The work was supported by Barncancerfonden (PR2013-0104), Swedish Research Council (12187-18-3), &#246;gonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsn&#228;mnd f&#246;r synskadade, Synfr&#228;mjandets forskningsfond and St Eriks &#246;gonsjukhus forskningsstipendier.

Ce protocole est effectuée en conformité avec les recommandations dans le «Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire de l&#39;Association pour la recherche en vision et en ophtalmologie&quot;. 1. Manipulation des oeufs et de la collecte des yeux <ol><li> Rangez les oeufs Leghorn blanche à 12-14 ° C pendant plus de 1 semaine. Si possible, utilisez un refroidisseur de vin réfrigéré pour stocker les œufs fécondés. Remarque: Des températures plus élevées des magasins conduisent à un développement anormal de l&#39;embryon, alors que des températures plus basses augmente la mortalité. Temps de stockage étendu augmente à la fois la mortalité et le développement anormal. </li><li> Incuber les oeufs dans un 37,5 ° C et 60% incubateur humidifié avec doux balancement à une fréquence de 5 fois par 24 heures. </li><li> Retirer les oeufs incubés de l&#39;incubateur d&#39;œufs à l&#39;âge embryonnaire souhaitée. Note: l&#39;âge de l&#39;embryon de poulet est déterminé que le temps d&#39;incubation et est désignée par jour embryonnaire (E) ou comme des étapes (st), En fonction de la série de stades de développement décrits par Hamburger et Hamilton 12. </li><li> Placez les oeufs sélectionnés dans la hotte à flux laminaire. Essuyez la coquille avec 70% d&#39;éthanol pour éviter la contamination de l&#39;embryon. Remarque: Effectuer toutes les procédures dans des conditions aseptiques avec des solutions stériles <url> http://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory&quot;lutions </url> et des instruments. </li><li> Appuyez sur le côté de l&#39;oeuf fermement contre une surface dure pour en ouvrir l&#39;œuf. Placer le contenu dans une boîte de Pétri de 100 mm. Utiliser une petite cuillère à transférer l&#39;embryon dans une boîte de Petri de 35 mm contenant préchauffé (37 ° C) 1 x PBS pour empêcher le tissu de séchage. </li><li> Placez le plat de 35 mm de Pétri contenant le tissu embryonnaire sur un microscope binoculaire stéréoscopique de dissection dans la hotte à flux laminaire. Décapiter l&#39;embryon en pinçant le cou avec une pince fine et jeter le corps. </li><li> Utilisez une pince fine de faire une incision erugueuse la bouche, ventrale à l&#39;œil. À partir du site de l&#39;incision, déchirer le tissu entourant l&#39;œil entier. Pincez le nerf optique et enlever l&#39;oeil intact de l&#39;orbite de l&#39;œil. Recueillir la fois la gauche et l&#39;œil droit du même embryon pour une utilisation soit comme le contrôle ou l&#39;oeil traité. </li><li> Utilisez une petite cuillère pour transférer les yeux à un nouveau plat de 35 mm de Pétri contenant préchauffé (37 ° C) 1x PBS. </li></ol> 2. Préparation de l&#39;ensemble de la rétine explants <ol><li> Utilisez des pinces fines pour enlever tous les tissus autour de l&#39;œil, y compris l&#39;ébauche scléral. Remarque: Le tissu se détache facilement en laissant la rétine sur le corps vitré et le cristallin de l&#39;épithélium pigmentaire intacte (figure 1A-B). </li><li> Utilisez des pinces fines pour pincer une petite incision dans l&#39;épithélium pigmentaire à la partie dorsale de l&#39;œil sans endommager la rétine neurale (figure 1C). </li><li> Utilisez une pince fine à déchirer doucement pour ouvrir la starti de l&#39;épithélium pigmentaireng au niveau du site de l&#39;incision, en laissant la lentille et la rétine entière fixée sur le corps vitreux (figure 1D). Maintenir l&#39;oeil à chaud (37 ° C) 1 x PBS pour faciliter l&#39;élimination de l&#39;épithélium pigmentaire. Remarque: L&#39;épithélium pigmentaire peut être difficile à enlever, en particulier le long du corps ciliaire autour de la pupille, dans la région antérieure de l&#39;oeil, et le long de la fissure de la choroïde. Par conséquent, une partie de l&#39;épithélium pigmentaire peut être laissé sur la rétine neurale (figure 1E-F). </li></ol> 3. Traitement de l&#39;ensemble de la rétine explants <ol start="1"><li> L&#39;électroporation des explants de rétine entière Note: L&#39;électroporation des explants de rétine entière peut être réalisée directement après l&#39;étape 2. <ol><li> Préparer un milieu de culture contenant de 1: 1 de DMEM: F12 mélange de nutriments, 10% de FBS, 10 U / ml de pénicilline streptomycine, 5 ug / ml d&#39;insuline, et 2 mM de L-glutamine. </li><li> Coupez une cuvette de 1,5 ml jetable en plastique (12,5 mm x 12,5 mm x 45 mm) (ou tout petit récipient capable de contenir solution 300-400 pi) environ 8 mm du fond à l&#39;aide d&#39;une scie à lame fine. </li><li> Diluer le plasmide d&#39;ADN de choix dans 1xDPBS à une concentration finale de 0,1 pg / pl. </li><li> Activer les paramètres de réglage et électroporateur à 15 V pour ST20 - ST25 (E3-E4) et la rétine 20 V pour ST26 - ST27 (E5) rétine. Définissez les impulsions répétitions à 5 impulsions de 50 ms longueur d&#39;impulsion avec 1 seconde d&#39;intervalle. Utilisez un générateur d&#39;impulsions qui peut être contrôlé par une pédale sur le sol comme deux mains seront nécessaires pour maintenir les électrodes en place. </li><li> Connectez deux paddle en forme (plat, diam circulaire. 