet. J. 53, 26-30 (2005).</li></ol>

Deux demandes de brevet ont été déposées en 2009 pour protéger la propriété intellectuelle de protocoles de quantification des PADV et BPYV.

<html> La procédure décrite remplirait les conditions pour une méthode d&#39;ajustement de routine des laboratoires de santé publique et d&#39;environnement: reproductible, fiable, simple et rentable. Le protocole est simple, mais elle doit être suivie attentivement. Faible conductivité dans les échantillons sans ajout de la concentration de sels demandé l&#39;eau de mer artificielle réduirait considérablement la récupération des virus comme ce serait le cas si le temps d&#39;agitation pour la floculation est...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Centrifugeuse à vitesse élevée (8000 xg) </td><td> Berckman Coulter </td><td> Avanti J-20XP </td><td></td></tr><tr><td> pH-mètre, thermomètre et conductimètre </td><td> Afora </td><td> LPPC3003 </td><td></td></tr><tr><td> Plastique Longueur des tubes cm 100-200 </td><td> Deltalab </td><td> 350059 </td><td></td></tr><tr><td> Stérile pipettes graduées jetables </td><td> Labclinics </td><td> PN10E1 </td><td></td></tr><tr><td> Stérile tubes en plastique de 1,5 et 10-15 ml (Eppendorf, faucons, etc) </td><td> Afora </td><td> KA298/00 </td><td></td></tr><tr><td> Des pots à centrifuger (500 ml) </td><td> Fisher Scientific </td><td> SE5753512 </td><td></td></tr><tr><td> Agitateurs magnétiques et aimants (un parl&#39;échantillon) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10510 </td><td></td></tr><tr><td> Les récipients en verre ou en plastique ayant un fond plat pour permettre l&#39;utilisation d&#39;agitateurs magnétiques </td><td> Deltalab </td><td> 191642 </td><td></td></tr><tr><td> Une pompe péristaltique pour enlever le surnageant (ou une pompe à vide au jet d&#39;eau) </td><td> Watson-Marlow </td><td> 323E / D </td><td></td></tr><tr><td> Timer pour arrêt de l&#39;agitation après 8-10 heures </td><td> Deltalab </td><td> 900400 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;acide chlorhydrique (1N et 0,1) </td><td> Panreac </td><td> 141020.1611 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;hydroxyde de sodium (1N) </td><td> Panreac </td><td> 131687.1211 </td><td></td></tr><tr><td> Artificial sels de mer eau de mer </td><td> Sigma </td><td> S9883 </td><td></td></tr><tr><td> Lait écrémé (SM) </td><td> Difco </td><td> 232100 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon phosphate pH 7, 5 </td><td></td><td></td><td> 01:02 v / v de stériles Na 2 HPO 4 0,2 M et NaH 2 PO 4 0,2 M à pH 7,5 </td></tr><tr><td> Thiosulfate </td><td> Panreac </td><td> 121879.1209 </td><td> Faire une solution à 10% dans l&#39;eau </td></tr><tr><td> QIAamp Viral RNA Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 52904 </td><td></td></tr><tr><td> Plaque de 96 puits de réaction optique (500 unités) </td><td> Applied Biosystems </td><td> 43426659 </td><td></td></tr><tr><td> Optique couvre adhésives (100 unités) </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311971 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan environnement PCR Master Mix 2x </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4396838 </td><td></td></tr></tbody></table>

cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses

La contamination microbienne de l&#39;environnement représente un risque significatif pour la santé. Classique bactérienne indicateurs fécaux ont montré pour avoir des limites importantes, les virus sont plus résistants aux procédés d&#39;inactivation de nombreux standards et indicateurs fécaux n&#39;informent pas sur la source de contamination. Le développement de méthodes rentables pour la concentration de virus dans l&#39;eau et des dosages moléculaires facilite l&#39;applicabilité de virus comme indicateurs de contamination fécale et en tant que sources de pollution microbienne de suivi (MST) des outils. Les adénovirus sont des virus et des polyomavirus ADN infectant les espèces de vertébrés spécifiques, y compris les humains et sont excrétés dans les selles persistante et / ou d&#39;urine dans toutes les zones géographiques étudiées. Dans des études précédentes, nous avons suggéré la quantification des adénovirus humains (HAdV) et polyomavirus JC (JCPyV) par PCR quantitative (qPCR) comme un indice de contamination fécale humaine. Récemment, nous avons développé des tests qPCR pour la quantification spécifique du poradénovirus ciné (PADV) et polyomavirus bovin (BPYV) comme marqueurs fécaux des animaux de la contamination avec des sensibilités de 10 à 10 copies de génome par tube d&#39;essai. Dans cette étude, nous présentons la procédure à suivre pour identifier la source de contamination dans les échantillons d&#39;eau à l&#39;aide de ces outils. Comme exemple de résultats représentatifs, l&#39;analyse des virus dans les eaux souterraines présentant des niveaux élevés de nitrates est affiché. Détection des virus à faible ou modérée des eaux polluées requiert de la concentration du virus dans au moins plusieurs litres d&#39;eau dans un volume beaucoup plus petit, une procédure qui comporte généralement deux étapes de concentration en série. Cette procédure un peu lourde et la variabilité observée dans les recouvrements virale entravent de manière significative le traitement simultané d&#39;un grand nombre d&#39;échantillons d&#39;eau. Afin d&#39;éliminer le goulot d&#39;étranglement causés par les procédures en deux étapes, nous avons appliqué un protocole en une seule étape développé dans Studie précédentes et applicables à une diversité de matrices d&#39;eau. La procédure comprend: l&#39;acidification des échantillons d&#39;eau de dix litres, floculation par du lait écrémé, de la sédimentation par gravité des matériaux floculées, la collecte du précipité et la centrifugation, resuspension du précipité dans un tampon phosphate 10 ml. Le concentré viral est utilisé pour l&#39;extraction d&#39;acides nucléiques viraux et les adénovirus et les polyomavirus spécifiques d&#39;intérêt sont quantifiés par qPCR. Nombre élevé d&#39;échantillons peuvent être analysés simultanément en utilisant cette méthode de concentration à faible coût. La procédure a été appliquée à l&#39;analyse des eaux de baignade, l&#39;eau de mer et d&#39;eau de la rivière et dans cette étude, nous présentons l&#39;analyse des résultats des échantillons d&#39;eau souterraine. Cette méthode quantitative à haut débit est fiable, simple et rentable.

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Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

L&#39;étude décrit une méthode rentable pour l&#39;identification de la source de contamination fécale / urinaire ou de la contamination par les nitrates dans l&#39;eau en utilisant qPCR pour la quantification spécifique du virus de l&#39;ADN humain / porcin / bovin, les adénovirus et les polyomavirus, a proposé que les outils MST.

Rentable méthode de suivi des sources microbiennes spécifiques utilisant des virus humains et animaux

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

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12.1K vues.  University of Barcelona. L'étude décrit une méthode rentable pour l'identification de la source de contamination fécale / urinaire ou de la contamination par les nitrates dans l'eau en utilisant qPCR pour la quantification spécifique du virus de l'ADN humain / porcin / bovin, les adénovirus et les polyomavirus, a proposé que les outils MST.

Vidéo: Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Combinaison de adhésif à base de bandes d&#39;échantillonnage et de fluorescence In situ</emHybridation> pour la détection rapide des Salmonella Sur les produits frais

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Recherche

Immunologie et infection

Comprehensive &amp; Cost Effective Laboratory Monitoring of HIV/AIDS: an African Role Model

We present the video about assisting anti-retroviral therapy (ART) by an apt laboratory service - representing a South-African role model for economical large scale diagnostic testing. In the low-income countries inexpensive ART has transformed the prospects for the survival of HIV seropositive patients but there are doubts whether there is a need for the laboratory monitoring of ART and at what costs - in situations when the overall quality of pathology services can still be very low. The appropriate answer is to establish economically sound services with better coordination and stricter internal quality assessment than seen in western countries. This video, photographed at location in the National Health Laboratory Services (NHLS-SA) at the Witwatersrand University, Johannesburg, South Africa, provides such a coordinated scheme expanding the original 2-color CD4-CD45 PanLeucoGating strategy (PLG). Thus the six modules of the video presentation reveal the simplicity of a 4-color flow cytometric assay to combine haematological, immunological and virology-related tests in a single tube. These video modules are: (i) the set-up of instruments; (ii) sample preparations; (iii) testing absolute counts and monitoring quality for each sample by bead-count-rate; (iv) the heamatological CD45 test for white cell counts and differentials; (v) the CD4 counts, and (vi) the activation of CD8+ T cells measured by CD38 display, a viral load related parameter. The potential cost-savings are remarkable. This arrangement is a prime example for the feasibility of performing &gt; 800-1000 tests per day with a stricter quality control than that applied in western laboratories, and also with a transfer of technology to other laboratories within a NHLS-SA network. Expert advisors, laboratory managers and policy makers who carry the duty of making decisions about introducing modern medical technology are frequently not in a position to see the latest technical details as carried out in the large regional laboratories with huge burdens of workload. Hence this video shows details of these new developments.

Anti-retroviral therapy to treat HIV/AIDS is monitored in South Africa on a large scale. Flow cytometry is combined for haematology (CD45), immunology (CD4) and viral-load linked CD38 assay. Recorded at NHLS-SA laboratories, Johannesburg, these modern methods are cost-efficient with heightened local internal quality control, serving as role-models for resource-limited diagnostics.

