עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לסרטן (K08CA140946, כדי י&quot;ס), (5F32CA130372, למחשב), (ו R01CA102774 R01HL055748 על PB), משרד הביטחון (PC094302 אל י&quot;ס), קרן משפחת שומן למחקר GIST (ל PC), לבין קונסורציום סרטן סטאר (למחשב, י&quot;ס, CLS ו PB). ברצוננו להודות קטיה Manova, מניפה נינג, ו Mesurh Turkekul של מתקן הגרעין MSKCC מולקולרית ציטולוגיה לעזרה עם cryosectioning ו immunostaining.

1. Dissection של העכבר בדרכי העיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעכברים מורדמים ידי הנחיות IUCAC המקומי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פין כל איבר על משטח קלקר ולשטוף פני הבטן עם אתנול 70%. פתיחת חלל הבטן עם חתך קו האמצע ארוכה הסרעפת אל חיק. בצע חתך אחד על הוושט הדיסטלית לבין חתך השני המעי הגס הדיסטלי ולהסיר את מערכת העיכול מן הקיבה אל פי הטבעת כמקשה אחת, בזהירות חיתוך הרצועות על התריסריון ו cecum באמצעות מספריים קטנים. מקום בדרכי העיכול בצלחת פטרי עם PBS. לנתח משם mesentery באמצעות פינצטה (איור 1). כדי להפריד הקיבה, המעי הדק, המעי הגס ו, לחתוך את השוער צומת ileocecal. שוטפים את לומן של כל חלק במערכת העיכול עם PBS באמצעות מזרק 5 מ&quot;ל מצורף מחט האכלה (עכברים מבוגרים) או מחט קהה (עכברים צעירים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבטן הפתוחה, המעי הדק, המעי הגס ו לאורך הגבול mesenteric. חותכים שתי חתיכות עבור כל חלק של מערכת העיכול, אחד עבור להדמיה הר שלם ואחד cryosection. </li></ol> 2. הכנה שלמות הר מדגם immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את נתח שלם של כל חלק של מערכת העיכול לתוך צינור 1.5 ס&quot;מ microfuge מלא של 1.0 מ&quot;ל אצטון קרח קר דגימות לתקן במשך שעה לפחות 1 ב 4 ° C. דוגמאות ניתן לאחסן עד 1 שבוע -20 ° C. אנחנו בדרך כלל לאחסן דגימות אצטון להמשיך להכין cyrosections. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 2X מדגם עם PBS. מניחים בצלחת פטרי מדגם עם PBS. תחת לנתח miscroscope, בזהירות לגרד שכבת הרירית עם אזמל ידי החזקת קצה אחד עם פינצטה, עוזב את muscularis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שרירים ניתן לחתוך לחתיכות 5mm עבור מכתים עם נוגדנים שונים. אין לאחסן יותר מ 2 ימים לפני PBS מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צעדים חסום הדגירה יכול להיעשות באחת היטב צלחת 24 באר או בצינור microfuge 1.5ml. בלוק עם 0.5 מ&quot;ל של חיץ חסימה (נסיוב עיזים 5%, 0.1% Triton X-100 ב PBS שעה 1 ב 4 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדן ראשוני מדולל חסימת חיץ ולסובב לילה בשעה 4 ° C. השתמשנו בהצלחה ACK-2 עכברוש אנטי קיט, ארנבת אנטי Ano1, ואנטי Pgp9.5 ארנב נוגדנים immunostaining הר שלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו במשך 5 דקות 2X עם PBS על הכתף בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדנים משני מדולל חיץ חסימת עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר על הכתף. אנו משתמשים בדרך כלל אלקסה פלואוריד 488 נגד ארנב אלקסה פלואוריד 594 אנטי עכברוש נוגדנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו במשך 15 דקות 3X עם PBS על הכתף בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר בשקופית, לצד serosal על מנת להבטיח את הכיוון של רקמות במהלך במיקרוסקופ. אוריינטציה זו