4 mm) électrodes de platine (figure 2A) à la prise de sortie sur le générateur d&#39;impulsions. Remarque: Les électrodes de platine utilisées dans ce protocole ont été faites par l&#39;atelier de l&#39;université. Les électrodes ont été fabriqués à partir de plaque de platine de 0,1 mm &quot;rondelles&quot; (grade de platine: 950 Pt / 5 Cu). Le raccordement 0,8 mm wire a été isolé en utilisant des tubes en plastique. </li><li> Soigneusement transférer l&#39;ensemble expiant rétine de l&#39;étape 2.3 de la cuvette (ou petit récipient équivalent) à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur en polyéthylène avec le bout coupé à acquérir la bonne taille tip-ouverture pour l&#39;expiant rétinienne. Évitez d&#39;utiliser des embouts de pipette que la rétine tend à attacher à la plastique et déchirer. </li><li> Utiliser une pipette de 100 pi pour enlever délicatement l&#39;ensemble 1x PBS entourant la rétine en prenant garde de ne pas toucher expiant la rétine pour éviter de déchirer. </li><li> Ajouter la solution de plasmide de 100 ul de la cuvette pour couvrir l&#39;ensemble explant rétinienne. Appuyez doucement sur l&#39;explantation de la rétine avec une pince si elle remonte à la surface. Utiliser des pinces ou des électrodes pour positionner la lentille pour faire face à tout un côté de la cuvette et le nerf optique au fond de la cuvette. </li><li> Placer l&#39;électrode positive en avant de la lentille et l&#39;électrode négative derrière la rétine (figure 2A), sans toucher le tissu. </li><li>Appliquer le courant en appuyant sur la pédale. Vérifiez bulles au niveau des électrodes indiquant acquitter avec succès. </li><li> Utiliser une pipette de 100 pi pour enlever toute la composition de plasmide à partir de la cuvette sans endommager la rétine. Le mélange de plasmide peut être réutilisé trois à cinq fois. </li><li> Remplir la cuvette avec préchauffé (37 ° C) 1x PBS. Utiliser des pinces pour détacher doucement l&#39;expiant de la rétine à partir de la paroi de la cuvette. Après électroporation de la rétine est parfois recouverte de bulles, ce qui fait adhérer à la paroi de la cuvette. </li><li> Utilisez la pipette polyéthylène Pasteur de transférer la totalité de la rétine explant dans une plaque de 24 puits contenant 1 ml préchauffé (37 ° C) milieu de culture par puits. Incuber une explantation de la rétine par puits. </li><li> Incuber l&#39;expiant de la rétine à 37 ° C sur un agitateur rotateur, avec une vitesse constante de 50 tours par minute, à l&#39;intérieur d&#39;un incubateur de cellules avec 5% de CO2 pendant 24 heures. La rotation est d&#39;assurer une exposition maximale à moyen et à prevent adhérence de la rétine au fond de la plaque à 24 puits. </li><li> Passez à l&#39;étape 4. </li></ol></li><li> Le traitement des explants de rétine entières avec des réactifs chimiques Remarque: Le traitement chimique des explants de rétine entière peut être réalisée directement après l&#39;étape 2. <ol><li> Préparer un milieu de culture contenant de 1: 1 de DMEM: F12 mélange de nutriments, 10% de FBS, 10 U / ml de pénicilline streptomycine, 5 ug / ml d&#39;insuline, et 2 mM de L-glutamine. </li><li> Utilisez une petite cuillère pour transférer l&#39;expiant de la rétine de l&#39;étape 2.3 dans une plaque de 24 puits contenant 1 ml de pré-chauffé (37 ° C) milieu de culture par puits. Incuber une explantation de la rétine par puits. </li><li> Incuber l&#39;ensemble explant rétinienne pendant 60 min à 37 ° C sur un agitateur rotateur, avec une vitesse constante de 50 tours par minute, à l&#39;intérieur d&#39;un incubateur de cellules avec 5% de CO 2 avant l&#39;ajout d&#39;un réactif chimique ou d&#39;un véhicule. </li><li> Préparer la solution chimique, par exemple Cdk1 / 2 inhibiteur III, un inhibiteur de la progression de phase M-13, à une finaleconcentration de 30 uM dans du DMSO. </li><li> Retirer la plaque de 24 puits, contenant l&#39;ensemble explantation de la rétine, de l&#39;incubateur de cellules. Ajouter 10 ul du réactif chimique ou le véhicule (DMSO) directement au milieu de la rétine, ce qui entraîne une concentration finale de 300 nM Cdk1 / 2 inhibiteur III dans 0,01% de DMSO. Faire tourner manuellement la plaque à 24 puits pour permettre une distribution uniforme du réactif chimique ou d&#39;un véhicule dans la solution. </li><li> Incuber les explants de rétine à 37 ° C sur un agitateur rotateur, avec une vitesse constante de 50 tours par minute, à l&#39;intérieur d&#39;un incubateur avec 5% de CO 2 pendant la durée souhaitée (jusqu&#39;à 24 h). </li><li> Passez à l&#39;étape 4. </li></ol></li></ol> 4. Fixation et congélation plénier rétine Eexplants <ol><li> Retirer la plaque à 24 puits contenant la totalité de la rétine traitée explant de l&#39;incubateur de cellules. </li><li> Utilisez une petite cuillère pour transférer l&#39;expiant rétinienne à une plaque de 24 puits contenant 1 ml / puits glacé 4% de paraformaldehyde dans 1xPBS. Incubate sur de la glace pendant 15 min. </li><li> Utilisez une petite cuillère de transférer la totalité de la rétine expiant à une plaque de 24 puits contenant 1 ml / puits 1xPBS froid glace pour laver la rétine. Incuber sur de la glace pendant 10 min. </li><li> Utilisez une petite cuillère de transférer la totalité de la rétine expiant à une plaque de 24 puits contenant 1 ml / bien glacée de saccharose à 30% en 1xPBS. Incuber sur glace pendant 1-3 heures selon le jour embryonnaire de la rétine. Pour ST20 - ST25 (E3) rétines, incuber pendant 1 h, rétines âgées ont besoin de plus de temps d&#39;incubation en saccharose. </li><li> Utilisez une petite cuillère de transférer la totalité de la rétine explant sur un film de paraffine contenant environ 500 pi cryostat congélation milieu de montage. Retirez autant de saccharose que possible en déplaçant doucement l&#39;expiant de la rétine dans le milieu de congélation en utilisant la petite cuillère. </li><li> Transférer l&#39;expiant rétine à un moule contenant intégration milieu de congélation. Positionnez l&#39;œil pour faciliter le sectionnement avenir. Mettez le moule enrobage contenant l&#39;ensemble expiant rétinienne sur dry de la glace jusqu&#39;à ce que le milieu est gelé. Conserver à -80 ° C. </li></ol>

