Bu çalışma, Ulusal Kanser Enstitüsü (K08CA140946, SK), (5F32CA130372, PC için), (R01CA102774 ve PB R01HL055748), Savunma Bakanlığı (YC etmek PC094302), GİST Araştırma Shuman Aile Fonu (için tarafından desteklenen PC) ve Starr Kanser Konsorsiyumu (PC, YC, CLS ve PB). Biz, Katia Manova, Ning Fan ve MSKCC Moleküler Sitoloji çekirdek tesisin Mesurh Türkekul cryosectioning ve immün yardım için teşekkür etmek istiyorum.

1. Fare GI kanalda diseksiyonu <ol><li> Yerel IUCAC kurallar tarafından ötenazi farelerde </li><li> Strafor yüzeyinde her uzuv Pin karın yüzeyi ve% 70 etanol ile yıkayın. Diyafram pubis uzun orta hat kesi ile karın boşluğuna açın. Bir distal kalın bağırsağın distal özefagus ve ikinci bir kesme kesme ve blok tr mide anüs gastrointestinal sistem kaldırmak, küçük bir makas kullanarak duodenum ve çekum dikkatlice ligamentler kesme olun. PBS ile bir petri kabına yerleştirin GI sistem. Cımbız (Şekil 1) kullanarak mezenter parçalara ayır. Mide, ince bağırsak, kalın bağırsak, pyloru ve ileoçekal bileşke kesme ayırmak için. Her bir parçası bir beslenme iğne (eski fareler) veya künt bir iğne (genç fareler) bağlı bir 5ml şırınga kullanarak PBS ile gastrointestinal sistem lümeni durulayın. </li><li> Mezenterik sınırı boyunca aç mide, ince bağırsak ve kalın bağırsak. GI yolu her bölümü için, tüm montaj görünüm için tek ve cryosection için bir iki parça kesin. </li></ol> 2. Tüm montaj numune hazırlama ve immün <ol><li> GI kanalda her bir parçası, 4 en az 1 saat için 1.0 ml buz gibi aseton ve düzeltme örnekleri ile dolu bir 1,5 cm mikrofuge&#39;de tüp ° C tüm parça yerleştirin. Numuneler -20 ° C&#39;de 1 hafta kadar saklanabilir Biz genellikle aseton örnekleri saklamak ve cyrosections hazırlamak geçin. </li><li> PBS ile örnek 2X yıkayın. PBS ile petri kabına yerleştirin örneği. Miscroscope diseksiyon altında muskularis bırakarak, bir cımbız ile bir ucunu tutarak dikkatle mukoza tabakası bir neşter ile kazıyın. </li><li> Kas farklı antikorlar ile boyanarak 5mm parçalar halinde kesilebilir. Boyama önce PBS içinde 2 günden fazla saklamayın. </li><li> Blok ve inkübasyon adımları iyi bir 24 plaka veya bir 1.5ml mikrofuge&#39;de tüp yapılabilir. Engelleme tampon 0.5 ml (% 5 keçi serumu,% 0,1 Triton az 1 saat 4 PBS X-100 ° C) Blok. </li><li> Tampon engelleme seyreltilmiş primer antikor ile inkübe ve 4 gece döndürmek ° C Biz anti-Kiti ACK-2 sıçan, tavşan anti-Ano1 ve tüm montaj immün tavşan anti-Pgp9.5 antikorlar başarıyla kullanmıştır. </li><li> PBS ile 5 dk 2X için oda sıcaklığında rotator yıkayın. </li><li> Rotator oda sıcaklığında 2 saat süreyle bloke tampon seyreltilmiş ikincil antikor ile inkübe edin. Biz genellikle Alexa Fluor 488 anti-tavşan ve Alexa Fluor 594 anti-fare antikorları kullanın. </li><li> Oda sıcaklığında rotator 3X PBS ile 15 dakika yıkayınız. </li><li> Mikroskopi sırasında doku yönlendirmesini sağlamak için üst slayt, serozal tarafında monte edin. Bu yönelim, lamel yüz ve bir mikroskop, slayt içine odaklanır gibi ilk karşılaşılan serozal tarafında sağlayacaktır. Biz bunu bir diseksiyon