תבטיח את הצד serosal להתמודד coverslip ולהיות נתקל בה לראשונה כאחד מתמקד לשקופית על מיקרוסקופ. אנו עושים זאת על מיקרוסקופ לנתח. לפעמים אנחנו בקצרה לבחון את הרקמה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי להתמצא כראוי. תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לדמיין קיט או Ano1, יש המפגש ICC-MY הרשת הראשונה מהצד של coverslip. בשלב הבא, לשאוב PBS ככל האפשר מבלי לייבש לחלוטין. הוסף 50 μl של התקשורת מוגדר קשה הרכבה (אנו משתמשים להאריך זהב) ומניחים בעדינות להחליק לכסות על גבי רקמות. אפשר הגדרה של הרכבה לילה בטמפרטורת החדר שקופיות חנות ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור בדיקה מיקרוסקופית, אנו השתמשו במיקרוסקופ שדה רחב עם Z-Drive. השתמשנו גם מטרה 20X אוויר (NA 0.75, apochromat התוכנית) או אובייקטיבי שמן 60x (NA 1.4, apochromat התוכנית) ולקח 2 מיקרומטר או 1 מיקרומטר Z-הסעיפים ההיקף muscularis כולו. התמונות היו deconvoluted לאחר מכן באמצעות תוכנת deconvolution Autoquant. לחלופין, רבים אחרים השתמשו במיקרוסקופ confocal במקום עם תוצאות דומות. </li></ol> 3. Cryosection הכנה immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל חלק של מערכת העיכול, לצד serosal למטה, שטוח על נייר הסינון. חותכים נייר לסנן סביב הרקמה. מקום הרקמה על הנייר מסנן paraformaldehyde 4% (PFA) ב-PBS (אנחנו לדלל paraformaldehyde 32% בקבוקון חתום לתוך PBS ממש לפני השימוש) למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר. קיבוע ניתן לעשות 6 - או 12 גם צלחת בהתאם לגודל של רקמות, או בצינור מ&quot;ל 1.5 microfuge. אם נעשה צלחת, parafilm כדי לצמצם את החשיפה PFA. פעמים קיבוע ארוך יותר עלול לגרום מיסוך אנטיגן, במיוחד עבור הנוגדן אנטי Kit ACK-2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של רקמה PFA ומניחים סוכרוז 30% ב-PBS. אפשר רקמות לשקוע לילה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן רקמות עם יחס של 1:01 סוכרוז 30% עבור אוקטובר 1 שעה. ואז הר רקמות אנכית cryomold מלא אוקטובר ציר האורך של מערכת העיכול צריכה להיות במקביל cyrosections. כאשר בוחנים עכברים עם גנוטיפים שונים או עם טיפולים שונים, זה עשוי להיות שימושי לעלות רקמות מעכברים שונים על cryomold אותו כדי להבטיח עיבוד מקבילי. Freeze על הקרח במקום יבש במקפיא -80 מעלות צלזיוס לאחסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור cryosections 10 מיקרומטרלשקופית ולאחסן במקפיא ב -80 מעלות צלזיוס. בדרך כלל אנחנו לחתוך לשני חלקים לכל שקופית. כמו כן, אנו בדרך כלל לבצע H &amp; E מכתים שתי שקופיות cryosection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור immunofluorescence, תחילה לאזן שקופיות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. ואז לצייר עיגול סביב רקמות באמצעות עט PAP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק עם 150 μl של חיץ חסימה (זהה עבור immunostaining הר שלם) עבור 1 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב חיץ חסימת ולהוסיף 150 נוגדן ראשוני μl מדולל חסימת חיץ דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס בתא humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 5 דקות 2X עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדנים משני מדולל חסימת חיץ עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר. אנו