<ol>
	<li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).</li><li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation.">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Method. 24, 43-48 (2001).</li><li>Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+patterns+and+targets+of+dA1+interneurons+in+the+chick+hindbrain.">Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain.</a> J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).</li><li>Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporation+in+embryonic+chick+retina.">In ovo electroporation in embryonic chick retina.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+commitment+and+differentiation+in+explants+of+embryonic+rat+neural+retina.+Comparison+with+the+developmental+potential+of+dissociated+retina.">Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina.</a> Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).</li><li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+hairy+and+Enhancer+of+split+homolog+1+regulates+differentiation+of+retinal+neurons+and+is+essential+for+eye+morphogenesis.">Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis.</a> Neuro. 16, 723-734 (1996).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).</li><li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures.">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).</li><li>Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+explant+culture+of+the+embryonic+chicken+retina+with+long-term+preservation+of+photoreceptors.">Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors.</a> Exp eye re. 93, 556-564 (2011).</li><li>Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heterogenic+final+cell+cycle+of+chicken+retinal+Lim1+horizontal+cells+is+not+regulated+by+the+DNA+damage+response+pathway.">The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway.</a> Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).</li><li>Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+terminal+basal+mitosis+of+chicken+retinal+Lim1+horizontal+cells+is+not+sensitive+to+cisplatin-induced+cell+cycle+arrest.">The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest.</a> Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88, 49-92 (1951).</li><li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+cyclin+B1-Cdk1+synchronizes+events+in+the+nucleus+and+the+cytoplasm+at+mitosis.">Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis.</a> J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).</li><li>Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+in+the+neural+tube.">Mitosis in the neural tube.</a> J Comp Neurol. 62, 377-405 (1935).</li><li>Baye, L. M., Link, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interkinetic+nuclear+migration+and+the+selection+of+neurogenic+cell+divisions+during+vertebrate+retinogenesis.">Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis.</a> J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Dans ce travail, un protocole détaillé pour la dissection, l&#39;électroporation ou traitement chimique, et la culture des explants rétiniens entiers à partir d&#39;embryons de poulet est présenté. Ce protocole est simple, rapide et permet à la fois un taux de réussite élevé et reproductible résultats. L&#39;électroporation des explants de rétine entière produit de grandes zones de cellules qui expriment le produit d&#39;assemblage de gène d&#39;intérêt. ...

