Diese Arbeit wurde von der National Cancer Institute (K08CA140946, um YC), (5F32CA130372 zu PC), (R01CA102774 und R01HL055748 zu PB), das Department of Defense (PC094302 zu YC), die Shuman Family Fund für GIST-Forschung (unterstützt PC), und die Starr Cancer Consortium (auf PC, YC, CLS-und PB). Wir möchten Katia Manova, Ning Fan und Mesurh Turkekul der MSKCC Molekulare Zytologie Core Facility für die Hilfe bei Kryoschneiden und Immunfärbung danken.

1. Dissection der Maus GI-Trakt <ol><li> Eingeschläfert Mäusen durch lokale IUCAC Richtlinien </li><li> Pin jedes Glied auf Styropor Oberfläche und spülen Bauchdecke mit 70% Ethanol. Öffnen Bauchhöhle mit langen Mittellinienschnitt von der Membran bis zum Schambein. Machen Sie einen am distalen Speiseröhre und einen zweiten Schnitt am distalen Dickdarm schneiden und entfernen Sie die GI-Trakt vom Magen bis zum Anus en bloc, sorgfältig schneiden Bänder in den Zwölffingerdarm und Blinddarm mit einer kleinen Schere. Legen GI-Trakt in einer Petrischale mit PBS. Dissect weg Mesenterium mit einer Pinzette (Abbildung 1). Um Magen, Dünndarm und Dickdarm, Schnitt am Pylorus und Bauhin Kreuzung zu trennen. Spülen Sie das Lumen der einzelnen Teile des GI-Trakts mit PBS mit einer 5ml-Spritze an einer Fütterung Nadel (ältere Mäuse) oder stumpfen Nadel (jüngere Mäuse). </li><li> Offene Magen, Dünndarm und Dickdarm entlang der mesenterialen Grenze. Schneiden Sie zwei Stücke für jeden Teil des Magen-Darm-Trakt, eine für ganze Berg Visualisierung und eine für Gefrier. </li></ol> 2. Whole mount Probenvorbereitung und Immunfärbung <ol><li> Legen Sie das gesamte Stück von jedem Teil des GI-Trakt in ein 1,5 cm Mikrozentrifugenröhrchen mit 1,0 ml eiskaltem Aceton und fix Proben für mindestens 1 Stunde gefüllt bei 4 ° C. Die Proben können bis zu 1 Woche bei -20 ° C gelagert werden Wir typischerweise Lagerung von Proben in Aceton und fahren Sie mit cyrosections vorzubereiten. </li><li> Wash Probe 2X mit PBS. Wägegut in Petrischale mit PBS. Unter Sezieren miscroscope vorsichtig abkratzen Schleimhautschicht mit einem Skalpell, indem das eine Ende mit einer Pinzette, so dass die Muscularis. </li><li> Muscle können in 5mm Stücke für Färbung mit verschiedenen Antikörpern geschnitten werden. Nicht mehr als 2 Tage in PBS vor der Färbung. </li><li> Block-und Inkubationsschritte können in einer Vertiefung einer 24-Well-Platte oder in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen durchgeführt werden. Block mit 0,5 ml Blocking-Puffer (5% Ziegenserum, 0,1% Triton X-100 in PBS für 1 Stunde bei 4 ° C). </li><li> Inkubieren mit dem primären Antikörper in Blocking-Puffer verdünnt und drehen über Nacht bei 4 ° C. Wir haben erfolgreich ACK-2 Ratte anti-Kit, Kaninchen-Anti-Ano1 und Kaninchen-Anti-Pgp9.5 Antikörper für ganze Berg Immunfärbung verwendet. </li><li> Wash für 5 min 2X mit PBS auf Rotator bei Raumtemperatur. </li><li> Inkubieren mit sekundärem Antikörper in Blocking-Puffer für 2 Stunden bei Raumtemperatur auf Rotator verdünnt. Wir verwenden in der Regel Alexa Fluor 488 Anti-Kaninchen-und Alexa Fluor 594 Anti-Ratte-Antikörper. </li><li> Wash für 15 min 3X mit PBS auf Rotator bei Raumtemperatur. </li><li> Berg auf dem Objektträger, serösen Seite nach oben, um die Orientierung des Gewebes während der Mikroskopie zu gewährleisten. Diese Ausrichtung wird sichergestellt, der serösen Seite des Deckglases Gesicht und erste angetroffen werden als in die Folie auf einem Mikroskop fokussiert. Wir tun dies auf einem Binokular. Manchmal