The authors thank Nicolas Allegre, Maud Peyny and Jean-Philippe Da Ponte for their excellent technical assistance. This work was supported by the Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), the INSERM starting grant, ANR ID-CELL-SPE grant, Equipe FRM and the AFM 15845 grant.

1. Fly Generation Ligne <ol><li> Générer deux constructions différentes. Dans la première construction, RpL10A ADNc (ribosomal sous-unité protéique L10a) est clone en aval de la GFP dans UPAEP-PL-GFP-Nter plasmide (version modifiée de 32). L&#39;utilisation d&#39;un promoteur de la lignée germinale permet un usage plus polyvalent de la lignée transgénique. Remarque: obtenir le deuxième construction en clonant la séquence de régulation dirigeant l&#39;expression tissu-spécifique du gène GAL4 en amont de mollesse (TF) à l&#39;aide pPTGAL4 plasmide. </li><li> Injecter séparément dans des plasmides w 1118 vol constructions et insérer dans le génome de la mouche par insertion d&#39;élément P (selon la procédure standard) 33. </li><li> Sélectionnez transformants afin de récupérer lignes de vol avec des constructions sur deux chromosomes différents. La ligne de TRAP finale est créée en combinant ces deux lignes (croix génétiques) afin d&#39;obtenir une ligne double transgénique stable. F0: W; Cyo, SAMU EGFP :: RpL10A; MKRS / TM6Bx W; Cyo / Scu; Slouch Gal4 / TM6B. F1: W; Cyo, SAMU EGFP :: RpL10A; Slouch Gal4 / TM6B. Massivement amplifier cette ligne et de recueillir les embryons souhaité mis en scène. </li></ol> 2. Embryon Collection <ol><li> Préparez 8 grandes cages de population cylindrique contenant environ 40 g de jeunes mouches par cage (environ 180 000 mouches / cage). </li><li> Procéder à la soi-disant pré-Lays qui permettent mouches pour effacer embryons en développement de leurs trompes. Pour cela, jeter les mouches pendant 1 heure sur deux plats 11 cm de diamètre de Pétri contenant un mélange de solidifiée agar et le jus de raisin et couvrir ⅓ de la surface avec de la pâte de levure fraîchement faite. Après 3 échanges de raisin plaques de jus recueillent les véritables embryons sur des plaques fraîchement préparés similaires. NOTE: Le temps d&#39;incubation varie en fonction de développement fenêtre de temps étudiée. </li><li> Retirer les plaques de cages et de les laisser à la même température pendant le temps nécessaire pour obtenir le stade de développement correcte (par exemple, 3 h de ponte + 10 h de suppional incubation donne embryons de stade 10-13 h après la ponte (AEL)). Reprendre le contenu de la plaque (embryons, la pâte de levure, mouches mortes) avec 50 ml d&#39;eau en utilisant une brosse. </li><li> Aller à travers une série de tamis (700 um, 355 um, 112 um) pour séparer les embryons de mouches mortes et autres parties du corps et de recueillir des embryons conservés sur le tamis plus petit diamètre, puis laver rapidement à l&#39;eau déminéralisée. Ne pas utiliser plus de 18 plaques par la collecte comme il peut obstruer les tamis. </li><li> Embryons Dechorionate à 4,5% l&#39;eau de Javel dans l&#39;eau déminéralisée pour 2 min et rincer abondamment avec de l&#39;eau déminéralisée pendant 30-60 secondes. Incuber les embryons dans du PBS 0,01% de Tween 20, 100 pg / ml de cycloheximide, de 5 à 10 min à température ambiante sous agitation. </li><li> Embryons secs sur feuilles absorbantes de cellulose et de les transférer à des microtubes. Peser les tubes et flash-congeler les embryons par immersion dans l&#39;azote liquide. A ce stade, les embryons secs peuvent être conservés pendant plusieurs mois à -80 ° C. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Préparation de billes magnétiques couplées à la GFP Anticorps <ol><li> Bien remettre en suspension la protéine G billes magnétiques dans le flacon d&#39;origine par une agitation douce. </li><li> Transfert de 90 ul de billes à un tube RNase-free et les rassembler sur un aimant (30-60 sec). 90 ul de billes est nécessaire d&#39;effectuer une immunoprécipitation (IP) avec 1 ml de lysat contenant 60 à 80 mg / ml de protéines. Respecter les rapports pour éviter la saturation de perles. Utilisez plusieurs tubes selon quantité de protéine. </li><li> Laver les perles avec 1 × PBS 0,01% de Tween 20 (500 pi) et de recueillir des perles sur l&#39;aimant à éliminer le surnageant. Ajouter 30 pg d&#39;anticorps de la GFP dans 350 pi de PBS 0,01% de Tween 20 à incuber les billes et avec plus de lenteur extrémité extrémité mélange pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Récupérer des billes sur l&#39;aimant (30 à 60 sec), éliminer le surnageant et rinçage dans 500 ul de tampon d&#39;extraction de polysomes (HEPES 10 mM, KCl 150 mM, MgCl2 5 mM, DTT 0,5 mM, Triton 1%, le cycloheximide 100 pg / ml , Pr1 × otease inhibiteur, inhibiteur de la RNase 100 U). </li><li> Récupérer des perles sur l&#39;aimant et ajouter 500 ul de tampon de blocage (BSA à 0,1 ug / ul d&#39;ARNt de levure, 0,1 pg / pl, glycogène 0,1 ug / ul dans du tampon d&#39;extraction de polysomes). </li><li> Incuber pendant 30 min à température ambiante et répéter cette étape une fois avec un tampon de blocage frais. </li><li> Recueillir des perles sur l&#39;aimant et rincer dans 500 pi de tampon d&#39;extraction de polysome, puis rappeler perles et de procéder immédiatement à l&#39;étape de immunopurification (article 6). </li></ol> 4. Préparation Lysate <ol><li> Avant de commencer, mettre en place le programme sur le multi-directionnel perles de vitesse rapide meuleuse: 2 × 10 sec à 5000 rpm, 15 secondes pause. Embryons de transferts secs (1,5 g) à tubes de 15 ml préalablement refroidi sur de la glace contenant un tampon d&#39;extraction polysome, et homogénéiser immédiatement. Homogénéiser 1,5 g d&#39;embryons dans 4 ml de tampon d&#39;extraction de polysomes. </li><li> Étaler homogénéisé embryons dans deux prérefroidi tubes 2 ml et broyer les EmbryOS en exécutant le programme d&#39;homogénéisation. Transférer le lysat dans des microtubes prérefroidi frais sur la glace et préparer un surnageant post-nucléaire par centrifugation à 4 ° C pendant 10 min à 2000 g. </li><li> Transférer le surnageant dans un tube à centrifuger prérefroidi frais sur la glace, ajouter 1/100 volume de 10% de Nonidet P-40 échantillon au surnageant (concentration finale = 0,1%), et mélanger doucement en inversant le tube. </li><li> Pulse-centrifuge l&#39;échantillon dans une Minifuge pour collecter le liquide au fond du tube, ajouter 1/9 volume d&#39;échantillon de 300 mM de 1,2-Diheptanoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DHPC) (concentration finale = 30 mM ), mélanger doucement en inversant le tube, et incuber le mélange sur de la glace pendant 5 min (mélange en retournant plusieurs fois au cours de l&#39;incubation). </li><li> Préparer le surnageant