La rétine est une partie du système nerveux central et il est, avec sa relative simplicité et de l&#39;architecture cellulaire bien caractérisée, un modèle populaire pour étudier le développement du système nerveux central. L&#39;oeil de l&#39;embryon de poulet est relativement grande en comparaison avec le reste de l&#39;embryon. Il est donc facilement accessible in ovo à des manipulations expérimentales, telles que des injections ou l&#39;électroporation, et sert un excellent outil pour acquérir des connaissances sur cellules rétiniennes et la biologie du développement in vivo. Malgré ces avantages majeurs, la survie des embryons peut être faible lorsque les expériences sont envahissantes comme avec électroporations, des injections répétées, ou des manipulations expérimentales combinées. L&#39;électroporation de plasmides d&#39;ADN dans l&#39;embryon de poulet in ovo est une technique importante et bien établie 1. Il permet pour l&#39;étiquetage des neurones, le traçage du destin cellulaire ainsi que voies neuronales dans la NERV centraleous système et il permet l&#39;expression ectopique des gènes à analyser la fonction des protéines in vivo. La technique a été utilisée pour les études de tube neural 2, Rhombencéphale 3, 4 et de la rétine. Électroporation de la rétine embryonnaire in ovo a quelques difficultés expérimentales qui sont liés à la situation in vivo. La position de l&#39;oeil, en raison du pliage du crâne de l&#39;embryon, est relativement proche du cœur. Cette proximité augmente le risque d&#39;un arrêt cardiaque suivant l&#39;électroporation, et le risque augmente avec l&#39;âge de l&#39;embryon. En outre, pour accéder à l&#39;œil, il est nécessaire d&#39;ouvrir les membranes embryonnaires, ce qui augmente le risque de saignement, des malformations et après la viabilité réduite. Lors de l&#39;essai et l&#39;optimisation d&#39;un nouveau plasmide d&#39;ADN souvent sans un résultat phénotypique connu, ces limitations peuvent diminuer l&#39;efficacité et la puissance de la méthode, même pour un expérimentateur expérimenté. Tel que présenté dans ce protocole, la culture de la wexplant trou rétinien, définie comme la rétine neurale ensemble avec l&#39;épithélium pigmentaire enlevée, est un procédé efficace qui complète l&#39;approche en ovo. Injections intraoculaires de réactifs chimiques sont relativement faciles à réaliser in ovo. Cependant, la concentration efficace et précise des réactifs injectés au sein de la rétine neurale peut être difficile de contrôler entièrement. Le volume injecté peut varier en raison de fuites et l&#39;emplacement exact de l&#39;injection peut affecter à la fois la distribution du réactif dans l&#39;oeil et de la diffusion à travers le corps vitré. La variabilité aura des implications majeures pour l&#39;interprétation des résultats lorsque ie, une courbe dose-réponse pour un inhibiteur de l&#39;enzyme est déterminée; en particulier si l&#39;effet est faible et la fenêtre temporelle de l&#39;effet est étroite. En outre, un seul œil peut être utilisé à partir de chaque embryon lors de l&#39;exécution dans des expériences in ovo en raison des effets potentiels systémiques par le biais du flux sanguinsur l&#39;oeil controlatéral. Age appariement est important lorsque l&#39;on étudie le développement et la variabilité individuelle entre traités et les embryons de contrôle peut conduire à la variabilité expérimentale supplémentaire. Pour ces raisons, un procédé ex ovo basé sur des explants de rétine embryons de poulet a été développé, dans lequel la rétine neurale peut être exposé à un uniforme et contrôlée condition expérimentale in vitro. Le présent protocole a été développé sur la base de protocoles antérieurs 5-9. Explants de rétine à partir de l&#39;étape (st) 20 (jours embryonnaires [E] 3) à ST31 (E7) d&#39;embryons de poulet ont été disséquées, cultivées et soumises à une électroporation avec une concentration d&#39;ADN de plasmide défini ou exposées à un milieu contenant une concentration définie d&#39;un réactif chimique. Le protocole présenté ici a été mis en œuvre avec succès dans des publications récentes, utilisant plusieurs réactifs chimiques différents, y compris les régulateurs de la voie de dommages à l&#39;ADN, comme KU55933, SB 218078, et NSC 109555 ditosylate, et le cycle cellulaire, tel que Cdk1 / 2 10,11 inhibiteur III.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="859">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1xPBS (tablet)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>18912-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10xDPBS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14080-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-0798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL disposable plastic cuvette</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8495V01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D7039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>391-1998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Solveco</td>
			<td>1054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk1/2 inhibitor III</td>
			<td>217714</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>300nM in 0.01% DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Forma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrodes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Platina, custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro square porator ECM 830</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 Nutrient mix</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31331-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16140-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>AgnThos</td>
			<td>0108-5-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium NEG50</td>
			<td>Cellab, Sweden</td>
			<td>6502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP expressing DNA plasmid (pZGs)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified incubator</td>
			<td>Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany</td>
			<td>8204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I9278-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium ProLong Gold with DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>291-1214P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>16005-1KG-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel-A-Way embedding mold&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosphoHistone 3 (PH3)&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>06-570</td>
			<td>Dilution 1/4000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum electrodes (custom made from &#34;rondelles&#34;)</td>
			<td>Sargenta</td>
			<td>390-R (rondeller)</td>
			<td>Dia: 4mm, 0.1 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platimun electrodes&#160;</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>CUY700P4L</td>
			<td>Dia: 4 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-2853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-2900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small spoon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>231-2151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>443815S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Leghorn eggs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Local supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wine cooler</td>
			<td>WineMaster 24, Caso, Berlin Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole retinal explants from chicken embryos for electroporation and chemical reagent treatments