mikroskobu. Bazen, kısaca düzgün şark floresan mikroskobu altında dokuyu inceler. Kit veya Ano1 görselleştirmek için floresan mikroskobu altında, bir lamel yan ilk ICC-MY ağ karşılaşmazsınız. Sonra, aspirat PBS mümkün olduğunca olmadan tamamen kurutulması. Sabit montaj seti medya (Altın Prolong kullandığınız) 50 ul ekleyin ve doku üstüne kapak kayma yavaşça yerleştirin. -80 Gece boyunca oda sıcaklığında ve mağaza slaytlar montaj ver ayarı ° C </li><li> Mikroskobik inceleme için, Z-sürücü ile geniş bir alan mikroskobu kullanıldı. Biz ya 20X hava bir objektif (NA 0.75, planı apochromat) veya 60X yağlı objektif (NA 1.4, planı apochromat) ve 2 mm veya tüm muskularis yayılan Z kesitler 1 mikron aldı. Görüntüler daha sonra AutoQUANT deconvolution yazılımı kullanarak deconvoluted. Alternatif olarak, diğerleri benzer sonuçlar yerine konfokal mikroskobi kullandık. </li></ol> 3. Cryosection hazırlanması ve immün <ol><li> Filtre kağıdı düz aşağı GI yolu, serozal tarafında, her bir parçası yerleştirin. Doku çevresindeki filtre kağıdı kesin. Oda sıcaklığında 2 saat süreyle PBS (% 32 kullanmadan önce doğru PBS içine kapalı flakon paraformaldehid sulandırmak)% 4 paraformaldehid (PFA) filtre kağıdı üzerine koyun doku. Veya doku büyüklüğüne bağlı olarak 12 plaka, 1.5 ml mikrofuge&#39;de tüp Fixation 6 yapılabilir yapabilirsiniz. Plakasını yapılırsa, parafilm PFA maruziyeti en aza indirmek için. Daha uzun fiksasyon kez, özellikle de anti-Kiti ACK-2 antikor, antijen maskeleme neden olabilir. </li><li> PBS içinde% 30 sakaroz PFA doku ve yer çıkarın. İzin doku 4 gece lavaboya ° C </li><li> 1 saat süreyle% 30 sükroz ve OCT 1:1 oranında doku dengelenmesi. Sonra GI sistem boylamasına ekseni cyrosections paralel olmalıdır OCT ile dolu cryomold dikey doku monte edin. Farklı genotipleri ile veya farklı tedaviler ile fareler incelendiğinde, paralel işlem sağlamak için aynı cryomold üzerine farklı farelerde doku monte etmek için yararlı olabilir. Kuru buz ve yer saklama için -80 ° C derin dondurucuda dondurun. </li><li> 10 mikron cryosections Kes-80 ° C derin dondurucu slayt ve mağaza üzerine. Biz genellikle iki bölümden slayt başına kesti. Ayrıca genellikle bir cryosection slayt H &amp; E boyama gerçekleştirin. </li><li> Immünofloresan için, ilk 15 dakika boyunca oda sıcaklığında slayt dengelenmesi. Sonra PAP kalem kullanarak doku etrafında bir daire çizin. </li><li> 1 saat süreyle bloke tampon (bütün monte immün aynı) 150 ul engelleyin. </li><li> Aspire engelleme tampon ve tampon engelleme seyreltilmiş 150 ul primer antikor ekleyin ve 4 gece inkübe ° C nemlendirilmiş bir odasında. </li><li> PBS ile 5 dk 2X yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 2 saat tampon engelleme seyreltilmiş ikincil antikor ile inkübe edin. Biz genellikle Alexa 488 anti-tavşan ve Alexa 594 anti-fare antikorları kullanın. </li><li> 3X PBS ile 15 dakika süreyle yıkayın. </li><li> Doku tamamen kuruyan olmadan slayt aspire. DAPI (Altın Prolong kullandığınız) # 1.5 lamel ile medya montaj sert kümesinin bir damla ekleyin. Gecelik oda sıcaklığı -80 ° C derin dondurucuda kurulum ve saklama yeri slayt. </li><li> DAPI, FITC, ve Texas Red filtre setleri kullanılarak üçlü floresan görüntüler elde. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Burada, biz, bir örnek olarak kalın bağırsak kullanır. H &amp; E sukroz leke immünofloresan için kullanılan dondurulmuş bölümünde sabit korunan bazı eserler bir referans parafin bölüm (Şekil 2), gösterir nerede dairesel ve uzunlamasına kas tabakaları ve yeşil hat demarks arasında sarı çizginin demarks myenterik pleksus arasındaki sınır mukoza ve muscularlis. Seroza mukoza cryosection incelenmesi, ilk olarak kalın yuvarlak kas (CM) tabakası tarafından takip uzunlamasına ince kas (LM) katmanı karşılaşıyoruz. CM çekirdeklerin, küçük ve yuvarlak olmalıdır LM çekirdekleri biraz uzun olmalı, böylece bölüm uzunlamasına kas ile paralel olmalıdır. LM ve CM arasında Pgp9.5 ile leke nöronlar yapılan myenterik pleksi. CM boyunca Pgp9.5 lekeleri nöronal süreçleri. Myenterik ICC ağ (ICC-MY) myenterik pleksus çevreleyen ve çok kutuplu hücreler yapılır. Longitudinal kas tabakasının içinde, bipolar hücreleri kas ile paralel olarak çalışan nadir intramüsküler ICCS (ICC-IM) vardır. Sirküler kas tabakası içinde de dairesel bir kas ile paralel ve bu kesim kesitli bipolar hücreleri olan ICC-IMs bol vardır. ICC-TPF oluşan submukozal ICC ağ muskularis ve submukoza kavşağında, düz, çok kutuplu ICCS bir ağdır. Lamel odaklanır gibi kalın bağırsak immün bütün montaj Kiti incelenmesi, bir (Figure. 3), CM ICC-IM ve ICC-SMP ağları sonra ICC-MY ağ ilk karşılaşmaya bekliyoruz. . Tüm montaj görüntüler 3 boyutlu rekonstrüksiyon kullanarak ICC ağları Volumetrik ölçüsü 10 tarif edilmiştir. Geniş alan mikroskobu kullanarak, önemli bir düzlem-dışı floresan deconvolution sonra kaldırılır (Şekil 3) ham görüntüleri var. Mukoza sıyırma Eksik yüksek eşiğe neden olacaktır. ANO1 başka bir ICC&#39;nin marker ve co-immün KİT ve ANO1 ICC boyama (Şekil 4) tam bir örtüşme gösterir. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. Temsilcisi izni 13 ile yeniden basıldı, fare gastrointestinal sistem disseke. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2 A) Temsilcisi H &amp; E boyama cryosections bazı büzülme eserler gösteren bölümünde anlatıldığı ve referans parafin hazırlanmış cryosections fare kalın bağırsak. Sarı hat demarks myenterik pleksus ve mavi çizgi, muskularis mukoza ayırır. B) Temsilcisi Kit (kırmızı, ACK-2) ve Pgp9.5 (yeşil) fare kalın bağırsak DAPI (mavi) counterstaining ile çift immünofloresan. LM: uzunlamasına kas CM: dairesel kas. Ölçek çubuğu 20 mm. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3 Temsilci Kiti (kırmızı, ACK-2) tüm montaj üç odak düzlemleri aynı alanda immünofloresan, ICC-MY LM / CM sınırında uçak, CM ICC-IM uçak ve ICC- CM / submukozaya sınırda SMP düzlemi. Ham görüntüleri ve deconvoluted görüntüleri gösterilmiştir. Ölçek çubuğu 20 mm. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig4.jpg" alt="Şekil 4"/> Şekil 4 Ano1 (yeşil) ve kalın bağırsak Kiti (kırmızı, ACK-2) Temsilcisi çift immünofloresan. Ölçek çubuğu 20 mm.