gehen wir kurz untersuchen das Gewebe unter der Fluoreszenzmikroskopie richtig orientieren. Unter Fluoreszenzmikroskopie Kit oder Ano1 visualisieren, sollte man die ICC-MY-Netzwerk der ersten Begegnung von der Seite des Deckglases. Als nächstes absaugen PBS so viel wie möglich, ohne sie komplett trocknen. Add 50 ul hart eingestellt Eindeckmittel (wir verwenden Verlängern Gold) und sanft Ort Deckglas auf Gewebe. Erlaubt das Setzen der Montage über Nacht bei Raumtemperatur und Objektträger bei -80 ° C. </li><li> Für die mikroskopische Untersuchung verwendeten wir eine Weitfeld-Mikroskop mit einem Z-Antrieb. Wir haben entweder einen 20X Luft Objektiv (NA 0,75, Plan-Apochromat) oder 60X Öl-Objektiv (NA 1.4, Plan-Apochromat) und nahm 2 um oder 1 mu m Z-Profile, die sich über die gesamte muscularis. Die Bilder wurden anschließend zerlegt mit Autoquant Dekonvolution Software. Alternativ haben viele andere konfokale Mikroskopie, anstatt mit ähnlichen Ergebnissen verwendet. </li></ol> 3. Gefrier Vorbereitung und Immunfärbung <ol><li> Legen Sie jeden Teil des GI-Trakts, serösen Seite nach unten flach auf Filterpapier. Cut-Filter Papier um das Gewebe. Legen Gewebe auf Filterpapier in 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS (wir verdünnte 32% Paraformaldehyd in verschlossenen Fläschchen in PBS kurz vor Gebrauch) für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Oder 12-Well-Platte je nach Größe des Gewebes, oder in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen - Fixation kann in einem 6 durchgeführt werden. Wenn in der Platte getan, um Parafilm minimieren PFA Exposition. Längere Fixierung Zeiten können in Antigen Maskierung führen, insbesondere für die ACK-2 anti-Kit-Antikörper. </li><li> Entfernen Gewebe aus PFA und in 30% Saccharose in PBS. Lassen Gewebe über Nacht versinken in 4 ° C. </li><li> Äquilibrieren Gewebe mit 1:1-Verhältnis von 30% Saccharose und OCT für 1 Stunde. Dann montieren Gewebe vertikal in cryomold mit OCT gefüllte Die Längsachse des GI-Trakts sollte parallel zu den cyrosections werden. Bei der Prüfung Mäuse mit unterschiedlichen Genotypen oder mit verschiedenen Behandlungen, kann es nützlich sein, um Gewebe aus verschiedenen Mäusen auf gleiche cryomold montieren, um parallele Verarbeitung zu gewährleisten. Freeze auf Trockeneis und in -80 ° C Tiefkühltruhe für die Lagerung. </li><li> Cut 10 pm Kryoschnittenauf Rutsche und bei -80 ° C Gefrierschrank. Wir in der Regel schneiden Sie zwei Abschnitte pro Folie. Wir übernehmen in der Regel H &amp; E Färbung eines Gefrier gleiten. </li><li> Für Immunfluoreszenz zunächst ausgleichen slide bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Dann ziehen Kreis um Gewebe mittels PAP Stift. </li><li> Block mit 150 ul Blocking-Puffer (wie bei Whole Mount Immunfärbung) für 1 Stunde. </li><li> Saugen Sie Blockierungspuffer und fügen 150 pl primärer Antikörper in Blocking-Puffer verdünnt und inkubieren Nacht bei 4 ° C in einer feuchten Kammer. </li><li> Wash 5 min 2X mit PBS. </li><li> Inkubieren mit sekundärem Antikörper in Blocking-Puffer für 2 Stunden bei Raumtemperatur verdünnt. Wir verwenden in der Regel Alexa 488 Anti-Kaninchen-und Alexa 594-anti-Ratte Antikörper. </li><li> Wash für 15 min 3X mit PBS. </li><li> Saugen Sie gleiten, ohne vollständig trocknen Gewebe. Fügen Sie einen Tropfen hart eingestellt Eindeckmittel mit DAPI (wir verwenden Verlängern Gold) und Platz # 1.5 Deckglas. Legen Sie gleiten über Nacht bei Raumtemperatur zu setzen und in -80 ° C Gefrierschrank lagern. </li><li> Erwerben Sie dreifach Fluoreszenzbilder mit DAPI, FITC und Texas Red-Filter-Sets. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Hier verwenden wir den Dickdarm als Beispiel. H &amp; E eines Saccharose Flecken geschützt festen gefrorenen Abschnitt Immunfluoreszenz verwendet zeigt einige Artefakte, um einen Verweis Paraffinschnitt (Abbildung 2), verglichen, wo die gelbe Linie renzeichen der Plexus myentericus zwischen der Kreis-und Längs-Muskelschichten und die grüne Linie renzeichen der Grenze zwischen den Schleimhaut und muscularlis. Die Untersuchung der Gefrier, von der Serosa zu Schleimhaut Sie die erste Begegnung der dünneren Längsmuskulatur (LM)-Schicht durch die dickeren Ringmuskel (CM) Schicht. Der Abschnitt sollte parallel zu den Längs-Muskel, so dass die Kerne der LM etwas länglich sein sollte, während die Kerne der CM sollte klein und rund. Zwischen den LM und CM sind myentericus plexi von Neuronen, die mit Pgp9.5 Fleck gemacht. Pgp9.5 auch Flecken neuronale Prozesse in der gesamten CM. Die myentericus ICC-Netzwerk (ICC-MY) umgeben den Plexus myentericus und der multipolaren Zellen. Innerhalb der Längs-Muskelschicht, gibt es seltene intramuskuläre ICCs (ICC-IMs), die bipolare Zellen laufen parallel zu den Muskeln. Innerhalb der Ringmuskelschicht, gibt es reichlich ICC-IMs, die auch bipolare Zellen, die parallel mit der kreisförmigen Muskeln und sind im Querschnitt mit diesem Schnitt. An der Kreuzung der Muscularis und Submucosa, ist die submuköse ICC-Netzwerk, bestehend aus ICC-SMP einem flachen Netz von multipolaren ICCs. Die Untersuchung der ganze Berg Kit Immunfärbung des Dickdarms, sollte man erwarten, dass die ICC-MY-Netzwerk der ersten Begegnung, und dann das ICC-IM des CM und ICC-SMP-Netzwerke, wie man aus dem Deckglas konzentriert (Figure. 3) . Volumetrische Messung der ICC-Netzwerke mit 3D-Rekonstruktion von ganzen-mount Bilder wurden 10 beschrieben. Mit Weitwinkel-Mikroskop, gibt es signifikante out-of-plane-Fluoreszenz in den RAW-Bildern, die nach Entfaltung entfernt werden (Abbildung 3) kann. Unvollständige Abisolieren der Schleimhaut wird in hoher Hintergrundfluoreszenz führen. ANO1 ist ein weiterer Marker für ICC und Co-Immunfärbung von KIT und ANO1 zeigt die vollständige Überlappung von ICC-Färbung (Abbildung 4). <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Representative seziert Maus Gastrointestinaltrakt, mit Genehmigung 13. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. A) Repräsentative H &amp; E Färbung der Maus Dickdarm Kryoschnitten wie beschrieben hergestellt und Referenz in Paraffin eingebetteten Abschnitt zeigt eine gewisse Schrumpfung Artefakte Kryoschnitten. Die gelbe Linie renzeichen der Plexus myentericus und die blaue Linie trennt die Schleimhaut von der muscularis. B) Vertreter Kit (rot, ACK-2) und Pgp9.5 (grün) Doppel-Immunfluoreszenz mit DAPI (blau) Gegenfärbung der Maus Dickdarm. LM: Längsmuskel CM: Ringmuskel. Maßstabsleiste 20 um. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Representative Kit (rot, ACK-2) ganz-mount Immunfluoreszenz von dem gleichen Feld in drei Fokusebenen, die ICC-MY-Ebene an der LM / CM Grenze, die ICC-IM Flugzeug in der CM und die ICC- SMP-Ebene an der CM / Submukosa Grenze. Raw-Bilder und entfalteten Bilder angezeigt werden. Maßstabsleiste 20 um. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4. Representative Doppel-Immunfluoreszenz Ano1 (grün) und Kit (rot, ACK-2) im Dickdarm. Maßstabsleiste 20 um.