La rétine est un bon modèle pour le système nerveux central en développement. La grande taille de l&#39;œil et surtout l&#39;accessibilité pour les manipulations expérimentales in ovo / in vivo rend le poulet rétine embryonnaire un modèle expérimental polyvalent et très efficace. Bien que la rétine de poulet est facile à cibler in ovo par injections intra-oculaires ou l&#39;électroporation, la concentration efficace et précise des réactifs au sein de la rétine peut être difficile de contrôler entièrement. Cela peut être dû à des variations de site d&#39;injection exact, les fuites à partir de l&#39;œil ou de diffusion irrégulière de ces substances. En outre, la fréquence de malformations et de mortalité après manipulations invasives telles que l&#39;électroporation est plutôt élevé. Ce protocole décrit un ex ovo technique pour la culture des explants de rétine entière à partir d&#39;embryons de poulet et fournit un procédé pour contrôler l&#39;exposition de la rétine à des réactifs. Le protocol décrit comment disséquer, expérimentalement manipuler et explants rétiniens culture entiers à partir d&#39;embryons de poulet. Les explants peuvent être cultivées pendant environ 24 heures et être soumis à différentes manipulations telles que l&#39;électroporation. Les principaux avantages sont que l&#39;expérience ne dépend pas de la survie de l&#39;embryon et que la concentration du réactif introduit on peut faire varier et contrôlé afin de déterminer et optimiser la concentration efficace. En outre, la technique est rapide, pas cher et, avec son taux de réussite expérimentale haute, il assure reproductible résultats. Il convient de souligner qu&#39;il sert un excellent complément aux expériences réalisées in ovo.

