Ce projet a été un soutien dans le cadre de l&#39;Université Johns Hopkins, Bureau du prévôt grâce à l&#39;Initiative des sciences de la passerelle.

<ol><li> Commencer à fonctionner avec l&#39;installation de la cuve. Un fermenteur classique présente les composants suivants qui doivent être installées (figure 1): <ol><li> sonde de pH - pour la mesure du pH dans la culture vivante. Calibrer la sonde avant l&#39;installation et stériliser avec le navire. Installez la sonde dans la plaque frontale. </li><li> pO 2 sonde - pour la mesure de la teneur en oxygène dissous à l&#39;intérieur de la cuve pendant la fermentation. Installez la plaque frontale. </li><li> tuyau de récolte pour l&#39;échantillonnage de la culture. Installez ce composant réglable en hauteur dans la plaque frontale. </li><li> Gaz de barbotage - réside dans le bas de la cuve et permet la perfusion de gaz à la culture. Crochet de barbotage jusqu&#39;à la source de gaz sur la cuve de fermentation et de monter dans la plaque de tête. </li><li> arbre de la roue et de la roue - la roue remue la culture et est essentiel pour le maintien de la culture uniformité dans la cuve. </li><li> Condenseur de gaz d&#39;échappement - pour l&#39;arrêt de la perte par évaporation dans la cuve de refroidissement par le chemin de gaz d&#39;échappement. </li><li> les lignes de la pompe de réactif pour le contrôle du pH ou l&#39;addition d&#39;alimentation. </li></ol></li><li> Nettoyer la cuve et plaque de tête avec de l&#39;eau et du savon. Une brosse douce est recommandé pour le nettoyage de la cuve et plaque de tête. Bleach ou nettoyants au chlore ne peuvent pas être utilisés pour nettoyer la cuve. </li><li> Si le support n&#39;est pas thermolabile, l&#39;ajouter à la cuve propre. Seulement ajouter jusqu&#39;à volume de travail maximal est atteint. Dans ce cas, le volume de travail maximal est de 3,3 L pour un récipient de volume total de 5 L. </li><li> Montez la plaque frontale de la cuve, veiller à ce que le joint torique est bien en place. </li><li> Installer le condenseur de gaz d&#39;échappement. </li><li> Installez la sonde anti-mousse dans son port de 10 mm. </li><li> Installez le tuyau de la récolte dans son port de 10 mm. Mettez un morceau de tuyau sur le dessus et serrer le tout. </li><li> Installer un tube et d&#39;un filtre 0,20 um à l&#39;entrée d&#39;aspersion puis serrer cette option. </li><li> Étalonner la sonde de pH: <ol><li> Rassembler 2 tampons de référence en petits béchers, une bouteille de lavage et un wa rechangesh bécher. </li><li> Accrocher la sonde de pH à la fermentation et tourner le fermenteur sur. </li><li> Faites défiler jusqu&#39;au paramètre de pH et en utilisant le bouton de menu, faites défiler jusqu&#39;à l&#39;option &#39;Cal&#39; et appuyez sur &#39;Entrée&#39;. </li><li> Sélectionnez &#39;2 &#39;pour l&#39;étalonnage de 2 points. </li><li> Laver l&#39;extrémité de la sonde et plonger dans la mémoire tampon de référence faible. La valeur sur le fermenteur va se stabiliser. Utilisation de la touches + et -, réglez la valeur affichée en fonction de la valeur de la mémoire tampon de référence de pH. Une fois qu&#39;il arrête de clignoter, appuyez sur &quot;Entrée&quot;. </li><li> Lavez la sonde et insérez-la dans le deuxième tampon de référence. Laissez la valeur de stabiliser puis utilisez le clavier pour faire la valeur affichée correspond à la valeur de tampon de référence élevée. Appuyez sur &quot;Entrée&quot; pour confirmer. </li><li> Laver la pointe de la sonde hors tension et débranchez-le de la cuve de fermentation. Mettez le capuchon de protection sur la connexion et l&#39;installer dans la plaque frontale. </li></ol></li><li> Ouvrez la pointe de la sonde pO 2 et vérifiez qu&#39;il n&#39;yest assez électrolyte pour couvrir la pointe. Si non, ajouter un peu vers le réservoir et fermez-le vers le haut. </li><li> Installez la sonde pO 2 dans la plaque frontale et assurez-vous que le bouchon de l&#39;autoclave est mis sur la protection de ses connexions électriques. Il sera calibré après la stérilisation. </li><li> Obtenir un flacon destiné à l&#39;alimentation de réactif avec un tube plongeur et le filtre à air. Ajouter tuyau de pompe à l&#39;orifice du tube plongeur et fixer l&#39;autre extrémité à l&#39;orifice d&#39;entrée sur le fermenteur. </li><li> Lieu tube sur tous les ports inutilisés serrer ensuite le tube hors tension. </li><li> Installer un filtre de 0,45 um sur le condenseur de gaz d&#39;échappement. Ce filtre permet de s&#39;assurer que le récipient n&#39;a pas sous pression dans l&#39;autoclave. </li><li> Vérifiez que tous