Coût global de surveillance et de laboratoire efficace du VIH / sida: un modèle en Afrique

We present the video about assisting anti-retroviral therapy (ART) by an apt laboratory service - representing a South-African role model for economical ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant reservoir of iron inside the human host is heme, which is the cofactor of hemoglobin. To acquire iron from hemoglobin, S. aureus utilizes an elaborate system known as the iron-regulated surface determinant (Isd) system1. Components of the Isd system first bind host hemoglobin, then extract and import heme, and finally liberate iron from heme in the bacterial cytoplasm2,3. This pathway has been dissected through numerous in vitro studies4-9. Further, the contribution of the Isd system to infection has been repeatedly demonstrated in mouse models8,10-14. Establishing the contribution of the Isd system to hemoglobin-derived iron acquisition and growth has proven to be more challenging. Growth assays using hemoglobin as a sole iron source are complicated by the instability of commercially available hemoglobin, contaminating free iron in the growth medium, and toxicity associated with iron chelators. Here we present a method that overcomes these limitations. High quality hemoglobin is prepared from fresh blood and is stored in liquid nitrogen. Purified hemoglobin is supplemented into iron-deplete medium mimicking the iron-poor environment encountered by pathogens inside the vertebrate host. By starving S. aureus of free iron and supplementing with a minimally manipulated form of hemoglobin we induce growth in a manner that is entirely dependent on the ability to bind hemoglobin, extract heme, pass heme through the bacterial cell envelope and degrade heme in the cytoplasm. This assay will be useful for researchers seeking to elucidate the mechanisms of hemoglobin-/heme-derived iron acquisition in S. aureus and possibly other bacterial pathogens.

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Here we describe a growth assay for Staphylococcus aureus using hemoglobin as the sole source of available nutrient iron. This assay establishes the role of bacterial factors involved in hemoglobin-derived iron acquisition.

Croissance Staphylococcus aureus en utilisant l&#39;hémoglobine humaine comme source de fer

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

L&#39;établissement d&#39;une culture liquide recouvert de Airway humaines épithéliales polarisées cellules Calu-3 pour étudier la réponse cellulaire aux agents pathogènes respiratoires hôte<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.

Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.

Pairwise croissance de la concurrence analyse pour déterminer la condition physique réplication du virus de l&#39;immunodéficience humaines

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Administration intranasale de vaccins contre la grippe recombinant chimérique dans les modèles de souris pour étudier l&#39;immunité muqueuse

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

Bactérienne Artificial Chromosomes: Un outil de génomique fonctionnelle pour l&#39;étude du brin positif de virus à ARN

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

Grippe neutralisante d’anticorps aux virus a (H3N2) dans le sérum humain par micro-neutralisation de mesure des analyses utilisant des cellules de MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples

Viruses excreted by humans and animals may contaminate water sources and pose a risk to human health when this water is used for drinking, food irrigation, washing, etc. The classical fecal bacteria indicator does not always check for the presence of viral pathogens so the detection of viral pathogens and viral indicators is relevant in order to adopt measures of risk mitigation, especially in humanitarian scenarios and in areas where water-borne viral outbreaks are frequent.
At present, several commercial tests allowing the quantification of fecal indicator bacteria (FIB) are available for testing at the point of use. However, such commercial tests are not available for the detection of viruses. The detection of viruses in environmental water samples requires concentrating several liters into smaller volumes. Moreover, once concentrated, the detection of viruses relies on methods such as nucleic acid extraction and molecular detection (e.g., polymerase chain reaction [PCR]-based assays) of the viral genomes.
The method described here allows the concentration of viruses from 10 L water samples, as well as the extraction of viral nucleic acids at the point of use, with simple and portable equipment. This allows the testing of water samples at the point of use for several viruses and is useful in humanitarian scenarios, as well as at any context where an equipped laboratory is not available. Alternatively, the method allows concentrating viruses present in water samples and the shipping of the concentrate to a laboratory at room temperature for further analysis.

Here we present VirWaTest, which is a simple, affordable and portable method for the concentration and detection of viruses from water samples at the point of use.

VirWaTest, une méthode de point d'utilisation pour la détection des virus dans les échantillons d'eau

Viruses excreted by humans and animals may contaminate water sources and pose a risk to human health when this water is used for drinking, food ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The development of stable, non-toxic, fluorescent dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) allows for rare, antigen-specific T cells to be distinguished from bystanders by diminution in fluorescent staining, as detected by flow cytometry. This method has the following advantages over alternative approaches: (i) it is very sensitive to low-frequency T cells, (ii) no knowledge of the antigen or epitope is required, (iii) the phenotype of the responding cells can be analyzed, and (iv) viable, responding cells can be sorted and used for further analysis, such as T cell cloning.

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Presented here is a protocol for measuring proliferating CD4+ T cells in response to antigenic proteins or peptides using dye dilution. This assay is particularly sensitive to rare antigen-specific T cells and can be modified to facilitate cloning of antigen-specific cells.

Quantification de la prolifération des cellules CD4et T spécifiques à l'antigène humain à l'aide de Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...