Ce travail a été soutenu par le National Cancer Institute (K08CA140946, au YC), (5F32CA130372, pour PC), (R01CA102774 et R01HL055748 à PB), le ministère de la Défense (PC094302 au YC), le Fonds de la famille Shuman de recherche GIST (pour PC), et le Cancer Consortium Starr (pour PC, YC, CLS et PB). Nous tenons à remercier Katia Manova, Fan Ning, et Mesurh Türkekul de l&#39;installation MSKCC Cytologie Moléculaire de base pour aider à cryosectioning et immunocoloration.

1. La dissection de la souris tractus gastro-intestinal <ol><li> Souris euthanasiés par les directives locales IUCAC </li><li> Pin chaque membre sur la surface de styromousse et rincer la surface abdominale avec 70% d&#39;éthanol. Ouvrez cavité abdominale avec incision médiane à long du diaphragme au pubis. Faire une coupe à l&#39;oesophage distal et une seconde coupe à l&#39;intestin distal large et retirer le tube digestif de l&#39;estomac à l&#39;anus en bloc, bien couper les ligaments au niveau du duodénum et le caecum en utilisant de petits ciseaux. Placez tractus gastro-intestinal dans une boîte de Pétri avec du PBS. Disséquer loin mésentère utilisant une pince à épiler (figure 1). Pour séparer l&#39;estomac, l&#39;intestin grêle et le gros intestin, coupées à la jonction pylore et iléo-colique. Rincer la lumière de chaque partie du tractus gastro-intestinal avec PBS aide d&#39;une seringue 5ml attaché à une aiguille d&#39;alimentation (souris âgées) ou aiguille émoussée (jeunes souris). </li><li> Ouvrez l&#39;estomac, l&#39;intestin grêle et le gros intestin le long de la frontière mésentérique. Coupez deux morceaux pour chaque partie du tractus gastro-intestinal, l&#39;un pour la visualisation monter ensemble et un pour cryosection. </li></ol> 2. Whole préparation des échantillons monter et immunomarquage <ol><li> Placer le morceau entier de chaque partie du tractus gastro-intestinal dans un tube de 1,5 cm microcentrifugeuse rempli de 1,0 ml d&#39;acétone glacée et des échantillons de correctif pour au moins 1 heure à 4 ° C. Les échantillons peuvent être conservés jusqu&#39;à 1 semaine à -20 ° C. Nous généralement conserver les échantillons dans de l&#39;acétone et de commencer à préparer cyrosections. </li><li> Laver l&#39;échantillon 2X avec du PBS. Placer l&#39;échantillon dans la boîte de Pétri avec du PBS. Sous dissection miscroscope, soigneusement gratter la couche muqueuse avec un scalpel en tenant une extrémité avec une pince à épiler, laissant la musculeuse. </li><li> Musculaires peuvent être coupés en morceaux de 5 mm pour la coloration avec des anticorps différents. Ne pas stocker plus de deux jours dans du PBS avant coloration. </li><li> Étapes de bloc et d&#39;incubation qui peut être fait dans un puits d&#39;une plaque de 24 puits ou dans un tube de micro 1.5ml. Bloc avec 0,5 ml de tampon de blocage (sérum de chèvre 5%, 0,1% de Triton X-100 dans du PBS pendant 1 heure à 4 ° C). </li><li> Incuber avec l&#39;anticorps primaire dilué dans du tampon de blocage et tourner la nuit à 4 ° C. Nous avons utilisé avec succès ACK-2 de rat anti-Kit, lapin anti-Ano1, et de lapin anti-PGP9.5 anticorps pour immunomarquage monter ensemble. </li><li> Laver pendant 5 min avec du PBS 2X sur les rotateurs à température ambiante. </li><li> Incuber avec l&#39;anticorps secondaire dilué dans du tampon de blocage pendant 2 heures à température ambiante sur des rotateurs. Nous utilisons généralement Alexa Fluor 488 anti-lapin et Alexa Fluor 594 anticorps anti-rat. </li><li> Laver pendant 15 min avec du PBS 3X sur les rotateurs à température ambiante. </li><li> Mont sur la diapositive, côté séreux sur le dessus pour assurer l&#39;orientation des tissus au cours de la microscopie. Cette orientation sera d&#39;assurer la côté séreux faire face à la lamelle et être rencontrées d&#39;abord comme on se concentre sur la diapositive sur