les tubes qui vont au-dessous du niveau des médias sont serrés au large pour empêcher les médias de sortir. </li><li> Mettez le récipient dans l&#39;autoclave pour 25 - 30 min à 121 ° C, cycle de liquide. Attention: Quand il sort, il sera très chaud. </li><li> Installez le navire sur la base du fermenteur. </li><li> Branchez le pHsonder câble. </li><li> Branchez le câble de la sonde pO 2. </li><li> Accrocher le diffuseur à la rotamètre de plus de gaz. </li><li> Ajouter stérilement réactif 1 M de NaOH à la bouteille avec le tube plongeur et installer la tête de pompe sur la broche de la tête de pompe de base. </li><li> Mettre le capteur de température dans le tube de protection sur la plaque de tête. Assurez-vous que il va tout le chemin vers le bas du doigt de gant. </li><li> Abaissez le bras de l&#39;agitation sur le couplage des navires de la roue. </li><li> Assurez-vous que le fermenteur est sur. </li><li> Vérifier que l&#39;eau est à la disposition du fermenteur. </li><li> Ouvrir l&#39;alimentation en air de la cuve de fermentation. </li><li> Faites défiler jusqu&#39;au paramètre de la température et régler la température à 37 ° C. Appuyez sur la touche &quot;Entrée&quot; pour démarrer le contrôle de la température. Le navire va chauffer à 15 min ou moins. </li><li> Tournez le flux de gaz à 1 volume de la cuve de médias par minute ou moins. Dans cette configuration, le flux de gaz est de 3 L / min. Bulles doivent apparaître au bas. </li><li> Faites défiler jusqu&#39;à l&#39;agitation parameter et mis à 300 rpm. Appuyez sur &quot;Entrée&quot; pour activer l&#39;agitation. </li><li> Une fois que la température a atteint 37 ° C, faites défiler jusqu&#39;au paramètre de pH et le mettre à 6,8. Tournez la commande de pH en appuyant sur le bouton &#39;Entrée&#39;. </li><li> Set agitation à la vitesse maximum de 1000 tours par minute pendant la course. </li><li> Assurez-vous que la sonde pO 2 est polarisée correctement pour afficher les valeurs appropriées. Après 2 heures, faites défiler jusqu&#39;au paramètre pO 2 et utiliser le bouton «Menu» pour sélectionner le «Fonction Calibrer» et sélectionnez le calibrage de 1 point. </li><li> Après 15 minutes, utiliser les curseurs pour régler la valeur à 100 et appuyez sur &quot;Entrée&quot;. Ce sera étalonner pO 2. </li><li> Faites défiler à l&#39;agitation et mis à 300 rpm. </li><li> En utilisant le bouton «Menu», tournez la &#39;Cascade&#39; à &#39;on&#39; dans le menu de l&#39;agitation. Cela augmentera la vitesse d&#39;agitation dans un effort pour hacher les bulles d&#39;air et forcer plus d&#39;oxygène dans la solution en tant que demande de croissance augmente. </li&gt; <li> Faites défiler jusqu&#39;au paramètre pO 2 et définir la valeur à 30. Appuyez sur la touche &quot;Entrée&quot; pour démarrer pO 2. </li><li> Démarrez le logiciel de commande sur le PC. </li><li> Une fois que les sondes sont étalonnées, l&#39;agitation est stable à 300 tours par minute, la température est à 37 ° C et le pH est proche de 6,8, il est temps pour inoculer. L&#39;utilisation de l&#39;alcool, stériliser le port qui sera utilisé pour l&#39;inoculation. </li><li> Dessinez l&#39;inoculum dans une seringue et l&#39;ajouter dans le port stérilisé. Fermer le port. </li><li> Marquez le moment de l&#39;inoculation dans un journal de bord. </li><li> Il est également important de prendre un échantillon au moment de la stérilisation. Stériliser l&#39;extrémité du tube de canalisation de la récolte avec de l&#39;alcool. </li><li> Ouvrez la pince couvrant le port de la récolte et utiliser une seringue pour prélever un échantillon. Ce premier échantillon est généralement écartée car elle a été assis dans le tuyau. </li><li> Utilisez une autre seringue pour tirer un autre échantillon. </li><li> Avec une troisième seringue, pousser l&#39;air à travers le tuyau d&#39;enlever autant de volume mortde la ligne et serrer le hors ligne. </li><li> Déterminer la densité de cellules et de pH et d&#39;enregistrer les valeurs. Avec des cultures microbiennes, il est utile d&#39;identifier les valeurs toutes les heures. Intervalle est dépendante de la culture. </li><li> méthodologie de récolte dépend de l&#39;intention de la culture après la croissance est terminée. Dans ce cas, un échantillon de la culture finale de temps pour recevoir des valeurs de point de terminaison pour la densité des cellules et du pH ou de la mesure du possible de poids de cellules humides. Ouvrez la plaque frontale disposé du contenu dans un &quot;réservoir de kill&quot; désigné avec l&#39;eau de Javel ou d&#39;autres agents antimicrobiens. </li></ol>