Ce protocole décrit la préparation (figure 1A-F) et mise en culture des explants de rétine entière à partir d&#39;embryons de poulet. Ce protocole a été utilisé avec succès pour explants entiers de la rétine à partir d&#39;embryons de ST20 (E3) à ST31 (E7). Électroporation de plasmides d&#39;ADN dans des explants rétiniens entiers permet l&#39;étiquetage et la traçabilité des cellules souches rétiniennes ou sur-expression de différents produits de gènes. ...

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Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Ce protocole décrit un procédé pour disséquer, expérimentalement et manipuler des explants de rétine entière de la culture d&#39;embryons de poulet. Les cultures d&#39;explants sont utiles lorsque le taux de réussite élevé, l&#39;efficacité et la reproductibilité sont nécessaires pour tester les effets de plasmides pour l&#39;électroporation et / ou des substances réactives, à savoir, les inhibiteurs enzymatiques.

Explants rétiniens entières de poulet embryons pour Traitements électroporation et réactif chimique

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.4K vues.  Uppsala University.  Ce protocole décrit un procédé pour disséquer, expérimentalement et manipuler des explants de rétine entière de la culture d'embryons de poulet. Les cultures d'explants sont utiles lorsque le taux de réussite élevé, l'efficacité et la reproductibilité sont nécessaires pour tester les effets de plasmides pour l'électroporation et / ou des substances réactives, à savoir, les inhibiteurs enzymatiques. 

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Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Culture de souris embryonnaires cochléaires explants et Gene Transfer par électroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Recherche

Biologie du développement

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, fluid and nutrient supply). Consequently both the nervous and vascular systems develop alongside each other and share striking similarities in their branching architecture. Here we report embryonic manipulations that allow us to study the simultaneous development of neural crest-derived nervous tissue (in this case the enteric nervous system), and the vascular system. This is achieved by generating chicken chimeras via transplantation of discrete segments of the neural tube, and associated neural crest, combined with vascular DiI injection in the same embryo. Our method uses transgenic chickGFP embryos for intraspecies grafting, making the transplant technique more powerful than the classical quail-chick interspecies grafting protocol used with great effect since the 1970s. ChickGFP-chick intraspecies grafting facilitates imaging of transplanted cells and their projections in intact tissues, and eliminates any potential bias in cell development linked to species differences. This method takes full advantage of the ease of access of the avian embryo (compared with other vertebrate embryos) to study the co-development of the enteric nervous system and the vascular system.