<ol>
	<li>Sanders, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+case+for+interstitial+cells+of+Cajal+as+pacemakers+and+mediators+of+neurotransmission+in+the+gastrointestinal+tract.">A case for interstitial cells of Cajal as pacemakers and mediators of neurotransmission in the gastrointestinal tract.</a> Gastroenterology. 111, 492-515 (1996).</li><li>Ward, S. M., Sanders, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+pathophysiology+of+the+interstitial+cell+of+Cajal:+from+bench+to+bedside.+I.+Functional+development+and+plasticity+of+interstitial+cells+of+Cajal+networks.">Physiology and pathophysiology of the interstitial cell of Cajal: from bench to bedside. I. Functional development and plasticity of interstitial cells of Cajal networks.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 281, 602-611 (2001).</li><li>Komuro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+organization+of+interstitial+cells+of+Cajal+in+the+gastrointestinal+tract.">Structure and organization of interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract.</a> J Physiol. 576, 653-658 (2006).</li><li>Sanders, K. M., Ordog, T., Koh, S. D., Torihashi, S., Ward, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+plasticity+of+interstitial+cells+of+Cajal.">Development and plasticity of interstitial cells of Cajal.</a> Neurogastroenterol Motil. 11, 311-338 (1999).</li><li>Ward, S. M., Burns, A. J., Torihashi, S., Sanders, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+the+proto-oncogene+c-kit+blocks+development+of+interstitial+cells+and+electrical+rhythmicity+in+murine+intestine.">Mutation of the proto-oncogene c-kit blocks development of interstitial cells and electrical rhythmicity in murine intestine.</a> J Physiol. 480, 91-97 (1994).</li><li>Huizinga, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=W/kit+gene+required+for+interstitial+cells+of+Cajal+and+for+intestinal+pacemaker+activity.">W/kit gene required for interstitial cells of Cajal and for intestinal pacemaker activity.</a> Nature. 373, 347-349 (1995).</li><li>Rubin, B. P., Heinrich, M. C., Corless, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+stromal+tumour.">Gastrointestinal stromal tumour.</a> Lancet. 369, 1731-1741 (2007).</li><li>Hirota, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+mutations+of+c-kit+in+human+gastrointestinal+stromal+tumors.">Gain-of-function mutations of c-kit in human gastrointestinal stromal tumors.</a> Science. 279, 577-580 (1998).</li><li>Chi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ETV1+is+a+lineage-specific+survival+factor+in+Gastrointestinal+Stromal+Tumour+(GIST).">ETV1 is a lineage-specific survival factor in Gastrointestinal Stromal Tumour (GIST).</a> Nature. , (2010).</li><li>Kwon, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+structure+and+function+of+ICC+networks+in+ICC+hyperplasia+and+gastrointestinal+stromal+tumors.">Changes in the structure and function of ICC networks in ICC hyperplasia and gastrointestinal stromal tumors.</a> Gastroenterology. 136, 630-639 (2009).</li><li>Hwang, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+anoctamin+1/TMEM16A+by+interstitial+cells+of+Cajal+is+fundamental+for+slow+wave+activity+in+gastrointestinal+muscles.">Expression of anoctamin 1/TMEM16A by interstitial cells of Cajal is fundamental for slow wave activity in gastrointestinal muscles.</a> J Physiol. 587, 4887-4904 (2009).</li><li>Gomez-Pinilla, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ano1+is+a+selective+marker+of+interstitial+cells+of+Cajal+in+the+human+and+mouse+gastrointestinal+tract.">Ano1 is a selective marker of interstitial cells of Cajal in the human and mouse gastrointestinal tract.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1370-G1381 (2009).</li><li>Sommer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+stromal+tumors+in+a+mouse+model+by+targeted+mutation+of+the+Kit+receptor+tyrosine+kinase.">Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 6706-6711 (2003).</li></ol>