<ol>
	<li>Shuler, M., Kargi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioprocess Engineering Basic Concepts. , (2002).</li><li>Hambor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioreactor+Design+and+Bioprocess+Controls+for+Industrialized+Cell+Processing.">Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing.</a> BioProcess International. 10 (6), 22-33 (2012).</li><li>Julien, C., Whitford, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioreactor,+Monitoring,+Modeling+and+Simulation.">Bioreactor, Monitoring, Modeling and Simulation.</a> BioProcess International. 5 (01), S10-S17 (2007).</li><li>Fike, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient+Supplementation+Strategies+for+Biopharmaceutical+Production.+Part+1:+Identifying+a+Formulation.">Nutrient Supplementation Strategies for Biopharmaceutical Production. Part 1: Identifying a Formulation.</a> BioProcess International. 7 (11), 46-52 (2009).</li><li>Jana, S., Deb, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+efficient+production+of+heterologous+proteins+in+Escherichia+coli.">Strategies for efficient production of heterologous proteins in Escherichia coli.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 67, 289-298 (2005).</li><li>Wang, Z., Ly, M., Zhang, F., Zhong, W., Suen, A., Hickey, A. M., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E.+coli+K5+fermentation+and+the+preparation+of+heparosan,+a+bioengineered+heparin+precursor.">E. coli K5 fermentation and the preparation of heparosan, a bioengineered heparin precursor.</a> Biotechnol. Bioeng. 107, 964-973 (2010).</li><li>Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. , (2010).</li><li>Infors, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Minifors operating Manual and user guide. , .</li></ol>

Auteur A. Magno est un employé d&#39;ATR Biotech, qui produit des réactifs et des instruments utilisés dans cet article.

Bioréacteurs à cuve agitée sont la norme dans l&#39;industrie de la biotechnologie et ont été utilisés depuis plus de 40 ans 1. La petite cuve agitée a été important pour l&#39;échelle, à échelle réduite, l&#39;optimisation de la souche, la caractérisation et le développement de processus. Elle peut aussi avoir un rôle important dans le développement de la médecine individualisée 2. Le bioréacteur à petite échelle est la plus semblable à des conditions in situ de la croissance de la cellule, car il peut être contrôlé et optimisé tout au long de la course. Le plus souvent, des expériences initiales sont effectuées en utilisant des flacons d&#39;agitation, mais les conditions dans le bioréacteur à petite échelle diffèrent de manière significative de la fiole d&#39;agitation. Dans une expérience, nous avons trouvé que les conditions pour une croissance optimale de E. coli et à la production de la protéine fluorescente verte (GFP) dans le flacon d&#39;agitation ne se traduisent pas sur le bac à agitation (données non publiées). D&#39;autres méthodes de croissance de cellules à grande échelle comprennent des bouteilles à rouleaux, seul use bascule bioréacteurs de la plate-forme 3 et grands bioréacteurs à usage unique avec des volumes de travail de 50 à 5000 L. Chaque méthode fournit des défis à l&#39;échelle supérieure, mais a trouvé une place dans la production. L&#39;utilisation seule plate-forme à bascule bioréacteur est similaire à la cuve agitée, et fournit un environnement régulé. Elle diffère de la cuve agitée en ce que le mélange se produit en raison d&#39;un mouvement de bascule pour générer des ondes à empêcher le dépôt de cellules et de fournir l&#39;oxygénation. L&#39;hydrodynamique pour ce procédé sont différents de la cuve à agitation et le volume maximal est limité à 1 000 L. Les différences peuvent influer sur la croissance cellulaire et la production de produits. D&#39;autres systèmes à usage unique combinent la cuve agitée avec le réacteur jetable, fournir une plate-forme avec un minimum d&#39;infrastructure et les frais généraux associés, et la capacité de haut débit bioprocédés 4. Les nouveaux utilisateurs de bioréacteurs de paillasse peuvent avoir du mal à déterminer les consignes initiales de pH, pO 2 et températuretempérature, mais les recherches publiées peut être référencé pour cette information 5, 6, 7, 8, 9. Avec des cultures bactériennes en particulier, il est recommandé de commencer l&#39;agitation à la même vitesse que le flacon à secousses et la température à la même valeur de consigne. pH de la culture à partir de fioles d&#39;agitation par secousses précédentes pistes peut également être utilisé en tant que point de départ. Réglage de la valeur pO 2 est plus difficile et est généralement déterminée de manière empirique. Cependant, à partir de 50% pO 2 est un point de départ recommandée.