משתמשים בדרך כלל אלקסה 488 נגד ארנב אלקסה 594 אנטי עכברוש נוגדנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו במשך 15 דקות 3X עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב שקופיות ללא לחלוטין ייבוש רקמות. הוסף טיפה של קבוצה קשה גובר בתקשורת עם DAPI (אנו משתמשים להאריך זהב) ומקום # 1.5 coverslip. מקום להחליק בטמפרטורת החדר למשך הלילה כדי לקבוע ולאחסן במקפיא -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות פלואורסצנציה משולשת באמצעות DAPI, FITC, וטקסס האדום קובע הסינון. </li></ol> 4. נציג תוצאות: כאן, אנו משתמשים המעי הגס כדוגמה. H &amp; E כתם של סוכרוז מוגן קבוע בסעיף קפוא המשמש immunofluorescence מראה ממצאים מסוימים לעומת סעיף התייחסות פרפין (איור 2), שם הקו הצהוב מסמן מקלעת myenteric בין שכבות השריר מעגלי האורך ואת מסמן הקו הירוק את הגבול בין רירית muscularlis. בחינת cryosection, מן serosa כדי רירית, אתה הראשון המפגש שריר רזה האורך (LM) שכבת ואחריו שכבת השריר עבה עגול (CM). הסעיף צריך להיות במקביל שריר האורך כך גרעינים של LM צריך להיות מוארך מעט בעוד גרעינים של סי צריך להיות קטן ועגול. בין LM ו CM הם plexi myenteric עשויים נוירונים עם כתם Pgp9.5. Pgp9.5 גם כתמים תהליכים עצביים לאורך CM. Myenteric ICC רשת (ICC-MY) מקיפים את מקלעת myenteric והם עשויים תאים קוטבי. בתוך שכבת השריר האורך, יש נדירים ICCs תוך שרירית (IMS-ICC) שהם תאים דו קוטבית פועל במקביל השריר. בתוך שכבת השריר מעגלי, יש שפע של ICC-IMS שגם הם תאים דו קוטבית הפועלות במקביל השריר עגולים הם בחתך לחתוך עם זה. בצומת של muscularis ו submucosa, רשת submucosal ICC המורכב ICC-SMPs היא רשת שטוחה של ICCs קוטבי. בחינת ערכת הר שלם immunostaining של המעי הגס, יש לצפות במפגש ICC-MY הרשת הראשונה, ולאחר מכן את ICC-IM של CM, ואת ICC-SMP ברשתות, כמו אחד מתמקד מן coverslip (Figure. 3) . למדוד נפחית של רשתות ICC באמצעות שחזור 3D של כל הר תמונות תוארו 10. שימוש רחב בתחום מיקרוסקופ, יש הקרינה משמעותית מחוץ למטוס בתמונות הגלם אשר ניתן להסירו לאחר deconvolution (איור 3). הושלמה הפשטה של ​​רירית תגרום הקרינה רקע גבוה. ANO1 עוד סמן של ICC של ושיתוף immunostaining של קיט ANO1 מראה חפיפה מלאה של הכתמה ICC (איור 4). <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig1.jpg" alt="איור 1"/> נציג באיור 1. גזור בדרכי העיכול העכבר, והודפס מחדש באישור 13. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2.) נציג H &amp; E מכתים של המעי עכבר גדול של cryosections מוכן כמתואר ונפט התייחסות בסעיף מוטבע מראה כמה חפצים הצטמקות של cryosections. הקו הצהוב מסמן מקלעת myenteric לבין הקו הכחול המפריד בין רירית מן muscularis. ב) נציג Kit (אדום, ACK-2) ו Pgp9.5 (ירוק) immunofluorescence כפול עם counterstaining (כחול) DAPI של המעי עכבר גדול. LM: CM אורך השריר: שריר עגול. סולם בר 20 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. נציג Kit (אדום, ACK-2) כל הר immunofluorescence של אותו שדה בשלושה מטוסי מוקד, ICC-MY מטוס בגבול LM / CM, המטוס ICC-IM ב CM, ואת ICC- SMP מטוס בגבול CM / submucosa. תמונות גלם תמונות deconvoluted מוצגים. סולם בר 20 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4. הנציג פעמיים immunofluorescence של Ano1 (ירוק) קיט (אדום, ACK-2) בתוך המעי הגס. סולם בר 20 מיקרומטר.