un microscope. Nous faisons cela sur un microscope à dissection. Parfois, nous examinons brièvement les tissus sous microscope à fluorescence pour orienter correctement. Sous la microscopie par fluorescence pour visualiser Kit ou Ano1, on devrait rencontrer le CPI-MY premier réseau du côté de la lamelle. Ensuite, aspirez PBS autant que possible, sans séchage complet. Ajouter 50 ul de médias mis en dur de montage (nous utilisons Prolongez Gold) et placez doucement lamelle sur le dessus du tissu. Permet de définir de montage nuit à température ambiante et de diapositives conserver à -80 ° C. </li><li> Pour l&#39;examen microscopique, nous avons utilisé un microscope à champ large avec un Z-drive. Nous avons utilisé soit un objectif de 20X air (NA 0,75, Plan Apochromat) ou l&#39;objectif du pétrole 60X (NA 1,4, Plan Apochromat) et a pris 2 um um ou 1 Z-sections qui couvrent l&#39;ensemble de la musculeuse. Les images ont ensuite été déconvolué en utilisant le logiciel de déconvolution Autoquant. Sinon, beaucoup d&#39;autres ont utilisé la microscopie confocale à la place avec des résultats similaires. </li></ol> 3. La préparation et immunocoloration Cryosection <ol><li> Placer chaque partie du tractus gastro-intestinal, côté séreux vers le bas, à plat sur un papier filtre. Couper le papier filtre autour du tissu. Placer le tissu sur un papier filtre dans du paraformaldéhyde 4% (PFA) dans du PBS (on dilue paraformaldéhyde 32% en flacon scellé dans du PBS juste avant utilisation) pendant 2 heures à température ambiante. La fixation peut se faire dans un 6 - ou à 12 puits Plaque selon la taille des tissus, ou dans un tube de 1,5 ml. Si c&#39;est fait dans l&#39;assiette, du parafilm pour minimiser l&#39;exposition PFA. Temps de fixation plus longues peuvent entraîner masquage des antigènes, en particulier pour le ACK-2 anti-Kit anticorps. </li><li> Enlever les tissus de l&#39;IFP et le lieu de saccharose à 30% dans le PBS. Autoriser les tissus à sombrer dans la nuit à 4 ° C. </li><li> Equilibrer les tissus avec 1:1 ratio de 30% de sucrose et PTOM pendant 1 heure. Montez ensuite le tissu verticalement dans cryomold rempli PTOM Le axe longitudinal du tube digestif doit être en parallèle avec le cyrosections. Lors de l&#39;examen des souris avec des génotypes différents ou avec des traitements différents, il peut être utile pour monter des tissus de souris différents sur cryomold mêmes pour assurer le traitement en parallèle. Freeze sur la glace sèche et placer dans un congélateur à -80 ° C pour le stockage. </li><li> Couper 10 cryocoupes umsur la glissière et conserver à -80 ° C au congélateur. Nous habituellement coupé deux sections par diapositive. Nous avons également exécutent habituellement coloration H &amp; E d&#39;une diapositive cryosection. </li><li> Pour l&#39;immunofluorescence, d&#39;abord d&#39;équilibrer glisser à la température ambiante pendant 15 minutes. Ensuite, dessinez cercle autour du tissu en utilisant un stylo PAP. </li><li> Bloc avec 150 ul de tampon de blocage (le même que pour le montage immunomarquage entier) pendant 1 heure. </li><li> Aspirer le tampon de blocage et ajouter 150 ul d&#39;anticorps primaire dilué dans du tampon de blocage et incuber une nuit à 4 ° C dans une chambre humidifiée. </li><li> Laver 5 min avec du PBS 2X. </li><li> Incuber avec l&#39;anticorps secondaire dilué dans du tampon de blocage pendant 2 heures à température ambiante. Nous utilisons généralement Alexa 488 anti-lapin et Alexa 594 anticorps anti-rat. </li><li> Laver pendant 15 min avec du PBS 3X. </li><li> Aspirer glisser sans complètement sécher les tissus. Ajouter une goutte de jeu dure montage de médias au DAPI (nous utilisons Prolongez l&#39;or) et la place # 1.5 lamelle. Placer la lame à température ambiante pendant une nuit de définir et de stocker dans -80 ° C au congélateur. </li><li> Acquérir des images de fluorescence en utilisant trois DAPI, FITC et au Texas Red jeux de filtres. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: Ici, nous utilisons le gros intestin comme un exemple. H &amp; E tache d&#39;une saccharose fixes protégés extemporané utilisés pour l&#39;immunofluorescence montre des artefacts par rapport à une section de paraffine de référence (figure 2), où la ligne jaune demarks plexus myentérique entre les couches musculaires longitudinales et circulaires et le demarks ligne verte de la frontière entre le muqueuse et muscularlis. L&#39;examen de la cryosection, à partir de la séreuse à la muqueuse, votre première rencontre avec le mince muscle longitudinal (LM) couche suivie par le plus épais du muscle (CM) La circulaire de la couche. La section doit être en parallèle avec le muscle longitudinal de sorte que le noyau des LM devrait être un peu allongé tandis que les noyaux de la CM doivent être petits et ronds. Entre le LM et CM sont plexi myentériques faite de neurones qui tache avec PGP9.5. PGP9.5 également les processus neuronaux taches tout au long du CM. Le réseau de la CPI myentérique (CCI-MA) entourent le plexus myentérique et sont faits de cellules multipolaires. Au sein de la couche musculaire longitudinale, il est rare CCI intramusculaire (CPI-IMS) qui sont des cellules bipolaires fonctionnant en parallèle avec le muscle. Au sein de la couche musculaire circulaire, il ya abondance de la CPI-IMS, qui sont aussi des cellules bipolaires qui fonctionnent en parallèle avec le muscle circulaire et sont à section avec cette coupe. À la jonction de la musculeuse et la sous-muqueuse, le réseau sous-muqueux de la CPI composée de CPI-PSM est un réseau des CCI plate multipolaire. Examiner le kit de montage toute immunomarquage du gros intestin, on doit s&#39;attendre à rencontrer la CPI-MY premier réseau, puis de la CPI-IM de la CM et la CCI-SMP réseaux, comme on se concentre de la lamelle (Figure. 3) . Mesure volumétrique des réseaux de la CCI en utilisant la reconstruction 3D de l&#39;ensemble de montage des images ont été décrits 10. L&#39;utilisation à large champ de microscope, il est significatif hors-plan de fluorescence dans les images brutes qui peuvent être retirés après déconvolution (figure 3). Incomplet décapage de la muqueuse se traduira par la fluorescence de fond élevé. ANO1 est un autre marqueur de la CPI et co-immunomarquage du KIT et ANO1 montre chevauchement complet de la coloration de la CPI (figure 4). <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Représentant la figure 1. Disséqué tractus gastro-intestinal de souris, reproduit avec l&#39;autorisation 13. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. A) Représentant coloration H &amp; E de l&#39;intestin de souris grand cryocoupes préparé comme décrit et la paraffine de référence intégré coupe montrant des artefacts rétrécissement de cryocoupes. La ligne jaune demarks plexus myentérique et la ligne bleue sépare la muqueuse de la musculeuse. B) Représentant Kit (rouge, ACK-2) et PGP9.5 (vert) immunofluorescence double avec DAPI (bleu) contre-coloration de l&#39;intestin de souris grand. LM: CM musculaires longitudinales: muscle circulaire. Barre d&#39;échelle de 20 um. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Représentant Kit (rouge, ACK-2) l&#39;ensemble de montage immunofluorescence du même champ à trois plans focaux, l&#39;ICC mon avion à la frontière LM / CM, le plan de la CCI-IM dans le CM, et l&#39;ICC- SMP avion à la frontière CM / sous-muqueuse. Les images brutes et les images déconvolué sont affichés. Barre d&#39;échelle de 20 um. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig4.jpg" alt="Figure 4"/> Figure 4. Représentant double immunofluorescence de Ano1 (vert) et Kit (rouge, ACK-2) dans le gros intestin. Barre d&#39;échelle de 20 um.