post-mitochondriale par centrifugation à 4 ° C pendant 10 min à 20 000 g. Mesurer la concentration de protéines par la méthode de Bradford: concentration en lysat doit être comprise entre 60 à 80 mg / ml. Take le surnageant dans un nouveau tube prérefroidi fraîche et procéder immédiatement à l&#39;étape de pré-absorption (article 5). </li></ol> 5. Pré-absorption <ol><li> Bien remettre en suspension les billes magnétiques par agitation douce et transférer 30 ul de billes dans un tube à centrifuger à température ambiante (30 pi de perles / 1 ml de lysat embryonnaire). </li><li> Recueillir des perles sur l&#39;aimant, une pipette le surnageant, et remettre en suspension les perles dans un tampon d&#39;extraction polysome (500 pi). Récupérer des billes sur l&#39;aimant, ajouter lysat embryonnaire, et incuber pendant 1 heure à 4 ° C sur un agitateur. <ol><li> Retirer perles et de garder surnageant sur de la glace pour l&#39;étape de immunopurification. Avant immunopurification, garder 100 pi de surnageant (entrée) pour comparer échantillon global d&#39;ARN avec l&#39;échantillon d&#39;ARN recueilli après immunopurification, RT-qPCR par exemple. </li></ol></li></ol> 6. Immunopurification <ol><li> Ajouter 1 ml (correspondant à 60 à 80 mg / ml de protéine) delysat pré-absorbée à un tube sans RNase contenant 90 ul de billes bloqués couplés à l&#39;anticorps GFP. Incuber les échantillons à 4 ° C pendant 2 heures avec douceur extrémité par rapport à l&#39;extrémité de mélange dans un dispositif de rotation du tube. Sinon, effectuer l&#39;incubation O / N à 4 ° C. </li><li> Après incubation, de recueillir des perles sur l&#39;aimant. Utilisez un Minifuge à tourner vers le bas les perles, puis les remettre en suspension dans 500 pi de tampon de lavage (HEPES 10 mM, KCl 350mm, MgCl2 5mm, Nonidet P-40 1%, DTT 0,5 mM, cycloheximide 100 pg / ml, RNase inhibiteur 100 U ) et les recueillir sur l&#39;aimant. Répétez cette étape deux fois plus. </li><li> Modifiez les perles dans un nouveau tube RNase-free prérefroidi et laver deux fois. Recueillir des perles sur un aimant et de procéder à l&#39;extraction de l&#39;ARN en ajoutant 1 ml TRIzol directement aux perles et de suivre les instructions du fabricant. </li></ol> 7. ARN Clean-up et de l&#39;évaluation de la qualité <ol><li> Utilisez un kit RNeasy Micro selon les instructions du fabricant. A l&#39;achèvement, élutARN e avec (x) pi d&#39;eau sans RNase. Chaud pendant 2 min à 60 ° C, et un magasin enfichable congelés échantillons à -80 ° C. Vérifier la qualité de l&#39;ARN en utilisant bioanalyseur (suivre les instructions du fabricant). </li><li> Pour tester la spécificité de l&#39;ARN et TRAP, effectuer une transcription inverse sur 3 ng d&#39;ARN purifié (entrée et IP) selon les instructions du fabricant (III) de l&#39;exposant. Utilisez l&#39;ADNc obtenu pour qPCR utilisant des jeux d&#39;amorces spécifiques du gène. </li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Drosophila+with+transposable+element+vectors.">Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors.</a> Science. 218, 348-353 (1982).</li><li>Ingolia, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+pervasive+translation+outside+of+annotated+protein-coding+genes.">Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes.</a> Cell reports. 8, 1365-1379 (2014).</li></ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