<ol>
	<li>Sanders, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+case+for+interstitial+cells+of+Cajal+as+pacemakers+and+mediators+of+neurotransmission+in+the+gastrointestinal+tract.">A case for interstitial cells of Cajal as pacemakers and mediators of neurotransmission in the gastrointestinal tract.</a> Gastroenterology. 111, 492-515 (1996).</li><li>Ward, S. M., Sanders, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+pathophysiology+of+the+interstitial+cell+of+Cajal:+from+bench+to+bedside.+I.+Functional+development+and+plasticity+of+interstitial+cells+of+Cajal+networks.">Physiology and pathophysiology of the interstitial cell of Cajal: from bench to bedside. I. Functional development and plasticity of interstitial cells of Cajal networks.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 281, 602-611 (2001).</li><li>Komuro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+organization+of+interstitial+cells+of+Cajal+in+the+gastrointestinal+tract.">Structure and organization of interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract.</a> J Physiol. 576, 653-658 (2006).</li><li>Sanders, K. M., Ordog, T., Koh, S. D., Torihashi, S., Ward, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+plasticity+of+interstitial+cells+of+Cajal.">Development and plasticity of interstitial cells of Cajal.</a> Neurogastroenterol Motil. 11, 311-338 (1999).</li><li>Ward, S. M., Burns, A. J., Torihashi, S., Sanders, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+the+proto-oncogene+c-kit+blocks+development+of+interstitial+cells+and+electrical+rhythmicity+in+murine+intestine.">Mutation of the proto-oncogene c-kit blocks development of interstitial cells and electrical rhythmicity in murine intestine.</a> J Physiol. 480, 91-97 (1994).</li><li>Huizinga, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=W/kit+gene+required+for+interstitial+cells+of+Cajal+and+for+intestinal+pacemaker+activity.">W/kit gene required for interstitial cells of Cajal and for intestinal pacemaker activity.</a> Nature. 373, 347-349 (1995).</li><li>Rubin, B. P., Heinrich, M. C., Corless, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+stromal+tumour.">Gastrointestinal stromal tumour.</a> Lancet. 369, 1731-1741 (2007).</li><li>Hirota, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+mutations+of+c-kit+in+human+gastrointestinal+stromal+tumors.">Gain-of-function mutations of c-kit in human gastrointestinal stromal tumors.</a> Science. 279, 577-580 (1998).</li><li>Chi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ETV1+is+a+lineage-specific+survival+factor+in+Gastrointestinal+Stromal+Tumour+(GIST).">ETV1 is a lineage-specific survival factor in Gastrointestinal Stromal Tumour (GIST).</a> Nature. , (2010).</li><li>Kwon, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+structure+and+function+of+ICC+networks+in+ICC+hyperplasia+and+gastrointestinal+stromal+tumors.">Changes in the structure and function of ICC networks in ICC hyperplasia and gastrointestinal stromal tumors.</a> Gastroenterology. 136, 630-639 (2009).</li><li>Hwang, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+anoctamin+1/TMEM16A+by+interstitial+cells+of+Cajal+is+fundamental+for+slow+wave+activity+in+gastrointestinal+muscles.">Expression of anoctamin 1/TMEM16A by interstitial cells of Cajal is fundamental for slow wave activity in gastrointestinal muscles.</a> J Physiol. 587, 4887-4904 (2009).</li><li>Gomez-Pinilla, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ano1+is+a+selective+marker+of+interstitial+cells+of+Cajal+in+the+human+and+mouse+gastrointestinal+tract.">Ano1 is a selective marker of interstitial cells of Cajal in the human and mouse gastrointestinal tract.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1370-G1381 (2009).</li><li>Sommer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+stromal+tumors+in+a+mouse+model+by+targeted+mutation+of+the+Kit+receptor+tyrosine+kinase.">Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 6706-6711 (2003).