<ol>
	<li>Sanders, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+case+for+interstitial+cells+of+Cajal+as+pacemakers+and+mediators+of+neurotransmission+in+the+gastrointestinal+tract.">A case for interstitial cells of Cajal as pacemakers and mediators of neurotransmission in the gastrointestinal tract.</a> Gastroenterology. 111, 492-515 (1996).</li><li>Ward, S. M., Sanders, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+pathophysiology+of+the+interstitial+cell+of+Cajal:+from+bench+to+bedside.+I.+Functional+development+and+plasticity+of+interstitial+cells+of+Cajal+networks.">Physiology and pathophysiology of the interstitial cell of Cajal: from bench to bedside. I. Functional development and plasticity of interstitial cells of Cajal networks.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 281, 602-611 (2001).</li><li>Komuro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+organization+of+interstitial+cells+of+Cajal+in+the+gastrointestinal+tract.">Structure and organization of interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract.</a> J Physiol. 576, 653-658 (2006).</li><li>Sanders, K. M., Ordog, T., Koh, S. D., Torihashi, S., Ward, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+plasticity+of+interstitial+cells+of+Cajal.">Development and plasticity of interstitial cells of Cajal.</a> Neurogastroenterol Motil. 11, 311-338 (1999).</li><li>Ward, S. M., Burns, A. J., Torihashi, S., Sanders, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+the+proto-oncogene+c-kit+blocks+development+of+interstitial+cells+and+electrical+rhythmicity+in+murine+intestine.">Mutation of the proto-oncogene c-kit blocks development of interstitial cells and electrical rhythmicity in murine intestine.</a> J Physiol. 480, 91-97 (1994).</li><li>Huizinga, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=W/kit+gene+required+for+interstitial+cells+of+Cajal+and+for+intestinal+pacemaker+activity.">W/kit gene required for interstitial cells of Cajal and for intestinal pacemaker activity.</a> Nature. 373, 347-349 (1995).</li><li>Rubin, B. P., Heinrich, M. C., Corless, C. 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Interstitiellen Zellen von Cajal wurden zunächst von Santiago Ramóón y Cajal genau ein Jahrhundert zuvor mit Methylenblau und Silberchromat Flecken von Magen-Darm-muscularis aus. Cajal ursprünglich angenommen ICC wurden Neuronen auf ihre Prozesse zugrunde, dass die an der Axone und Dendriten sind. Über viele darauf folgenden Jahren hat Studium der Biologie ICC durch einen Mangel an spezifischen Markern bis zur Entdeckung des KIT ist nicht nur in ICC ausgedrückt beschränkt, sondern ist auch für ihre Entwicklung 6 erforderlich. Seitdem hat sich KIT Immunfluoreszenz weithin in das Studium der ICC Biologie verwendet und hat auch auf die Aufwertung des ICC in anderen kontraktilen Organe wie die Harnblase geleitet. Vor kurzem hat ANO1 als zweite zuverlässiger ICC-Marker identifiziert worden. Es hat zahlreiche Publikationen über die vergangenen 15 Jahre mittels Immunfluoreszenz auf ICC identifizieren anhand verschiedener Fixierung und Montage-Techniken wurden. In unseren Händen &quot;fixed-frozen&quot; Gefrierschnitte, die mit Paraformaldehyd und Saccharose geschützt wurden vorangestellt funktioniert am besten in Aceton oder Paraformaldehyd Postfixierung nach Kryoschneiden verglichen. Für ganze Reittiere, haben wir festgestellt, dass Aceton-Fixierung durch Schleimhaut-Dissektion folgte der robustesten Ergebnisse liefert. Historisch gesehen hat die ACK-2 die Kit-Antikörper der Wahl für die Maus ICC Identifizierung. Es ist eine Ratte monoklonale dass die extrazelluläre Domäne erkennt und es ist auch eine blockierende Antikörper, Ileus verursacht, wenn