La technologie de fermentation de base est une extension de la technique simple de flacon d&#39;agitation pour cultures en croissance. Il est né de la volonté de contrôler les environnements de croissance pour cultures vivantes d&#39;une manière plus complète et quantitative. Lot flacons culture d&#39;agitation sont généralement limitées par le contrôle de la température imprécise. Uniformité de la température dans un shaker incubés ou salle chaude est très variable, parfois s&#39;égarer 5 ° C ou plus de la valeur de consigne destinée. Etant donné que le flacon d&#39;agitation est généralement agité à une vitesse fixe, la consommation d&#39;oxygène et de gaz d&#39;échange est limité. Une fois l&#39;oxygène ambiant disponible est épuisé, la plupart des cultures ne parviennent pas à se développer. Il n&#39;ya pas de contrôle du pH dans des flacons agités. Dans de nombreux cas, si la culture n&#39;est pas limitée par la charge d&#39;alimentation, il devient acide au point de nuire à la culture et la respiration ralentit considérablement. La plupart des cultures en flacons agités sont également fonctionner comme un «lot», ce qui signifie qu&#39;ils sont alimentés seulement une fois au niveau ou à proximité du début des cultures inoculation. Après cette source de carbone initiale est consommée, la culture cesse de croître. Dans certains cas, son métabolisme peut changer et commencer à consommer d&#39;autres métabolites dans le bouillon de culture, parfois de modifier les caractéristiques de la biomasse ou de la protéine résultante. des flacons d&#39;agitation sont aussi généralement soumis à des médias perte par évaporation dans des environnements de culture plus chaudes, généralement 10% du volume par 24 heures à 37 ° C. Cette perte change la densité de la culture et interdit un fonctionnement plus long terme du système. Enfin, l&#39;utilisateur peut rencontrer moussant des médias après l&#39;agitation. L&#39;apparition de mousse dans le vide au-dessus de la culture permettra de limiter les échanges gazeux et la croissance du grasset. Le système de fermentation de base est conçu pour répondre à toutes ces limitations. Contrôle soigneux de la température est réalisée dans des cuves de fermentation par l&#39;utilisation de la turbine d&#39;agitation et d&#39;une enveloppe chauffante. Capteur inséré dans le récipient et les informations de contrôle de chauffage et de refroidissement de cette enveloppe habituellementrésultats dans le contrôle de la température ± 0,1 ° C autour de la consigne. Fermenteurs de paillasse fournissent généralement un contrôle de pH par addition de réactif liquide par une pompe. La valeur du pH est contrôlée en permanence dans le but de maintenir un environnement optimal pour la croissance cellulaire. Une bonne aération est maintenue par l&#39;impulseur de mélange mentionné ci-dessus ou par l&#39;injection d&#39;air ou d&#39;oxygène gazeux additionné directement dans la culture. Avec des cultures sensibles au cisaillement, de l&#39;oxygène gazeux additionné est le principal mécanisme de maintien de niveau d&#39;oxygène dans la culture. La mesure de l&#39;oxygène dans la solution est généralement obtenue par une sonde polarographique qui n&#39;est pas normalement disponible pour une utilisation dans des flacons agités. Il est également possible d&#39;ajouter en continu ou périodiquement dans la cuve d&#39;alimentation pour maintenir la croissance de manière linéaire ou exponentielle. Le condenseur de gaz de sortie fournit une surface froide de la vapeur dans le flux de gaz d&#39;échappement pour condenser, préservant ainsi le volume de la culture et de la densité. Addition périodique d&#39;agent tensio-actif antimousse est actionnéepar une sonde de conductivité dans la culture, la réduction de la mousse sur la surface et en permettant l&#39;échange de gaz. Le navire, avec toutes les sondes, raccords, roues, tuyaux de récolte, et des tubes, est assemblé et stérilisé dans un autoclave standard. Après l&#39;étalonnage de la sonde et de la stabilisation définitive de l&#39;environnement d&#39;exploitation, la culture est introduite dans le récipient. Le système peut alors être utilisé pour caractériser la culture d&#39;une manière qui est plus quantitative et précise qu&#39;avec un procédé par agitation du flacon. Un contrôle strict de la température, le pH, la teneur en oxygène, la consommation de nourriture, l&#39;évaporation du liquide, et les niveaux de mousse contribuent tous à une biomasse bien plus élevée et un meilleur rendement en protéines.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="356">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:117px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;">LB broth</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:117px;">L3022</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;">ampicillin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:117px;">A1593-25G</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;">LB broth</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:117px;">L3022</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;">antifoam 204</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:117px;">A8311</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;"> </td>
			<td style="width:117px;"> </td>
			<td style="width:117px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">1 M Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td>38215-1EA-R</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">Reference Buffer, pH 4.00</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:117px;">B5020</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">Reference Buffer, pH 7.00</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:117px;">B4770</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">pO2 probe electrolyte</td>
			<td style="width:117px;">Broadley James</td>
			<td>AS-3140-C30-0025</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;">0.45 micron filter</td>
			<td style="width:117px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:117px;">EW-02915-22</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;">0.22 micron filter</td>
			<td style="width:117px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:117px;">EW-29950-40</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">Luer Lock syringe, 10 mL</td>
			<td style="width:117px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:117px;">EW-07940-12</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">Minifors Bioreactor</td>
			<td style="width:117px;">Infors HT</td>
			<td style="width:117px;">B-Pack 5.0</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">Air Admiral air pump</td>
			<td style="width:117px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:117px;">EW-79202-00</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">1175 PD Chilling circulator</td>
			<td style="width:117px;">VWR</td>
			<td style="width:117px;">13721-204</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