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תאים ביניים של קחאל התאפיינו תחילה על ידי סנטיאגו Ramóón אי חז&#39;אל בדיוק לפני מאה שנה באמצעות כחול וכסף מתילן כרומטי כתמי muscularis העיכול. קחאל בהתחלה חשבתי ICC היו של נוירונים המבוססת על התהליכים שלהם המזכירים אקסונים דנדריטים. במהלך השנים שלאחר מכן רבים, המחקר של בית הדין הפלילי הבינלאומי ביולוגיה הוגבל על ידי חוסר סמנים ספציפיים עד גילוי KIT כי לא רק מתבטא ICC, אך נדרש גם עבור הפיתוח שלהם 6. מאז, KIT immunofluorescence כבר בשימוש נרחב במחקר של ICC ביולוגיה הובילה גם הערכה של ICC באיברים אחרים כגון התכווצות שלפוחית ​​השתן. לאחרונה, ANO1 זוהה הסמן השני ICC אמין. היו פרסומים רבים על פני 15 השנים האחרונות באמצעות immunofluorescence לזהות ICC באמצעות קיבוע שונים וטכניקות הרכבה. בידיים שלנו &quot;קבוע קפוא&quot; cryosections כי כבר ולפניה paraformaldehyde ו סוכרוז מוגן עובד בהשוואה הטובה ביותר אצטון או paraformaldehyde שלאחר קיבוע לאחר cryosectioning. עבור mounts כולו, מצאנו כי הקיבעון אצטון ואחריו לנתיחה הרירית נותן את התוצאות הכי חזקים. מבחינה היסטורית, ACK-2 כבר את ערכת נוגדן הבחירה של העכבר ICC זיהוי. זוהי חולדה חד שבטיים המכירה תחום תאי וזה גם נוגדן חסימת שגורם ileus כאשר נתון לחיות עכברים. עם זאת, epitope ACK-2 הוא נהרס לאט על ידי קיבוע paraformaldehyde ואינו חולץ על ידי שיטות אחזור תקן אנטיגן. מצאנו כי epitope ACK-4 עמיד יותר קיבעון paraformaldehyde. לעומת בלוקים קפואים סעיפים קבועים, בלוקים פרפין מוטבע וחתכים משמר מורפולוגיה טוב יותר הוא נוח יותר לטווח ארוך אחסון (איור 4). לא ACK-2 ולא ACK-4 שימשו בהצלחה בסעיפים פרפין. יש לנו מאופיין כי D13A2, נוגדן חד שבטי ארנב חדש, עובד מצוין בשני חלקים קבועה קפוא פרפין של מערכת העיכול. ערכת מתבטא בכמה סוגי תאים אחרים, ובהם המלנוציטים, תאים hematopoietic, בתאי הנבט, וכן תא הפיטום מסוים אשר נמצאים גם במערכת העיכול. למרבה המזל, תא הפיטום ביותר נמצאים היא רירית ולא muscularis. צביעה כפולה עם ארנבת אנטי Ano1 ואת עכברוש אנטי ערכת יכולים לחסל הלא ספציפית של נוגדן כל מכתים (איור 4). זה גם ראוי לציין כי את הביטוי היחסי של קיט Ano1 בין subclasses של ICC נראה שונה. לדוגמה, במעי הדק, מכתים קיט היא הרבה יותר אינטנסיבי בכאל myenteric לעומת ICC של השריר מקלעת עמוק בעוד Ano1 מכתים דומה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> אנטי קיט נוגדנים חולדה (שיבוט ACK-2) </td><td> eBioscience </td><td> 14-1172 </td><td> השתמש ב 2μg/ml. Epitope אבד עם overfixation. </td></tr><tr><td> אנטי קיט נוגדנים חולדה (שיבוט ACK-4) </td><td> Cedarlane </td><td> CL8936AP </td><td> השתמש ב 2μg/ml. </td></tr><tr><td> ארנב נגד KIT נוגדן (שיבוט D13A2) </td><td> תא האיתות </td><td> 3074 </td><td> השתמש ב דילול 1:100. נוגדן רק המפורטים כאן עובד היטב בסעיפים פרפין. </td></tr><tr><td> ארנב נגד Pgp9.5 נוגדן </td><td> Abcam </td><td> ab10404 </td><td> תוויות תאים עצביים בציטופלסמה. שימושי לסימון נוירונים של מקלעת myenteric. השתמש בדילול 1:1000. </td></tr><tr><td> ארנב נגד Ano1 נוגדן </td><td> Abcam </td><td> ab53212 </td><td> השתמש ב 2μg/ml </td></tr><tr><td> אלקסה פלואוריד 594 אנטי עכברוש עז IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A-11007 </td><td> השתמש ב 2μg/ml </td></tr><tr><td> אלקסה פלואוריד 488 נגד ארנב עז IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A-11008 </td><td> השתמש ב 2μg/ml </td></tr><tr><td> האכלת בעלי חיים מחט </td><td> דיג </td><td> 01-208-87 </td><td> הסיליקון נוטה מחט שימושי הסמקה מערכת העיכול של עכברים בוגרים </td></tr><tr><td> בלאנט מחט </td><td> בקטון Dickison </td><td> 305180 </td><td> מחט בלאנט שימושי עבור שטיפה של מערכת העיכול להיגמל מראש גורים </td></tr><tr><td> להאריך מגיב antifade זהב עם DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P-36931 </td><td> מאי להשתמש חלופה קשה הגדרת התקשורת הרכבה עם DAPI </td></tr><tr><td> רקמות-Tek Cryomold </td><td> רקמות-Tek </td><td> 4557 </td><td></td></tr><tr><td> רקמות-Tek אוקטובר </td><td> רקמות-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde 32% (אמפולה 10ml אטום) </td><td> EM למדעים </td><td> 15714 </td><td> אמפולה חתום פתח לדלל עד 4% רק לפני השימוש </td></tr><tr><td> חסימת חיץ </td><td></td><td></td><td> סרום עיזים 5%, 0.1% Triton X-100 ב PBS </td></tr></tbody></table>