Ce document décrit une Translating ribosome Affinity protocole modifié d&#39;épuration (surnommé «TRAP-rc &#39;) dédié à l&#39;étude des populations de cellules rares dans embryons de drosophile. L&#39;information est fournie sur les étapes clés pour l&#39;isolement de l&#39;ARN spécifique succès avec un rendement adéquat pour les puces à ADN ou d&#39;ARN-analyse suivants, à savoir 1) la quantité de matériel biologique nécessaire et la procédure optimisée pour embryon lyse et l&#39;extraction de polysome; 2) perles / anticorps à-lysat ratios pour immunoprécipitation optimale; 3) les étapes permettant de réduire de fond, y compris la composition du tampon de lavage de manière à réaliser des expériences TRAP-rc avec une haute spécificité et la sensibilité. Ce protocole donne des données reproductibles qui rend facilement appliquée à d&#39;autres types de cellules. Cette technique permet d&#39;analyser l&#39;expression différentielle des gènes au niveau de l&#39;ARNm activement la traduction et ouvrir ainsi la voie à la compréhension de l&#39;expression des protéines dans un spec<html> IFIC type de cellule à une fenêtre de temps spécifique. On notera cependant que l&#39;abondance des protéines dépendra de la vitesse des processus de dégradation et de la traduction. Une limitation majeure de la méthode TRAP est son incapacité à mesurer la teneur en protéines d&#39;une manière quantitative précise ou pour détecter modification post-traductionnelle. Amélioration de la quantification en mesurant la densité des ribosomes le long du corps ARNm et, ce faisant, d&#39;une manière type de cellule spécifique peut faire TRAP combiné avec ribosome empreinte un outil très puissant. Dans un récent article 34, cette combinaison a été réalisée dans des cellules embryonnaires de rein humaines 293. Les auteurs ont couru empreinte nucléase suivie par purification par affinité d&#39;une forme biotinylé inductible de RpL10A utilisant des billes de streptavidine. Ceci est une preuve de principe qu&#39;il est possible de réaliser l&#39;empreinte ribosome dans un organisme entier tout en ciblant un type de cellule spécifique, la limitation étant la quantité de matériel biologique nécessaire à cet effet. &quot;&gt; Spectacle expériences TRAP en parallèle avec les analyses transcriptomiques mondiaux, il sera possible de suivre les proportions entre nouvellement transcrit et actively- traduire ARN. Ce sera très instructif des mécanismes post-transcriptionnel potentiels qui se déroulent dans des contextes de développement spécifiques ou des populations cellulaires spécifiques microARN -par par exemple. En conclusion, TRAP est une méthode très efficace, spécifique et sensible pour l&#39;identification des ARN liés à des ribosomes activement traduire d&#39;une manière spécifique à la cellule. Cette méthode peut être utilisée dans une grande variété d&#39;organismes et de types de tissus. Le nouveau protocole TRAP-rc décrit ici a été optimisé pour les populations de cellules rares (moins de 1% du nombre total de cellules) et pour une quantité de matériau final suffisante pour des analyses ultérieures au niveau du génome entier. Une éventuelle limitation de cette méthode est l&#39;exigence d&#39;un puissant moteur pour produire ribosomes marquées en quantité suffisante pour compete avec celles non marquées endogènes dans le type de cellule ciblée. Dans une étude récente 25, les auteurs estimés à 10-30% le ratio d&#39;marqué contre ribosomes non balisés. Pour surmonter ce problème croissant-EGFP UAS-RpL10A nombre de copies devraient considérablement améliorer cet équilibre. Alternativement, en ajoutant à l&#39;arrière-plan génétique décrit un transgène UAS-GAL4 va amplifier la production de la protéine GAL4 et augmenter indirectement expression de RpL10A-EGFP. Cela devrait favoriser une meilleure occupation des ribosomes marqués sur l&#39;ARNm. Notez que cette approche déjà efficace peut être rendue encore plus puissante en adaptant les méthodes complémentaires pour apporter un aspect plus quantitative ou à découvrir et élucider les mécanismes moléculaires qui sont essentiels pour le contrôle de l&#39;expression des gènes.