operation of a benchtop bioreactor

Les systèmes de fermentation sont utilisés pour fournir un environnement optimal pour la croissance de nombreux types de cultures de cellules. La possibilité offerte par des fermenteurs de contrôler avec soin la température, le pH et les concentrations en oxygène dissous, en particulier, les rend indispensables à la croissance à grande échelle efficace et l&#39;expression de produits de fermentation. Cette vidéo décrire brièvement les avantages de la cuve de fermentation au cours de la fiole d&#39;agitation. Il permettra également d&#39;identifier les éléments clés d&#39;un système de fermentation de paillasse typique et donner des instructions sur la configuration de base de la cuve et l&#39;étalonnage de ses sondes. Le spectateur sera familiarisé avec le procédé de stérilisation et montré comment inoculer le milieu de croissance dans le récipient de culture. Les concepts de base de fonctionnement, l&#39;échantillonnage et la récolte seront également démontrés. Analyse de données simple et nettoyage du système seront également discutées.

Le bioréacteur peut être exécuté avec ou sans le logiciel IRIS. Cependant, pour capturer des données, il est préférable d&#39;utiliser le logiciel. Avant l&#39;addition de bactéries, le pH et l&#39;oxygène capteurs doivent être étalonnés, l&#39;ensemble de la vitesse du rotor et la consigne de la température. Sur la figure 2, la sortie de données pour une course de bioréacteur est présenté. La température a été réglée à 30 ° C, la vitesse de l&#39;agitateur à 200 rpm. Les paramètres peuvent être différents pour chaque expérience, mais avant l&#39;addition de bactéries, le système devrait être à l&#39;état stationnaire. Sur la figure 3, la variation de la concentration en oxygène avec l&#39;addition de la culture bactérienne est signalée. Les points de consigne pour cette expérience sont 37 ° C, d&#39;un agitateur à 200 rpm, O 2 à 70%. Au temps 19 heures 20, la pompe d&#39;alimentation délivre la culture d&#39;ensemencement bactérien à une DO de 0,1 provoquer une chute dans le niveau immédiatement O 2. Le bioréacteur répond au changement de niveau de O 2 avec une augmentation du débit d&#39;air et la vitesse turbine. Til a créé des points pour les augmentations sont fixées dans la cascade (étape 35). Le réacteur pH a été contrôlé en temps réel, avec la diminution du pH puis augmentant comme démontré par la fluctuation de la ligne de pH au cours du temps (figure 4). La série entière peut être analysé et ajusté les paramètres pour les expériences ultérieures. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/50582/50582fig1.jpg" /> Figure 1. Bioréacteur de laboratoire avec toutes les parties marquées et connectés. Cette figure montre le réacteur à cuve agitée, au début d&#39;une course. Les pièces du réacteur sont étiquetés et comprennent les capteurs, roue, jauge de température, des bouteilles d&#39;alimentation et d&#39;échantillonnage, l&#39;orifice d&#39;échappement, manomètre de pression d&#39;air, chemise de chauffage, tour de condenseur, et le panneau de commande. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/50582/50582fig2.jpg" /> Figure 2. l&#39;image de l&#39;écran de bioréacteur software au début du terme. Au début d&#39;un cycle de cuve agitée, la température est réglée à 30 ° C (ligne jaune), la vitesse du rotor à 200 rpm (ligne rouge), le pH à 6.5 (ligne verte), et pO 2 à 57,2% (ligne bleue). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50582/50582fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50582/50582fig3.jpg" /> Figure 3. l&#39;image de l&#39;écran d&#39;un logiciel de bioréacteur lors de l&#39;exécution en tant oxygène diminue. Lorsque la culture est en phase de croissance active, il consomme de l&#39;oxygène et de la quantité d&#39;oxygène dans le réacteur est diminuée (ligne bleue). En augmentant la vitesse de la roue, plus d&#39;oxygène peut être ajouté à la culture (ligne rouge). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50582/50582fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . Figure 4. l&#39;image de l&#39;écran d&#39;un logiciel de bioréacteur montrant le changement de pH au cours du temps. Le pH de la culture est surveillée en continu et le temps, il diminue à mesure que l&#39;acide lactique est produit, puis augmente à mesure que la base est ajoutée au bioréacteur (ligne bleue). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50582/50582fig4large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> .