visualization of the interstitial cells of cajal (icc) network in mice

התאים ביניים של קחאל (ICC) הם mesenchymal נגזר &quot;תאים קוצב לב&quot; בדרכי (GI) במערכת העיכול שיוצרים גלים איטיים ספונטנית נדרש תנועה פריסטלטית לתווך קלט עצבי מ system1 העצבים enteric. תת שונים של ICC טופס רשתות נפרדות muscularis של מערכת העיכול 2,3. אובדן או פציעה של רשתות אלה קשורה עם מספר רב של הפרעות תנועתיות 4. תאים ICC לבטא את הקולטן KIT טירוזין קינאז על הממברנה פלזמה KIT immunostaining שימש במשך 15 השנים האחרונות לתווית רשת ICC 5,6. חשוב לציין, הפעילות KIT נורמלי נדרש ICC פיתוח 5,6. שינוי Neoplastic של ICC תוצאות תאים סרטניים סטרומה העיכול (GIST), כי לעתים קרובות הנמל רווח של פונקציה מוטציות KIT 7,8. אנחנו לאחרונה הראה כי ETV1 הוא גורם השושלת הישרדות ספציפית לידי ביטוי בשושלת ICC / GIST והוא רגולטור תעתיק הנדרש להיווצרות הן ICC נורמלי עבור רשת של tumorigenesis GIST 9. בנוסף, אנו להוכיח שהיא משתפת פעולה עם הפעלת מוטציות KIT ב tumorigenesis. כאן אנו מתארים שיטות הדמיה של רשתות ICC בעכברים, המבוססת בעיקרה על הפרוטוקולים שפורסמו בעבר 10,11. לאחרונה, ערוץ כלוריד anoctamin 1 (ANO1) יש גם מאופיין כסמן קרום מסוים של ICC 11,12. בגלל לוקליזציה שלהן פלזמה הממברנה, immunofluorescence של חלבונים גם יכול לשמש כדי להמחיש את רשתות ICC. כאן אנו מתארים להדמיה של רשתות ICC ידי קבועה קפוא cyrosections וההכנות הר שלם.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice at JoVE.com

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

התאים ביניים של קחאל (ICC) הם תאים של מערכת קוצב לב (GI) במערכת העיכול. הם יוצרים רשתות מורכבות בין לתאי שריר חלק ופוסט ganglionic סיבים עצביים להסדיר contractility העיכול. כאן, אנו מציגים שיטות immunofluorescence חתך שלם הר ויזואליזציה של Murine רשתות ICC.