gegeben, um Mäuse zu leben. Allerdings ist die ACK-2 Epitop langsam durch Paraformaldehyd Fixierung zerstört und wird nicht von Standard-Antigen-Retrieval-Methoden gerettet. Wir haben festgestellt, dass die ACK-4-Epitop widerstandsfähiger gegen Paraformaldehyd Fixierung ist. Im Vergleich zu festen gefrorenen Blöcke und Sektionen, in Paraffin eingebettete Blöcke und Sektionen bewahrt Morphologie besser aus und ist eher für die langfristige Archivierung (Abbildung 4). Weder ACK-2 noch ACK-4 wurden erfolgreich in Paraffinschnitten verwendet. Wir haben dadurch gekennzeichnet, dass D13A2, ein neues Kaninchen monoklonaler Antikörper, außergewöhnlich gut funktioniert in beide Fest-gefroren und Paraffinschnitten des GI-Trakts. Kit wird in verschiedenen anderen Zelltypen, einschließlich Melanozyten, hämatopoetischen Zellen, Keimzellen, insbesondere Mastzellen, die auch in der GI-Trakt finden ihren Ausdruck. Glücklicherweise sind die meisten Mastzellen gefunden wird die Schleimhaut und nicht in der Muscularis. Doppelfärbung mit Kaninchen-Anti-Ano1 und Ratte anti-Kit beseitigen können nicht-spezifische Färbung jedes Antikörpers (Abbildung 4). Es ist auch erwähnenswert, dass die relative Expression von Kit und Ano1 zwischen Unterklassen von ICC verschiedenen scheint. Zum Beispiel in den Dünndarm, ist Kit Färbung viel intensiver in myentericus ICC im Vergleich zum ICC der tiefen Muskulatur Plexus während Ano1 Färbung ist vergleichbar.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Ratte anti-Kit-Antikörper (Klon ACK-2) </td><td> eBioscience </td><td> 14-1172 </td><td> Verwenden Sie bei 2μg/ml. Epitope ist mit overfixation verloren. </td></tr><tr><td> Ratte anti-Kit-Antikörper (Klon ACK-4) </td><td> Cedarlane </td><td> CL8936AP </td><td> Verwenden Sie bei 2μg/ml. </td></tr><tr><td> Kaninchen-Anti-KIT-Antikörper (Klon D13A2) </td><td> Cell Signaling </td><td> 3074 </td><td> Verwenden Sie bei 1:100 Verdünnung. Nur Antikörper hier, das funktioniert auch in Paraffinschnitten aufgeführt. </td></tr><tr><td> Kaninchen-Anti-Pgp9.5 Antikörper </td><td> Abcam </td><td> ab10404 </td><td> Labels neuronalen Zytoplasma. Nützlich für Kennzeichnung Neuronen des Plexus myentericus. Verwenden Sie bei 1:1000 Verdünnung. </td></tr><tr><td> Kaninchen-Anti-Ano1 Antikörper </td><td> Abcam </td><td> ab53212 </td><td> Verwenden Sie bei 2μg/ml </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 Ziege anti-Ratte-IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A-11007 </td><td> Verwenden Sie bei 2μg/ml </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 Ziege anti-Kaninchen IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A-11008 </td><td> Verwenden Sie bei 2μg/ml </td></tr><tr><td> Tierfütterung Needle </td><td> Fischer </td><td> 01-208-87 </td><td> Silicon gekippt Nadel nützlich für die Spülung GI-Trakt von erwachsenen Mäusen </td></tr><tr><td> Stumpfen Nadel </td><td> Becton Dickison </td><td> 305180 </td><td> Stumpfe Nadel nützlich für die Spülung GI-Trakt von pre-entwöhnt Welpen </td></tr><tr><td> ProLong Gold-Antifade Reagenz mit DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P-36931 </td><td> Mai alternative Hard-Einstellung Eindeckmittel mit DAPI verwenden </td></tr><tr><td> Tissue-Tek Cryomold </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4557 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek OCT </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> 32% Paraformaldehyd (10ml versiegelten Ampulle) </td><td> EM Sciences </td><td> 15714 </td><td> Öffnet versiegelte Ampulle und verdünnt auf 4% unmittelbar vor dem Gebrauch </td></tr><tr><td> Blocking-Puffer </td><td></td><td></td><td> 5% Ziegenserum, 0,1% Triton X-100 in PBS </td></tr></tbody></table>