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Operation of a Benchtop Bioreactor

Fermenteurs sont utilisés pour augmenter le rendement de la culture et la productivité des cellules transgéniques. Après le dépistage multiples microbiennes ou animales candidats de culture de cellules dans des flacons agités, la prochaine étape logique est d&#39;augmenter la biomasse de la culture sélectionnée avec le fermenteur. Cette vidéo montre l&#39;installation et le fonctionnement d&#39;un système de bioréacteur de paillasse typique.

Fonctionnement d&#39;un bioréacteur de laboratoire

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

88.6K vues.  Johns Hopkins University.  Fermenteurs sont utilisés pour augmenter le rendement de la culture et la productivité des cellules transgéniques. Après le dépistage multiples microbiennes ou animales candidats de culture de cellules dans des flacons agités, la prochaine étape logique est d'augmenter la biomasse de la culture sélectionnée avec le fermenteur. Cette vidéo montre l'installation et le fonctionnement d'un système de bioréacteur de paillasse typique. 

Vidéo: Operation of a Benchtop Bioreactor

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

Greffes d&#39;ingénierie biologique vasculaire basé sur l&#39;aide d&#39;un bioréacteur pulsatile

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

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Bio-ingénierie

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

We designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for transplantation. While the device primarily functions as a bioreactor that mimics the native mechanical strains, it is also outfitted with a load cell for providing force feedback or mechanical testing of the constructs. The device subjects engineered cartilage constructs to biaxial mechanical loading with great precision of loading dose (amplitude and frequency) and is compact enough to fit inside a standard tissue culture incubator. It loads samples directly in a tissue culture plate, and multiple plate sizes are compatible with the system. The device has been designed using components manufactured for precision-guided laser applications. Bi-axial loading is accomplished by two orthogonal stages. The stages have a 50 mm travel range and are driven independently by stepper motor actuators, controlled by a closed-loop stepper motor driver that features micro-stepping capabilities, enabling step sizes of less than 50 nm. A polysulfone loading platen is coupled to the bi-axial moving platform. Movements of the stages are controlled by Thor-labs Advanced Positioning Technology (APT) software. The stepper motor driver is used with the software to adjust load parameters of frequency and amplitude of both shear and compression independently and simultaneously. Positional feedback is provided by linear optical encoders that have a bidirectional repeatability of 0.1 &mu;m and a resolution of 20 nm, translating to a positional accuracy of less than 3 &mu;m over the full 50 mm of travel. These encoders provide the necessary position feedback to the drive electronics to ensure true nanopositioning capabilities. In order to provide the force feedback to detect contact and evaluate loading responses, a precision miniature load cell is positioned between the loading platen and the moving platform. The load cell has high accuracies of 0.15% to 0.25% full scale.