ויזואליזציה של תאים ביניים של רשת (ICC) קחאל ב עכברים

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

visualization-of-the-interstitial-cells-of-cajal-icc-network-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

54.0K Views.  Memorial Sloan Kettering Cancer Center. התאים ביניים של קחאל (ICC) הם תאים של מערכת קוצב לב (GI) במערכת העיכול. הם יוצרים רשתות מורכבות בין לתאי שריר חלק ופוסט ganglionic סיבים עצביים להסדיר contractility העיכול. כאן, אנו מציגים שיטות immunofluorescence חתך שלם הר ויזואליזציה של Murine רשתות ICC.

Video: Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence microscopy. The technique is equally suited for visualization of static yeast populations, or time courses experiments up to ten hours in length. My microscopy investigates epigenetic inheritance at the silent mating loci in S. cerevisiae. There are two silent mating loci, HML and HMR, which are normally not expressed as they are packaged in heterochromatin. In the sir1 mutant background silencing is weakened such that each locus can either be in the expressed or silenced epigenetic state, so in the population as a whole there is a mix of cells of different epigenetic states for both HML and HMR. My microscopy demonstrated that there is no relationship between the epigenetic state of HML and HMR in an individual cell. sir1 cells stochastically switch epigenetic states, establishing silencing at a previously expressed locus or expressing a previously silenced locus. My time course microscopy tracked individual sir1 cells and their offspring to score the frequency of each of the four possible epigenetic switches, and thus the stability of each of the epigenetic states in sir1 cells. See also  Xu et al., Mol. Cell 2006.

A rapid technique for the visualization of growing immobilized yeast cells, here applied to fluorescent reporters at the silent mating loci HML and HMR

טכניקה מהירה עבור ויזואליזציה של תאים חיים שמרים ללא יכולת לזוז

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence ...

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

ספירת ועל קביעת הכדאיות של תאים בתרבית

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinizing ו Subculturing בתאי יונקים

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Freezing, Thawing, and Packaging Cells for Transport

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. It requires a number of special skills in order to be able to preserve the structure, function, behavior, and biology of the cells in culture. This video describes the basic skills required to freeze and store cells and how to recover frozen stocks. 

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. This video describes the basic skills required to freeze and store cells and how to recover frozen stocks.

הקפאה, הפשרה, ותאי אריזות התחבורה

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. It requires a number of special skills in order to be able to preserve the ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

ויזואליזציה של mRNAs לוקליזציה reticulum endoplasmic בתאי יונקים

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

ויזואליזציה של תחומי משנה reticulum endoplasmic בתאים בתרבית

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly and fate is important to understand the cellular response to stress. The deficiency in key factors of SGs like G3BP (RasGAP SH3 domain Binding Protein) leads to developmental defects in mice&#160;and alterations of the Central Nervous System. To study the dynamics of SGs in cells from an organism, one can culture primary cells and follow the localization of a transfected tagged component of SGs. We describe time-lapse experiment to observe G3BP1-containing SGs in Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs). This technique can also be used to study G3BP-containing SGs in live neurons, which is crucial as it was recently shown that these SGs are formed at the onset of neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease. This approach can be adapted to any other cellular body and granule protein component, and performed with transgenic animals, allowing the live study of granules dynamics for example in the absence of a specific factor of these granules.

Stress granules (SGs) are cytoplasmic RNA granules containing stalled ribonucleoprotein particles (RNPs), and important in cellular response to various stresses. Dynamics of SGs can be followed in live cells by visualizing the localization of a tagged component of SGs in transfected primary cells after stress.

ויזואליזציה של מתח G3BP גרגרי Dynamics בראשי תאים בשידור חי

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...