Cajal İnterstisyel hücreler başlangıçta gastrointestinal muskularis metilen mavisi ve gümüş kromat lekeleri kullanarak tam bir asır önce, Santiago Ramóón y Cajal ile karakterize edilmiştir. Cajal başlangıçta ICC&#39;nin nöronların akson ve dendritler anımsatan süreçlerini tabanlı düşündüm. Birçok izleyen yıl içinde, ICC biyoloji çalışma, bu KIT bir keşif değil sadece ICC ifade kadar spesifik belirteçler eksikliği tarafından sınırlı, ancak aynı zamanda onların gelişimi 6 için gereklidir. O zamandan beri, KIT immünofloresan ICC biyoloji çalışmada, yaygın olarak kullanılan ve aynı zamanda, mesane gibi diğer kontraktil organlarda ICC beğenisine yol açmıştır. Son zamanlarda, ANO1 ikinci bir güvenilir ICC belirteci olarak tespit edilmiştir. Immünofloresan kullanarak çeşitli sabitleme ve montaj teknikleri kullanarak ICC tanımlamak için son 15 yılda pek çok yayın olmuştur. Paraformaldehid ve korunan sakaroz öneki ile bizim elimizde &quot;sabit donmuş&quot; cryosections cryosectioning sonra aseton veya fiksasyonu sonrası paraformaldehid göre çalışır. Bütün bağlar için, mukozal diseksiyon aseton tespiti en sağlam sonuçlar veren bulduk. Tarihsel olarak, ACK-2 fare ICC kimlik için tercih edilen Kit antikor olmuştur. Ekstrasellüler etki tanıyan monoklonal bir sıçan ve fareler yaşamak verildiğinde ileus neden olan bir engelleme antikordur. Ancak, ACK-2 epitop paraformaldehid fiksasyon tarafından yavaş yavaş tahrip ve standart antijen alma yöntemleri ile kurtarıldı. ACK-4 epitop paraformaldehid fiksasyon daha dirençli olduğunu buldular. Morfolojisi sabit dondurulmuş blok ve bölümleri, parafin blok ve bölümler ile karşılaştırıldığında daha iyi korur ve uzun süreli arşivleme (Şekil 4) daha yumuşak. ACK-2 ya da ACK-4 ne kesitler başarıyla kullanılmaktadır. Biz, yeni bir tavşan monoklonal antikor, D13A2 GI sistem hem sabit dondurulmuş ve parafin bölümlerde son derece iyi çalıştığını karakterize var. Kit, GI yolu da bulunan melanosit, hematopoetik hücreler, germ hücreleri, ve özellikle mast hücreleri de dahil olmak üzere diğer birçok hücre tipleri, ifade edilir. Neyse ki, en mast hücreleri, muskularis mukoza ve bulunur. Çift boyama tavşan anti-Ano1 ve sıçan anti-Kit her antikor non-spesifik boyanması (Şekil 4) ortadan kaldırabilir. Ayrıca Kit ve Ano1 ICC alt sınıfları arasında göreceli bir ifade farklı görünüyor fazlalaştı. Örneğin, küçük bağırsak, Kit boyama Ano1 boyama karşılaştırılabilir ise derin kas pleksus ICC kıyasla çok daha yoğun myenterik ICC.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> rat anti-Kit antikor (klon ACK-2) </td><td> eBioscience </td><td> 14-1172 </td><td> 2μg/ml az kullanın. Epitopu overfixation kaybolur. </td></tr><tr><td> rat anti-Kit antikor (klon ACK-4) </td><td> Cedarlane </td><td> CL8936AP </td><td> 2μg/ml az kullanın. </td></tr><tr><td> tavşan anti-KIT antikor (klon D13A2) </td><td> Hücre Sinyalizasyonu </td><td> 3074 </td><td> 1:100 dilüsyon kullanın. Sadece antikor parafin bölümlerde iyi çalıştığını burada listelenir. </td></tr><tr><td> tavşan anti-Pgp9.5 antikor </td><td> Abcam </td><td> ab10404 </td><td> Etiket nöronal hücre sitoplazma. Myenterik pleksus nöronlar işaretlemek için kullanışlıdır. 1:1000 dilüsyon kullanın. </td></tr><tr><td> tavşan anti-Ano1 antikor </td><td> Abcam </td><td> ab53212 </td><td> 2μg/ml az kullanın </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 keçi anti-sıçan IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A-11007 </td><td> 2μg/ml az kullanın </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 keçi anti-tavşan IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A-11008 </td><td> 2μg/ml az kullanın </td></tr><tr><td> Hayvan Besleme İğne </td><td> Balıkçı </td><td> 01-208-87 </td><td> Silikon yetişkin farelerin gastrointestinal sistem kızarma için iğne uçlu yararlı </td></tr><tr><td> Blunt İğne </td><td> Becton Dickison </td><td> 305180 </td><td> Blunt iğne ön sütten kesilen yavrular GI sistem kızarma için yararlı </td></tr><tr><td> DAPI Altın antifade reaktif uzatmak </td><td> Invitrogen </td><td> P-36931 </td><td> DAPI ile alternatif sabit ayar montaj medya kullanabilir miyim </td></tr><tr><td> Doku-Tek Cryomold </td><td> Doku-Tek </td><td> 4557 </td><td></td></tr><tr><td> Doku-Tek Ekim </td><td> Doku-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> % 32 Paraformaldehit (10ml kapalı ampul) </td><td> EM Bilimler </td><td> 15714 </td><td> Açık kapalı ampul ve kullanmadan hemen önce sulandırmak için% 4 </td></tr><tr><td> Tampon Engelleme </td><td></td><td></td><td> % 5 keçi serumu,% 0.1 PBS içinde Triton X-100 </td></tr></tbody></table>