visualization of the interstitial cells of cajal (icc) network in mice

Die interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) sind mesenchymale abgeleitet &quot;Schrittmacher-Zellen&quot; des Magen-Darm (GI-Trakt), die eine spontane langsame Wellen für Peristaltik erforderlich generieren und vermitteln neuronalen Input aus der enterischen Nervensystems system1. Verschiedene Subtypen des ICC Form unterschiedliche Netze in der Muscularis des GI-Trakts 2,3. Verluste oder Verletzungen zu diesen Netzen ist mit einer Reihe von Motilitätsstörungen 4 zugeordnet. ICC-Zellen exprimieren den KIT-Rezeptor-Tyrosin-Kinase an der Plasmamembran und KIT Immunfärbung für die letzten 15 Jahre verwendet wurde, um die ICC-Netz 5,6 Etikett. Wichtig ist, dass normale KIT Aktivität für ICC Entwicklung 5,6 erforderlich. Neoplastischen Transformation von ICC-Zellen führt zu gastrointestinalen Stromatumoren (GIST), die häufig Hafen gain-of-function Mutationen KIT 7,8. Wir haben kürzlich gezeigt, dass ETV1 einer Linie-spezifische Überleben Faktor in der ICC / GIST Linie zum Ausdruck kommt und ist ein Meister Transkriptionsregulator sowohl für normale ICC-Netzwerk Bildung und des GIST Tumorgenese 9 benötigt. Wir zeigen ferner, dass es mit aktivierenden KIT-Mutationen in der Tumorgenese kooperiert. Hier beschreiben wir Methoden zur Visualisierung von ICC-Netzwerke in Mäusen, die weitgehend auf bereits veröffentlichten Protokollen 10,11 basieren. In jüngerer Zeit hat die Chlorid-Kanal anoctamin 1 (ANO1) auch als Membran-Marker der ICC 11,12 charakterisiert worden. Aufgrund ihrer Plasmamembran-Lokalisierung, können Immunfluoreszenz beider Proteine ​​verwendet werden, um die ICC-Netzwerke zu visualisieren. Hier beschreiben wir die Visualisierung der ICC-Netzwerke durch feste gefrorene cyrosections und whole mount Präparaten.