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	<li>Sanders, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+case+for+interstitial+cells+of+Cajal+as+pacemakers+and+mediators+of+neurotransmission+in+the+gastrointestinal+tract.">A case for interstitial cells of Cajal as pacemakers and mediators of neurotransmission in the gastrointestinal tract.</a> Gastroenterology. 111, 492-515 (1996).</li><li>Ward, S. M., Sanders, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+pathophysiology+of+the+interstitial+cell+of+Cajal:+from+bench+to+bedside.+I.+Functional+development+and+plasticity+of+interstitial+cells+of+Cajal+networks.">Physiology and pathophysiology of the interstitial cell of Cajal: from bench to bedside. I. Functional development and plasticity of interstitial cells of Cajal networks.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 281, 602-611 (2001).</li><li>Komuro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+organization+of+interstitial+cells+of+Cajal+in+the+gastrointestinal+tract.">Structure and organization of interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract.</a> J Physiol. 576, 653-658 (2006).</li><li>Sanders, K. M., Ordog, T., Koh, S. D., Torihashi, S., Ward, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+plasticity+of+interstitial+cells+of+Cajal.">Development and plasticity of interstitial cells of Cajal.</a> Neurogastroenterol Motil. 11, 311-338 (1999).</li><li>Ward, S. M., Burns, A. J., Torihashi, S., Sanders, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+the+proto-oncogene+c-kit+blocks+development+of+interstitial+cells+and+electrical+rhythmicity+in+murine+intestine.">Mutation of the proto-oncogene c-kit blocks development of interstitial cells and electrical rhythmicity in murine intestine.</a> J Physiol. 480, 91-97 (1994).</li><li>Huizinga, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=W/kit+gene+required+for+interstitial+cells+of+Cajal+and+for+intestinal+pacemaker+activity.">W/kit gene required for interstitial cells of Cajal and for intestinal pacemaker activity.</a> Nature. 373, 347-349 (1995).</li><li>Rubin, B. P., Heinrich, M. C., Corless, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+stromal+tumour.">Gastrointestinal stromal tumour.</a> Lancet. 369, 1731-1741 (2007).</li><li>Hirota, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+mutations+of+c-kit+in+human+gastrointestinal+stromal+tumors.">Gain-of-function mutations of c-kit in human gastrointestinal stromal tumors.</a> Science. 279, 577-580 (1998).</li><li>Chi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ETV1+is+a+lineage-specific+survival+factor+in+Gastrointestinal+Stromal+Tumour+(GIST).">ETV1 is a lineage-specific survival factor in Gastrointestinal Stromal Tumour (GIST).</a> Nature. , (2010).</li><li>Kwon, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+structure+and+function+of+ICC+networks+in+ICC+hyperplasia+and+gastrointestinal+stromal+tumors.">Changes in the structure and function of ICC networks in ICC hyperplasia and gastrointestinal stromal tumors.</a> Gastroenterology. 136, 630-639 (2009).</li><li>Hwang, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+anoctamin+1/TMEM16A+by+interstitial+cells+of+Cajal+is+fundamental+for+slow+wave+activity+in+gastrointestinal+muscles.">Expression of anoctamin 1/TMEM16A by interstitial cells of Cajal is fundamental for slow wave activity in gastrointestinal muscles.</a> J Physiol. 587, 4887-4904 (2009).</li><li>Gomez-Pinilla, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ano1+is+a+selective+marker+of+interstitial+cells+of+Cajal+in+the+human+and+mouse+gastrointestinal+tract.">Ano1 is a selective marker of interstitial cells of Cajal in the human and mouse gastrointestinal tract.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1370-G1381 (2009).</li><li>Sommer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+stromal+tumors+in+a+mouse+model+by+targeted+mutation+of+the+Kit+receptor+tyrosine+kinase.">Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 6706-6711 (2003).</li></ol>