visualization of the interstitial cells of cajal (icc) network in mice

Cajal interstisyel hücreler (ICC) peristaltizm için gerekli kendiliğinden yavaş dalgalar oluşturur ve nöronal giriş enterik sinir sistemi1 arabuluculuk gastrointestinal (Gİ) sistem mezenkimal elde edilen &quot;kalp pili hücreleri&quot;. GI yolu 2,3 muskularis ICC farklı alt tiplerinin farklı ağlar oluşturur. Bu ağlara kaybı veya yaralanma motilite bozuklukları 4 sayı ile ilişkilidir. ICC hücreleri immün ICC ağ 5,6 etiketlemek için son 15 yıldır kullanılan plazma membran ve KIT KIT reseptör tirozin kinaz ifade eder. Daha da önemlisi, normal KIT aktivite, ICC geliştirme 5,6 için gereklidir . Sık sık fonksiyon kazanç-KIT mutasyonları 7,8 limanı ICC hücreleri gastrointestinal stromal tümör (GİST), neoplastik dönüşüm . Biz son zamanlarda ETV1 ICC / GİST soy ifade bir soy-spesifik sağkalım faktörü olup, normal ICC ağ oluşumu hem de ve GİST tümörogenez 9 için gerekli bir ana transkripsiyonel regülatör olduğunu gösterdi . Biz daha KIT mutasyonları tümörigenezinde aktive işbirliği halinde olduğunu göstermektedir. Burada, farelerde ICC ağları görüntüleme yöntemleri, büyük ölçüde, daha önce yayınlanan protokolleri 10,11 açıklar . Daha yakın zamanlarda, klorür kanal anoctamin 1 (ANO1) ICC 11,12 belirli bir membran belirteci olarak karakterize edilmiştir. Çünkü plazma membran lokalizasyonu, hem proteinlerin immünofloresan ICC ağları görselleştirmek için kullanılabilir. Burada, sabit dondurulmuş cyrosections ve tüm montaj hazırlıkları ICC şebekeleri görselleştirme açıklar.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice at JoVE.com

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

Cajal interstisyel hücreler (ICC), gastrointestinal (Gİ) sistem kalp pili hücreleri. Bunlar, düz kas hücreleri ve gastrointestinal kontraktilite düzenlemek için post-ganglion nöronal liflerdir arasındaki karmaşık ağları oluşturmaktadır. Burada, immünofloresan kesitsel yöntemler ve fare ICC ağlarının bütün montaj görselleştirme sunuyoruz.