Comprendre comment les cellules acquièrent des propriétés spécifiques au cours du développement est cruciale afin d&#39;apprécier la complexité des organes et de leur potentiel d&#39;évolution vers des conditions pathologiques. Il ya un gros effort de recherche à déchiffrer les réseaux de régulation des gènes qui sous-tendent la spécification et la différenciation cellulaire par des profils d&#39;expression génique mondiaux unrevealing, caractère contraignant Pol II, transcription du facteur d&#39;occupation sur des séquences régulatrices ou des modifications post-traductionnelles des histones. Pour évaluer l&#39;expression de gène à puces mondiales de niveau et des approches d&#39;ARN-Seq sont utilisés. Les puces à ADN permettent de détecter l&#39;ARNm abondance, tandis que l&#39;ARN-Seq est mieux adapté à l&#39;information sur les différents types d&#39;ARN, y compris le codage et non codantes ARN comme microARN, lncRNAs ou ARNsn. Cependant, ces techniques ne peuvent pas différencier activement transcrites, l&#39;état d&#39;équilibre de l&#39;ARNm, activement traduction de l&#39;ARNm, et l&#39;ARNm entrant dans le processus de dégradation. Mesure constante st-mangé niveaux d&#39;ARNm est connu pour être une mauvaise estimation de la composition du protéome 1-3. En revanche, d&#39;identifier activement la traduction de l&#39;ARNm donne une image plus précise de la production de protéines. Cependant, des études transcriptomiques ont été principalement mené au niveau organisme entier en comparant gain ou la perte de la fonction d&#39;un facteur spécifique au type sauvage état ​​4-7 ou sur le tissu disséqué, rendant les profils d&#39;expression génique difficiles à interpréter. Les progrès récents dans les outils de ciblage cellulaire, de purification par affinité et des améliorations de sensibilité permettent désormais d&#39;effectuer des analyses du génome entier sur les populations de petites cellules ou des cellules, même simples dans un organisme vivant. Chez la drosophile, de grandes collections de lignées transgéniques permettent un ciblage spécifique temporelle et spatiale des différents tissus et des sous-populations de cellules par le système GAL4 / UAS 8-10 donnant une quantification plus précise des mécanismes moléculaires nécessaires à la fonction cellulaire. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Parmi les approches nouvellement développés polysome profilage par fractionnement a été décrit comme un moyen de capturer activement la traduction de l&#39;ARN 11. Cette méthode basée sur la centrifugation sur gradient de saccharose permet la sélection de la fraction de polysomes et la détermination de l&#39;ARNm traduit l&#39;échelle du génome lorsqu&#39;on l&#39;analyse avec puces à ADN ou un séquençage de profondeur. Polysomes isolement peut être couplé avec la nuclease digestion pour identifier des empreintes ribosomiques correspondant à des fragments d&#39;ARN par les ribosomes protégées pendant le processus de traduction 12. Empreinte ribosomique augmente la précision de la quantification de la traduction de l&#39;ARN et la résolution de niveau séquence ARN et le positionnement ribosome, permet de mesurer le taux de la traduction. Cependant, à ce jour, il n&#39;a pas été appliquée à l&#39;isolement spécifique de la cellule de translatomes, principalement en raison de la forte diminution du rendement d&#39;ARN obtenu à la fin du processus de l&#39;empreinte ribosome. Étant donné que la sélection de la taille de l&#39;ARN peut générer potentiel faux-positives de différentes RNP qui pourrait également être protégeaient l&#39;ARN d&#39;une manière similaire, d&#39;autres développements sont nécessaires pour améliorer l&#39;empreinte ribosomal et l&#39;adapter à des approches spécifiques des cellules. Une de ces méthodes, appelé le Translating ribosome Affinity Purification (TRAP) a été décrite en 2008 par Heiman et al. et appliqué à isoler le translatome de sous-ensemble de neurones chez la souris. Par marquage d&#39;epitope d&#39;une protéine ribosomique dans une cellule de type manière spécifique, polysomes peuvent être purifiés de manière sélective sans l&#39;étape laborieuse de dissociation des cellules et le tri. Dans ce cas, les 60S ribosomique L10a à protéines de la surface du ribosome a été taggés avec eGFP 13. Depuis 2008, plusieurs études ont utilisé cette méthode dans différentes espèces, à partir de souris 14-19 à X. laevis 20,21, 22,23 et le poisson zèbre Arabidopsis thaliana 24. La méthode TRAP a également été adapté au modèle de Drosophila et utilisé pour puritype de cellule spécifiques fy ARNm de cellules neuronales 25 et 26 astrocytes. Le système binaire polyvalent GAL4 / UAS