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Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

Die interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) sind die Schrittmacher-Zellen des Magen-Darm (GI-Trakt). Sie bilden komplexe Netzwerke zwischen glatten Muskelzellen und postganglionären Neuronen Fasern GI Kontraktilität zu regulieren. Hier präsentieren wir Immunfluoreszenzverfahren Querschnitts-und Ganzkörper-Mount-Visualisierung von Maus-ICC-Netzwerke.

Visualisierung der interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) Netzwerk in Mäuse

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

54.2K Aufrufe.  Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Die interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) sind die Schrittmacher-Zellen des Magen-Darm (GI-Trakt). Sie bilden komplexe Netzwerke zwischen glatten Muskelzellen und postganglionären Neuronen Fasern GI Kontraktilität zu regulieren. Hier präsentieren wir Immunfluoreszenzverfahren Querschnitts-und Ganzkörper-Mount-Visualisierung von Maus-ICC-Netzwerke.

Serie: Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence microscopy. The technique is equally suited for visualization of static yeast populations, or time courses experiments up to ten hours in length. My microscopy investigates epigenetic inheritance at the silent mating loci in S. cerevisiae. There are two silent mating loci, HML and HMR, which are normally not expressed as they are packaged in heterochromatin. In the sir1 mutant background silencing is weakened such that each locus can either be in the expressed or silenced epigenetic state, so in the population as a whole there is a mix of cells of different epigenetic states for both HML and HMR. My microscopy demonstrated that there is no relationship between the epigenetic state of HML and HMR in an individual cell. sir1 cells stochastically switch epigenetic states, establishing silencing at a previously expressed locus or expressing a previously silenced locus. My time course microscopy tracked individual sir1 cells and their offspring to score the frequency of each of the four possible epigenetic switches, and thus the stability of each of the epigenetic states in sir1 cells. See also  Xu et al., Mol. Cell 2006.

A rapid technique for the visualization of growing immobilized yeast cells, here applied to fluorescent reporters at the silent mating loci HML and HMR

Ein schnelles Verfahren für die Visualisierung von Live-immobilisierten Hefezellen

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence ...

Forschung

Biologie

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

Zählen und Bestimmung der Lebensfähigkeit von kultivierten Zellen

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinizing und Subkultivierung Säugerzellen

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Freezing, Thawing, and Packaging Cells for Transport

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. It requires a number of special skills in order to be able to preserve the structure, function, behavior, and biology of the cells in culture. This video describes the basic skills required to freeze and store cells and how to recover frozen stocks. 

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. This video describes the basic skills required to freeze and store cells and how to recover frozen stocks.

Einfrieren, Auftauen und Packaging Cells für Verkehr

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Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray-Analyse für Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Visualisierung von endoplasmatischen Retikulum lokalisierte mRNAs in Säugerzellen

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Visualisierung des endoplasmatischen Reticulum Subdomains in kultivierten Zellen

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly and fate is important to understand the cellular response to stress. The deficiency in key factors of SGs like G3BP (RasGAP SH3 domain Binding Protein) leads to developmental defects in mice&#160;and alterations of the Central Nervous System. To study the dynamics of SGs in cells from an organism, one can culture primary cells and follow the localization of a transfected tagged component of SGs. We describe time-lapse experiment to observe G3BP1-containing SGs in Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs). This technique can also be used to study G3BP-containing SGs in live neurons, which is crucial as it was recently shown that these SGs are formed at the onset of neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease. This approach can be adapted to any other cellular body and granule protein component, and performed with transgenic animals, allowing the live study of granules dynamics for example in the absence of a specific factor of these granules.

Stress granules (SGs) are cytoplasmic RNA granules containing stalled ribonucleoprotein particles (RNPs), and important in cellular response to various stresses. Dynamics of SGs can be followed in live cells by visualizing the localization of a tagged component of SGs in transfected primary cells after stress.

Visualisierung von G3BP Stress-Granulat Dynamics Live Primärzellen

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...