Farelerde Cajal (ICC) Ağ İnterstisyel Hücreler Görselleştirme

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

visualization-of-the-interstitial-cells-of-cajal-icc-network-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

54.2K Görüntüleme.  Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Cajal interstisyel hücreler (ICC), gastrointestinal (Gİ) sistem kalp pili hücreleri. Bunlar, düz kas hücreleri ve gastrointestinal kontraktilite düzenlemek için post-ganglion nöronal liflerdir arasındaki karmaşık ağları oluşturmaktadır. Burada, immünofloresan kesitsel yöntemler ve fare ICC ağlarının bütün montaj görselleştirme sunuyoruz.

Video: Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence microscopy. The technique is equally suited for visualization of static yeast populations, or time courses experiments up to ten hours in length. My microscopy investigates epigenetic inheritance at the silent mating loci in S. cerevisiae. There are two silent mating loci, HML and HMR, which are normally not expressed as they are packaged in heterochromatin. In the sir1 mutant background silencing is weakened such that each locus can either be in the expressed or silenced epigenetic state, so in the population as a whole there is a mix of cells of different epigenetic states for both HML and HMR. My microscopy demonstrated that there is no relationship between the epigenetic state of HML and HMR in an individual cell. sir1 cells stochastically switch epigenetic states, establishing silencing at a previously expressed locus or expressing a previously silenced locus. My time course microscopy tracked individual sir1 cells and their offspring to score the frequency of each of the four possible epigenetic switches, and thus the stability of each of the epigenetic states in sir1 cells. See also  Xu et al., Mol. Cell 2006.

A rapid technique for the visualization of growing immobilized yeast cells, here applied to fluorescent reporters at the silent mating loci HML and HMR

Canlı İmmobilize Maya Hücreleri Görselleştirme Hızlı Tekniği

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence ...

Biyoloji

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

Doku ve Hücre Sayım ve Canlılık Belirlenmesi

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Memeli Hücreleri Trypsinizing ve alt kültüre

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Freezing, Thawing, and Packaging Cells for Transport

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. It requires a number of special skills in order to be able to preserve the structure, function, behavior, and biology of the cells in culture. This video describes the basic skills required to freeze and store cells and how to recover frozen stocks. 

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. This video describes the basic skills required to freeze and store cells and how to recover frozen stocks.

Donma Çözülme ve Ulaştırma Ambalaj Hücreler

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. It requires a number of special skills in order to be able to preserve the ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Mikroarray Analizi için Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Memeli hücrelerinde endoplazmik retikulum lokalize mRNA&#39;ların görselleştirilmesi

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Kültür Hücrelerinin retikulum Subdomain&#39;ler Görselleştirme

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly and fate is important to understand the cellular response to stress. The deficiency in key factors of SGs like G3BP (RasGAP SH3 domain Binding Protein) leads to developmental defects in mice&#160;and alterations of the Central Nervous System. To study the dynamics of SGs in cells from an organism, one can culture primary cells and follow the localization of a transfected tagged component of SGs. We describe time-lapse experiment to observe G3BP1-containing SGs in Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs). This technique can also be used to study G3BP-containing SGs in live neurons, which is crucial as it was recently shown that these SGs are formed at the onset of neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease. This approach can be adapted to any other cellular body and granule protein component, and performed with transgenic animals, allowing the live study of granules dynamics for example in the absence of a specific factor of these granules.

Stress granules (SGs) are cytoplasmic RNA granules containing stalled ribonucleoprotein particles (RNPs), and important in cellular response to various stresses. Dynamics of SGs can be followed in live cells by visualizing the localization of a tagged component of SGs in transfected primary cells after stress.

Canlı İlköğretim Hücrelerde G3BP Stres Granül Dinamiği Görselleştirme

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...