Les cellules interstitielles de Cajal ont été initialement caractérisées par Santiago Ramóón y Cajal exactement un siècle, il ya des taches à l&#39;aide de méthylène chromate bleu et argent de la musculeuse digestive. Cajal abord pensé CPI ont été neurones en fonction de leurs procédés qui rappellent des axones et des dendrites. Plus de nombreuses années qui ont suivi, l&#39;étude de la biologie de la CPI a été limitée par le manque de marqueurs spécifiques jusqu&#39;à la découverte de ce kit n&#39;est pas seulement exprimée dans la CPI, mais il est également nécessaire pour leur développement 6. Depuis lors, KIT immunofluorescence a été largement utilisé dans l&#39;étude de la biologie et la CPI a également conduit à l&#39;appréciation de la CPI dans d&#39;autres organes contractiles tels que la vessie. Récemment, ANO1 a été identifié comme un marqueur de la CPI seconde fiable. Il ya eu de nombreuses publications au cours des 15 dernières années par immunofluorescence pour identifier ICC en utilisant diverses techniques de fixation de montage. Dans nos mains &quot;fixe gelé&quot; cryocoupes qui ont été précédées de paraformaldéhyde et de saccharose, d&#39;œuvres protégées par rapport aux meilleures acétone ou paraformaldéhyde post-fixation après cryosectioning. Pour les montages ensemble, nous avons constaté que la fixation acétone suivie d&#39;une dissection muqueuse donne les résultats les plus robustes. Historiquement, le ACK-2 a été l&#39;anticorps Kit de choix pour les souris de la CPI d&#39;identification. Il est un rat monoclonal qui reconnaît le domaine extracellulaire et il est également un anticorps bloquant qui provoque un iléus lorsqu&#39;il est administré à la souris vivante. Cependant, l&#39;épitope ACK-2 est lentement détruite par la fixation de paraformaldéhyde et n&#39;est pas sauvé par des méthodes standard de récupération d&#39;antigène. Nous avons constaté que l&#39;épitope ACK-4 est plus résistant à la fixation de paraformaldéhyde. Par rapport à fixée blocs congelés et des sections, des blocs de paraffine et des sections préserve la morphologie mieux et est plus favorable à l&#39;archivage à long terme (figure 4). Ni ACK ACK-2 ni-4 ont été utilisés avec succès dans des coupes en paraffine. Nous avons caractérisé cette D13A2, un anticorps monoclonal nouveau lapin, fonctionne exceptionnellement bien dans les deux sections fixes gelés et la paraffine du tractus GI. Kit est exprimé dans plusieurs autres types cellulaires, y compris les mélanocytes, les cellules hématopoïétiques, les cellules germinales, et en particulier les mastocytes, qui sont également présents dans le tractus gastro-intestinal. Heureusement, la plupart des cellules de mât sont trouvé est la muqueuse et non pas dans la musculeuse. Double coloration de lapin anti-Ano1 et de rat anti-Kit permet d&#39;éliminer non spécifiques coloration de chaque anticorps (figure 4). Il est également intéressant de noter que l&#39;expression relative de Kit et Ano1 entre sous-classes de la CPI semble différent. Par exemple, dans le petit intestin, coloration Kit est beaucoup plus intense dans myentérique CPI par rapport à la CCI du muscle en profondeur du plexus alors Ano1 coloration est comparable.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Kit de rat anti-anticorps (clone ACK-2) </td><td> eBioscience </td><td> 14-1172 </td><td> Utilisez au 2μg/ml. Épitope est perdu avec overfixation. </td></tr><tr><td> Kit de rat anti-anticorps (clone ACK-4) </td><td> Cedarlane </td><td> CL8936AP </td><td> Utilisez au 2μg/ml. </td></tr><tr><td> lapin anti-KIT anticorps (clone D13A2) </td><td> Signalisation cellulaire </td><td> 3074 </td><td> Utilisation à dilution 1:100. Seuls les anticorps énumérés ici qui fonctionne bien dans les coupes à la paraffine. </td></tr><tr><td> lapin anti-anticorps PGP9.5 </td><td> Abcam </td><td> ab10404 </td><td> Étiquettes cytoplasme de cellules neuronales. Utiles pour le marquage des neurones du plexus myentérique. Utilisation à dilution de 1:1000. </td></tr><tr><td> lapin anti-anticorps Ano1 </td><td> Abcam </td><td> ab53212 </td><td> Utilisez au 2μg/ml </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 de chèvre anti-IgG de rat </td><td> Invitrogen </td><td> A-11007 </td><td> Utilisez au 2μg/ml </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 de chèvre anti-IgG de lapin </td><td> Invitrogen </td><td> A-11008 </td><td> Utilisez au 2μg/ml </td></tr><tr><td> Needle alimentation animale </td><td> Fisher </td><td> 01-208-87 </td><td> Silicon pointe d&#39;aiguille utiles pour le rinçage tractus gastro-intestinal de souris adultes </td></tr><tr><td> Aiguille émoussée </td><td> Becton Dickison </td><td> 305180 </td><td> Aiguille émoussée utiles pour le rinçage tractus gastro-intestinal de pré-petits sevrés </td></tr><tr><td> Prolongez réactif Antifade or avec DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P-36931 </td><td> Peuvent utiliser d&#39;autres difficiles réglage du support de montage avec DAPI </td></tr><tr><td> Tissue-Tek Cryomold </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4557 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek octobre </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde 32% (10ml ampoule scellée) </td><td> EM Sciences </td><td> 15714 </td><td> Ouvrez ampoule scellée et diluer à 4% juste avant l&#39;utilisation </td></tr><tr><td> Blocage de tampon </td><td></td><td></td><td> Sérum de chèvre 5%, 0,1% de Triton X-100 dans du PBS </td></tr></tbody></table>