We designed a novel mechanical loading bioreactor that can apply uniaxial or biaxial mechanical strain to a cartilage biocomposite prior to transplantation into an articular cartilage defect.

Conception d&#39;un bioréacteur de chargement mécanique biaxial pour l&#39;ingénierie tissulaire

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

Microfluidique picolitres bioréacteur pour Analyse microbienne unicellulaire: Fabrication, configuration du système, et l&#39;opération

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To emulate the dynamic environment of vocal folds, a novel vocal fold bioreactor capable of producing vibratory stimulations at fundamental phonation frequencies is constructed and characterized. The device is composed of a function generator, a power amplifier, a speaker selector and parallel vibration chambers. Individual vibration chambers are created by sandwiching a custom-made silicone membrane between a pair of acrylic blocks. The silicone membrane not only serves as the bottom of the chamber but also provides a mechanism for securing the cell-laden scaffold. Vibration signals, generated by a speaker mounted underneath the bottom acrylic block, are transmitted to the membrane aerodynamically by the oscillating air. Eight identical vibration modules, fixed on two stationary metal bars, are housed in an anti-humidity chamber for long-term operation in a cell culture incubator. The vibration characteristics of the vocal fold bioreactor are analyzed non-destructively using a Laser Doppler Vibrometer (LDV). The utility of the dynamic culture device is demonstrated by culturing cellular constructs in the presence of 200-Hz sinusoidal vibrations with a mid-membrane displacement of 40 &#181;m. Mesenchymal stem cells cultured in the bioreactor respond to the vibratory signals by altering the synthesis and degradation of vocal fold-relevant, extracellular matrix components. The novel bioreactor system presented herein offers an excellent in vitro platform for studying vibration-induced mechanotransduction and for the engineering of functional vocal fold tissues.

A novel vocal fold bioreactor capable of delivering physiologically relevant, vibratory stimulation to cultured cells is constructed and characterized. This dynamic culture device, when combined with a fibrous poly(&#949;-caprolactone) scaffold, creates a vocal fold-mimetic environment that modulates the behaviors of mesenchymal stem cells.

Construction et caractérisation d&#39;un pli bioréacteur roman Vocal

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

La culture de cellules de mammifères en utilisant un système pneumatique bioréacteur à usage unique

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past studies have evaluated the performance of the reactor for the removal of COD1 and nitrogen species2-4 by heterotrophic and chemoautotrophic bacteria, respectively. The HDBR design eliminates the requirement for external flocculation/sedimentation processes while still yielding effluent containing low suspended solids. In this study, the HDBR is applied as a photobioreactor (PBR) in order to characterize the nitrogen removal characteristics of an algae-based photosynthetic microbial community. As previously reported for this HDBR design, a stable biomass zone was established with a clear delineation between the biologically active portion of the reactor and the recycling reactor fluid, which resulted in a low suspended solid effluent. The algal community in the HDBR was observed to remove 18.4% of total nitrogen species in the influent. Varying NH4+ and NO3- concentrations in the feed did not have an effect on NH4+ removal (n=44, p=0.993 and n=44, p=0.610 respectively) while NH4+ feed concentration was found to be negatively related with NO3- removal (n=44, p=0.000) and NO3- feed concentration was found to be positively correlated with NO3- removal (n=44, p=0.000). Consistent removal of NH4+, combined with the accumulation of oxidized nitrogen species at high NH4+ fluxes indicates the presence of ammonia- and nitrite-oxidizing bacteria within the microbial community.

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Here, the HDBR is successfully applied in a photobioreactor (PBR) configuration for the study of nitrogen metabolism by a mixed high density algal community.