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Here we report dual labeling of neural crest cells and blood vessels using chickGFP neural tube intraspecies grafting combined with intra-vascular DiI injection. This experimental technique allows us to simultaneously visualize and study development of the NCC-derived (enteric) nervous system and the vascular system, during organogenesis.

Double étiquetage des cellules de la crête neurale et des vaisseaux sanguins dans des embryons de poulet à l’aide de la greffe de tube neuralChick GFP et de l’injection de diI de colorant de carbocyanine

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

Transfert de gènes dans l&#39;organe de poulet Auditory par<em&gt; Dans Ovo</em&gt; Micro-électroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

Culture des adultes Zebrafish Retinal explants Transgenic pour des cellules vivantes par imagerie multiphotonique Microscopie

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that the chicken embryo is an effective research model for studying basic biological functions of auditory system development. More recently, the chicken embryo has become particularly valuable in studying gene expression, regulation and function associated with hearing. In ovo electroporation can be used to target auditory brainstem regions responsible for highly specialized auditory functions. These regions include the chicken nucleus magnocellularis (NM) and nucleus laminaris (NL). NM and NL neurons arise from distinct precursors of rhombomeres 5 and 6 (R5/R6). Here, we present in ovo electroporation of plasmid-encoded genes to study gene-related properties in these regions. We show a method for spatial and temporal control of gene expression that promote either gain or loss of functional phenotypes. By targeting auditory neural progenitor regions associated with R5/R6, we show plasmid transfection in NM and NL. Temporal regulation of gene expression can be achieved by adopting a tet-on vector system. This is a drug inducible procedure that expresses the genes of interest in the presence of doxycycline (Dox). The in ovo electroporation technique &#8211; together with either biochemical, pharmacological, and or in vivo functional assays &#8211; provides an innovative approach to study auditory neuron development and associated pathophysiological phenomena.

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Auditory brainstem neurons of avians and mammals are specialized for fast neural encoding, a fundamental process for normal hearing functions. These neurons arise from distinct precursors of embryonic hindbrain. We present techniques utilizing electroporation to express genes in the hindbrain of chicken embryos to study gene function during auditory development.

Dans Ovo Electroporation dans le Brainstem

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

Visualiser le nœud et la notochorde plaque en Gastrulating des embryons de souris à l’aide de la microscopie électronique à balayage et toute monture Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. The high transfection efficiency permits at least 4 distinct mRNAs to be co-transfected with ~87% efficiency. Most of the electroporated mRNAs are degraded during the first 2 h post-electroporation, permitting time-sensitive experiments to be carried out in the developing embryo. Finally, we describe how to dynamically image live embryos electroporated with mRNAs that encode various subcellular targeted fluorescent proteins.

We report messenger RNA (mRNA) electroporation as a method that permits fast and efficient expression of multiple proteins in the quail embryo model system. This method can be used to fluorescently label cells and record their in vivo movements by time-lapse microscopy shortly after electroporation.

Expression rapide et efficace des protéines multiples dans les embryons aviaires à l'aide de l'électroporation de l'ARNm

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to differentiate into later stages of muscle development. The protocol provided here describes a robust method for the isolation and culture of a highly proliferative population of myoblast cells from young adult mouse skeletal muscle explants. These cells are useful for the study of the metabolic properties of skeletal muscle of different mouse models, as well as in other downstream applications such as transfection with exogenous DNA or transduction with viral expression vectors. The level of differentiation and metabolic profile of these cells depends on the length of exposure, and composition of the media used to induce myoblast differentiation. These methods provide a robust system for the study of mouse muscle cell metabolism ex vivo. Importantly, unlike in vivo models, the methods described here provide a cell population that can be expanded and studied with high levels of reproducibility.

Myoblasts are proliferating precursor cells that differentiate to form polynucleated myotubes and eventually skeletal muscle myofibers. Here, we present a protocol for efficient isolation and culture of primary myoblasts from young adult mouse skeletal muscles. The method enables molecular, genetic, and metabolic studies of muscle cells in culture.

Isolement et différenciation des myoblastes primaires des explantations de muscle squelettique de souris

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

Une méthode de montage en couches pour la microscopie confocale de temps-lapse prolongée des embryons entiers de poisson zèbre

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

Immunohistochimie du mont entier dans les embryons et larves de poissons-zèbres

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...