visualization of the interstitial cells of cajal (icc) network in mice

Les cellules interstitielles de Cajal (CIC) sont mésenchymateuses dérivées &quot;cellules pacemaker» de la gastro-intestinal (GI) qui génèrent des ondes lentes spontanées requis pour le péristaltisme et de médiation de l&#39;entrée neuronale system1 nerveux entérique. Différents sous-types de la CCI forment des réseaux distincts dans la musculeuse du tractus GI 2,3. Perte ou dommages à ces réseaux est associée à un certain nombre de troubles de la motilité 4. CPI cellules expriment la tyrosine kinase du récepteur KIT sur la membrane plasmique et KIT immunomarquage a été utilisé pour les 15 dernières années à l&#39;étiquette le réseau des CCI 5,6. Surtout, l&#39;activité normale KIT est requis pour le développement de la CPI 5,6. Transformation néoplasique des résultats des cellules de la CPI dans les tumeurs stromales gastro-intestinales (GIST), qui souvent le port de mutations KIT gain de fonction de 7,8. Nous avons récemment montré que ETV1 est un facteur de survie lignée spécifiques exprimées dans la lignée de la CPI / GIST et est un maître régulateur transcriptionnel nécessaire à la fois la formation normale du réseau de la CPI et pour la tumorigenèse de 9 GIST. Nous avons en outre démontrer qu&#39;il coopère avec des mutations activatrices KIT dans la tumorigenèse. Ici, nous décrivons les méthodes de visualisation des réseaux de la CPI sur des souris, largement basé sur les protocoles déjà publiés 10,11. Plus récemment, le canal chlorure anoctamin 1 (ANO1) a également été caractérisé comme un marqueur membranaire spécifique de la CPI 11,12. En raison de leur localisation membrane plasmique, immunofluorescence des deux protéines peut être utilisé pour visualiser les réseaux de la CPI. Ici, nous décrivons la visualisation de la CPI par les réseaux fixes et préparations surgelés cyrosections monter ensemble.