a été utilisé pour exprimer la GFP-tagged RpL10A d&#39;une manière tissu-spécifique. Chefs de mouches adultes ont été disséqués pour effectuer une sélection d&#39;polysome de cellules neuronales (ciblés par pan-neuronal pilote Elav-Gal4) et des ARN isolés ont été séquencés. Le grand nombre de gènes régulés à la hausse correspondait à ceux connus pour être exprimés dans le système nerveux, ce qui indique que l&#39;approche a une bonne spécificité et nous incitant à l&#39;adapter aux populations de cellules rares (moins de 1% des cellules) présente dans le développement des embryons de drosophile . Dans le modèle de drosophile, le stade embryonnaire est un modèle de choix pour l&#39;étude des processus de développement, comme les acteurs moléculaires et mouvements morphogénétiques sont évolutives conservées. Les approches transcriptomiques seulement tissulaires spécifiques menées jusqu&#39;à présent dans ce modèle ont été effectuées en utilisant cellulaire ou nucléaire afinrter et ont seulement été capables d&#39;étudier l&#39;état d&#39;équilibre transcriptome 27-31, créant un besoin de méthodes dédiées au tissu / cellule-spécifique translatome profilage dans l&#39;embryon de mouche. Nous rapportons ici le premier protocole TRAP dédiée aux embryons de drosophile. Avec cette méthode, engagée en translation de l&#39;ARNm dans une population de cellules très limité de l&#39;ordre de 100 cellules musculaires par embryon a été isolé avec succès avec la qualité et la spécificité. Le / système de SAMU GAL4 binaire est utilisé pour entraîner l&#39;expression de RpL10A GFP marqués dans la sous-population des muscles sans aucune toxicité, aucun phénotypes apparentes ou un retard de développement, comme indiqué précédemment 25. Embryons de drosophile possèdent 30 muscles par hemisegment qui donneront lieu à la musculature de la larve. En utilisant une région régulatrice découvert à proximité du gène d&#39;une identité en reste, 6 des 30 muscles multi-nucléées sont ciblés. Dans cet essai, les ribosomes sont immobilisés sur de l&#39;ARNm en utilisant l&#39;allongement de traductioninhibiteur cycloheximide. Extraits cytosoliques sont ensuite utilisés pour la purification par affinité avec des billes magnétiques recouvertes d&#39;anticorps GFP. Qualité de l&#39;ARN purifié a été validée à l&#39;aide bioanalyseur. Transcription inverse quantitative PCR (RT-qPCR) a été utilisé pour déterminer la spécificité et la sensibilité de l&#39;ARNm et de l&#39;isolement a démontré que notre protocole optimisé est très efficace.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>H4034-1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850306P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>thermo scientific&#160;</td>
			<td>R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified BSA 100X&#160;</td>
			<td>Biolabs</td>
			<td>B9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast tRNA&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R5636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super RNase In&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody GFP clone N86/38</td>
			<td>UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated</td>
			<td>75-132&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11754595001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 Lysis homogenisation&#160;</td>
			<td>Bertin Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water&#160;</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads ProteinG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10004D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Applied Biosystem&#160;</td>
			<td>AM96406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)&#160;</td>
			<td>Applied Biosystem&#160;</td>
			<td>AM95306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose waddin unbleached&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>115-2597&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieves 112, 355, 710 um&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRiZol&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagRack 6</td>
			<td>GE HealthCare&#160;</td>
			<td>28948964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low binding filter tips&#160;</td>
			<td>ClearLine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase free tube 1,5 mL&#160;</td>
			<td>ClearLine</td>
			<td>390689DD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20&#160;</td>
			<td>Fischer Bioreagent&#160;</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C1985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor tablets, Mini-Complete, EDTA-free&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