Un bioréacteur pour Novel Haute Culture de la densité des communautés microbiennes diverses

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells

Efficient intracellular delivery of biomolecules is required for a broad range of biomedical research and cell-based therapeutic applications. Ultrasound-mediated sonoporation is an emerging technique for rapid intracellular delivery of biomolecules. Sonoporation occurs when cavitation of gas-filled microbubbles forms transient pores in nearby cell membranes, which enables rapid uptake of biomolecules from the surrounding fluid. Current techniques for in vitro sonoporation of cells in suspension are limited by slow throughput, variability in the ultrasound exposure conditions for each cell, and high cost. To address these limitations, a low-cost acoustofluidic device has been developed which integrates an ultrasound transducer in a PDMS-based fluidic device to induce consistent sonoporation of cells as they flow through the channels in combination with ultrasound contrast agents. The device is fabricated using standard photolithography techniques to produce the PDMS-based fluidic chip. An ultrasound piezo disk transducer is attached to the device and driven by a microcontroller. The assembly can be integrated inside a 3D-printed case for added protection. Cells and microbubbles are pushed through the device using a syringe pump or a peristaltic pump connected to PVC tubing. Enhanced delivery of biomolecules to human T cells and lung cancer cells is demonstrated with this acoustofluidic system. Compared to bulk treatment approaches, this acoustofluidic system increases throughput and reduces variability, which can improve cell processing methods for biomedical research applications and manufacturing of cell-based therapeutics.

This protocol describes the assembly and operation of a low-cost acoustofluidic device for rapid molecular delivery to cells via sonoporation induced by ultrasound contrast agents.

Assemblage et fonctionnement d’un dispositif acoustofluidique pour une administration améliorée de composés moléculaires aux cellules

Efficient intracellular delivery of biomolecules is required for a broad range of biomedical research and cell-based therapeutic applications. ...

Open-source Toolkit: Benchtop Carbon Fiber Microelectrode Array for Nerve Recording

Conventional peripheral nerve probes are primarily fabricated in a cleanroom, requiring the use of multiple expensive and highly specialized tools. This paper presents a cleanroom "light" fabrication process of carbon fiber neural electrode arrays that can be learned quickly by an inexperienced cleanroom user. This carbon fiber electrode array fabrication process requires just one cleanroom tool, a Parylene C deposition machine, that can be learned quickly or outsourced to a commercial processing facility at marginal cost. This fabrication process also includes hand-populating printed circuit boards, insulation, and tip optimization. 
The three different tip optimizations explored here (Nd:YAG laser, blowtorch, and UV laser) result in a range of tip geometries and 1 kHz impedances, with blowtorched fibers resulting in the lowest impedance. While previous experiments have proven laser and blowtorch electrode efficacy, this paper also shows that UV laser-cut fibers can record neural signals in vivo. Existing carbon fiber arrays either do not have individuated electrodes in favor of bundles or require cleanroom fabricated guides for population and insulation. The proposed arrays use only tools that can be used at a benchtop for fiber population. This carbon fiber electrode array fabrication process allows for quick customization of bulk array fabrication at a reduced price compared to commercially available probes.

Here, we describe fabrication methodology for customizable carbon fiber electrode arrays for recording in vivo in nerve and brain.

Boîte à outils open-source: réseau de microélectrodes en fibre de carbone de paillasse pour l’enregistrement des nerfs

Conventional peripheral nerve probes are primarily fabricated in a cleanroom, requiring the use of multiple expensive and highly specialized tools. This ...

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in regenerative medicine and bioreactor technologies offer opportunities to produce lab-grown functional tissue and organ constructs that can be used to screen drugs, model disease, and engineer tissue replacements. Here, a miniaturized bioreactor coupled with an imaging modality that allows in situ visualization of the inner lumen of explanted rat trachea during in vitro tissue manipulation and&#160;culture is described. Using this bioreactor, the protocol demonstrates imaging-guided selective removal of endogenous cellular components while preserving the intrinsic biochemical features and ultrastructure of the airway tissue matrix. Furthermore, the delivery, uniform distribution, and subsequent prolonged culture of exogenous cells on the decellularized airway lumen with optical monitoring in situ are shown. The results highlight that the imaging-guided bioreactor can potentially be used to facilitate the generation of functional in vitro airway tissues.

The protocol describes an imaging-enabled bioreactor that allows the selective removal of the endogenous epithelium from the rat trachea and homogenous distribution of exogenous cells on the lumen surface, followed by long-term in vitro culture of the cell-tissue construct.

Bioréacteur guidé par imagerie pour la génération de tissus des voies respiratoires issus de la bioingénierie

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...