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Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

Les cellules interstitielles de Cajal (CIC) sont les cellules pacemaker de gastro-intestinal (GI). Ils forment des réseaux complexes entre les cellules musculaires lisses et de fibres post-ganglionnaires neuronales pour réguler la contractilité IG. Ici, nous présentons les méthodes d&#39;immunofluorescence transversale et l&#39;ensemble de montage de visualisation des réseaux de la CPI murin.

Visualisation des cellules interstitielles de Cajal (CIC) Réseau Souris

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

54.2K vues.  Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Les cellules interstitielles de Cajal (CIC) sont les cellules pacemaker de gastro-intestinal (GI). Ils forment des réseaux complexes entre les cellules musculaires lisses et de fibres post-ganglionnaires neuronales pour réguler la contractilité IG. Ici, nous présentons les méthodes d'immunofluorescence transversale et l'ensemble de montage de visualisation des réseaux de la CPI murin.

Vidéo: Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence microscopy. The technique is equally suited for visualization of static yeast populations, or time courses experiments up to ten hours in length. My microscopy investigates epigenetic inheritance at the silent mating loci in S. cerevisiae. There are two silent mating loci, HML and HMR, which are normally not expressed as they are packaged in heterochromatin. In the sir1 mutant background silencing is weakened such that each locus can either be in the expressed or silenced epigenetic state, so in the population as a whole there is a mix of cells of different epigenetic states for both HML and HMR. My microscopy demonstrated that there is no relationship between the epigenetic state of HML and HMR in an individual cell. sir1 cells stochastically switch epigenetic states, establishing silencing at a previously expressed locus or expressing a previously silenced locus. My time course microscopy tracked individual sir1 cells and their offspring to score the frequency of each of the four possible epigenetic switches, and thus the stability of each of the epigenetic states in sir1 cells. See also  Xu et al., Mol. Cell 2006.

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As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinisation et Repiquage des cellules de mammifères

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Freezing, Thawing, and Packaging Cells for Transport

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. It requires a number of special skills in order to be able to preserve the structure, function, behavior, and biology of the cells in culture. This video describes the basic skills required to freeze and store cells and how to recover frozen stocks. 

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. This video describes the basic skills required to freeze and store cells and how to recover frozen stocks.

Congélation, la décongélation, et les cellules d&#39;emballage pour les transports

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. It requires a number of special skills in order to be able to preserve the ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Analyse de Microarray pour Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Génération de souris dérivées de cellules souches pluripotentes induites

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Visualisation des ARNm localisés dans le réticulum endoplasmique des cellules de mammifères

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisation et d&#39;analyse de molécules d&#39;ARNm par fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Visualisation de réticulum endoplasmique sous-domaines dans les cellules cultivées

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly and fate is important to understand the cellular response to stress. The deficiency in key factors of SGs like G3BP (RasGAP SH3 domain Binding Protein) leads to developmental defects in mice&#160;and alterations of the Central Nervous System. To study the dynamics of SGs in cells from an organism, one can culture primary cells and follow the localization of a transfected tagged component of SGs. We describe time-lapse experiment to observe G3BP1-containing SGs in Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs). This technique can also be used to study G3BP-containing SGs in live neurons, which is crucial as it was recently shown that these SGs are formed at the onset of neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease. This approach can be adapted to any other cellular body and granule protein component, and performed with transgenic animals, allowing the live study of granules dynamics for example in the absence of a specific factor of these granules.

Stress granules (SGs) are cytoplasmic RNA granules containing stalled ribonucleoprotein particles (RNPs), and important in cellular response to various stresses. Dynamics of SGs can be followed in live cells by visualizing the localization of a tagged component of SGs in transfected primary cells after stress.

Visualisation de G3BP stress Granules dynamique dans les cellules primaires en direct

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...