trap-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of drosophila embryos

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.

Le système musculaire somatique embryonnaire chez la drosophile est composé de 30 muscles par hemisegment, et chaque muscle a un ensemble spécifique de propriétés: code de gènes d&#39;identité, la position, le nombre d&#39;événements de fusion, des sites de fixation et innervation. Identifier traduit ARNm dans un sous-ensemble spécifique de muscle donnera des informations sur les protéines nécessaires pour former ces caractéristiques spécifiques musculaires. En utilisant la méthode basée TRAP, de l&#39;ARN à partir d&#39;un sous-population de muscles exprimant le gène de la mollesse de l&#39;identité a été purifié (figure 1A-B). Une préoccupation majeure de cette approche est la qualité et la spécificité de l&#39;ARN isolé. Le protocole optimisé rapportée ici a permis la récupération systématique des ARN de haute qualité évaluée par analyse de bioanalyseur. Le profil obtenu ne présente aucune dégradation de l&#39;ARN (figure 1C). Dans d&#39;autres études développées autour de la méthode TRAP, questions ont été soulevées au cours de la spécificité des données. Ici, nous improve le procédé pour supprimer fond lié à la liaison non spécifique de l&#39;ARN pour les billes ou les tubes et par l&#39;optimisation du tampon de lavage. Afin d&#39;évaluer le niveau et l&#39;efficacité d&#39;isoler des cellules exprimant slouch fond, nous avons mené des essais de RT-qPCR sur 3 répétitions du même stade embryonnaire. Pliez-enrichissements de 4 gènes différents (MEF2, empoté, Prospero, soxNeuro) ont été calculées par rapport à l&#39;entrée et normalisée contre le gène de rpl32 (figure 1D). Ces résultats ont montré un enrichissement de 2,3 fois de MEF2 de gènes pan-musculaires et d&#39;enrichissement de 5,6 fois du gène reste. En revanche, les deux gènes exprimés dans le système nerveux ont été appauvri par rapport à l&#39;entrée. Des valeurs très similaires de facteur de changement ont été observés sur 3 répétitions biologiques, ce qui démontre que le protocole est robuste. Avec chauffeur Slouch-Gal4 et à partir de 1,5 g, autour de 1,5x10 ^ 6 embryons ont été obtenus qui contiennent 100 cellules GFP / embryon (total de 150 × 10 ^ 6 positifcellules). Après l&#39;exécution de l&#39;expérience TRAP, le rendement est d&#39;environ 25-45 ng d&#39;ARN spécifique selon le stade d&#39;intérêt. Ce matériau est suffisante pour faire fonctionner analyse de puces à ADN ou ARN-seq en utilisant un protocole d&#39;amplification de construire une bibliothèque d&#39;ARN-seq. Efficacité dépendra fortement de la force du pilote utilisé pour exprimer RpL10A-EGFP. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52985/52985fig1.jpg" /> Figure 1. Qualité et évaluation de la spécificité de l&#39;ARN-TRAP isolé de Slouch-GAL4&gt; embryons UASRpL10A-EGFP. (AB) images confocale d&#39;un embryon stade-16 montrant l&#39;expression RpL10A-EGFP spécifiquement dans les six cellules musculaires Slouch par hemisegment (A). Co-localisation de RpL10A-EGFP avec le marqueur musculaire générale Beta3tubulin est observée sur l&#39;image de fusion (B). (C) de contrôle de la qualité des ARN et TRAP ran sur bioanalyseur montrant une parfaite intégrité des ARNr 18S et 28S. Analyse (D) RT-qPCR montrant une grande spécificité d&#39;expériences d&#39;ARNm TRAP isolé sur 3 répétitions biologiques de l&#39;étape-16 embryons. Pliez le changement est calculé par rapport à l&#39;entrée et normalisée contre le gène de rpl32. Transcriptions MEF2 présents dans toutes les lignées musculaires sont 2,3 fois enrichis par rapport à l&#39;entrée tandis que les transcriptions slouch plus restreints sont 5,6 fois enrichi. Cellules neurales exprimant Prospero et gènes soxN sont épuisées 2,2 fois et 5,5 fois respectivement. Les barres d&#39;erreur représentent l&#39;écart type (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52985/52985fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.

TRAP-rc, Translating ribosome Purification par affinité à partir de populations de cellules rares de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

trap-rc-translating-ribosome-affinity-purification-from-rare-cell

Research

JoVE Journal

Biology

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

17.7K vues.  University of Clermont-Ferrand. Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos. 

Vidéo: TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Préparation des cultures de neurones d&#39;embryons de drosophile Midgastrula scène

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Recherche

Biologie

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In vivo d&#39;embryons de drosophile Centrifugation

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

Imagerie verticale de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Cultures de cellules primaires à partir Drosophile Embryons Gastrula

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Changement de forme d&#39;imagerie cellulaire en vie Drosophile Embryons

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical studies are substantial, therefore it is essential that more predictive toxicology screens are developed and deployed early on in drug development (Greenhough et al 2010). Human hepatocytes represent the current gold standard model for evaluating drug toxicity, but are a limited resource that exhibit variable function. Therefore, the use of immortalised cell lines and animal tissue models are routinely employed due to their abundance. While both sources are informative, they are limited by poor function, species variability and/or instability in culture (Dalgetty et al 2009). Pluripotent stem cells (PSCs) are an attractive alternative source of human hepatocyte like cells (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs are capable of self renewal and differentiation to all somatic cell types found in the adult and thereby represent a potentially inexhaustible source of differentiated cells. We have developed a procedure that is simple, highly efficient, amenable to automation and yields functional human HLCs (Hay et al 2008 ; Fletcher et al 2008 ; Hannoun et al 2010 ; Payne et al 2011 and Hay et al 2011). We believe our technology will lead to the scalable production of HLCs for drug discovery, disease modeling, the construction of extra-corporeal devices and possibly cell based transplantation therapies.

This article will focus on the generation of human hepatic endoderm from human embryonic stem cell populations.

Génération robuste des hépatocytes comme des cellules embryonnaires humaines à partir populations de cellules souches

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolement et purification de la kinésine de Drosophila Embryons

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Identification des partenaires protéine interagissant Utilisation Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

À haut débit Affinity Purification de protéines recombinantes-étiquette

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Purification des relevés de notes et de métabolites<em&gt; Drosophila</em&gt; Têtes

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...