Les auteurs remercient les membres du laboratoire pour les discussions Cirillo et une aide précieuse tout au long de cette étude. Nous remercions le Dr Joshua Hill et le laboratoire du Dr James Samuel de l&#39;aide pour le tournage de ce protocole. Ce travail a été financé par la subvention 48 523 de la Bill &amp; Melinda Gates Foundation et accorder AI47866 du National Institutes of Health.

1. L&#39;infection pulmonaire par intubation intratrachéale <ol><li> Peser les souris et, éventuellement, des marques peuvent être faites sur les oreilles pour une identification facile. </li><li> Anesthésier la souris avec la kétamine (100 pg par gramme de poids de la souris) et de xylazine (10 ug par g de poids de la souris) par inoculation intrapéritonéale. </li><li> Placez la souris dans des cages jusqu&#39;à totalement anesthésiée. Pressez les coussinets de leurs pieds pour vérifier la pédale réflexe. Souris devrait afficher réduite ou pas de réaction réflexe. </li><li> Placez la souris sur le stand de l&#39;intubation couché sur le dos. </li><li> Fixer un élastique pour tenir l&#39;intubation et ensuite le placer sous les incisives supérieures de la souris. Utilisez du ruban adhésif pour fixer les jambes et les bras sur le stand d&#39;intubation. </li><li> Déplacez doucement Tougué sort de la bouche en utilisant une pince. </li><li> Insérez spéculum avec l&#39;intérieur octoscope de la bouche et regarder dans l&#39;oropharynx jusqu&#39;à l&#39;ouverture du larynx est visible. </li><li> Fil-guide Advance couvertes de cathether dans la trachée jusqu&#39;au catether hub est à l&#39;incisives. Retirez le fil guide. Mettez de l&#39;air dans cathether d&#39;observer l&#39;expansion thoracique et de confirmer l&#39;intubation correcte. </li><li> Injecter 50 ul de bactéries (dans les images présentées, nous avons utilisé le bacille de Calmette Guérin (BCG) exprimant taupin rouges luciférase (CBRLuc), construit dans notre laboratoire, mais toute souche bactérienne luminescente peut être utilisé) solution par cathether l&#39;aide d&#39;une seringue de 1 ml. </li><li> Placez la souris dans une cage et l&#39;observer lors de la récupération de l&#39;anesthésie. </li></ol> 2. Anesthésie des animaux et de préparation pour l&#39;imagerie par bioluminescence Les souris sont anesthésiés à l&#39;isoflurane utilisant la XGI-8 Gaz Aneshesia système. <ol><li> Avant de faire fonctionner le système de XGI-8 anesthésie, peser chaque cartouche de filtre à charbon et d&#39;écrire le poids et la date. Si le poids est de 50 grammes de plus du poids initial, la remplacer par une nouvelle cartouche. </li><li> Vérifier le niveau d&#39;isoflurane dans le vaporisateur et remplissez-le si nécessaire. </li><li> Tournez sur la pompe d&#39;évacuation à l&#39;avant de l&#39;XGI-8 système d&#39;anesthésie et de mettre à 8 LPM (litres par minuite). </li><li> Ouvrez l&#39;alimentation en oxygène de la bouteille haute pression et le mettre à 55 psig. </li><li> Mettez de l&#39;oxygène à bascule (en vert) sur la face avant du système de XGI-8 anesthésie. </li><li> Allumez le débit de gaz de la chambre de l&#39;imagerie pour régler le niveau du débit de gaz. Régler à 0,25 lpm puis éteignez le débit de gaz. </li><li> Allumez le débit de gaz de la chambre de l&#39;induction anesthésique pour régler le niveau du débit de gaz. Set à 1,5 lpm puis éteignez débit de gaz. </li><li> Allumez l&#39;isoflurane avec le vaporisateur et mis à 2-2,5 pour cent. Le niveau de l&#39;isoflurane peut être ajusté en fonction du nombre d&#39;animaux utilisés et le poids. </li><li> Placez la souris dans la chambre de l&#39;induction et fermer le couvercle. Allumez le débit du gaz à la chambre de l&#39;induction. Souris Placer dans la chambre pendant 5 - 10 minuites jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient anesthésier complètement. </li><li> Appliquer une pommade optiques pour les yeux afin de protéger les yeux de souris lors de l&#39;imagerie et le lieu de la souris dans la chambre de l&#39;imagerie dans l&#39;un des cônes de nez sur le collecteur d&#39;anesthésie. Utilisez déflecteur de lumière entre la souris pour empêcher la réflexion de la lumière sur des sujets animaux adjacents. </li><li> Injecter luciférine (150 ug / g de poids corporel) par inoculation intrapéritonéale. </li></ol> 3. Imagerie par bioluminescence <ol><li> Démarrez le logiciel d&#39;imagerie habitable. </li><li> Si le système n&#39;est pas initialisé, initialiser le système d&#39;imagerie IVIS. </li><li> Définissez les paramètres pour l&#39;imagerie en cliquant dans le panneau de configuration séquence IVIS de contrôle d&#39;acquisition. Sélectionnez la luminescence et de photographier en mode imagerie. Si l&#39;option d&#39;effectuer DLit reconstruction 3D est souhaitée, sélectionnez photographique, luminescentes et structurelles des images en lumière dans le cadre de la séquence d&#39;images. Réglez le temps d&#39;exposition de 0,5 sec à 10 minutes. Réglez Binning et F / arrêt repose sur la luminosité attendue de l&#39;échantillon. Set filtre d&#39;excitation et d&#39;émission de bloquer filtre pour ouvrir, à moins d&#39;acquérir la planification des longueurs d&#39;onde spécifiques que de lumière. Dans le cas de DLit 3D constitution, de définir des filtres d&#39;émission multiples longueurs d&#39;onde différentes pour permettre une localisation précise des sources. Réglez FOV de A à D selon le nombre de souris ou de la région de l&#39;animal à imager. Sélectionnez A et B pour une souris, C pour 2-3 souris, et D pour 4-5 souris. </li><li> Cliquez sur Ajouter dans l&#39;Assistant d&#39;image dans le Panneau de configuration Acquisition d&#39;ajouter la configuration séquence. </li><li> Démarrer séquence d&#39;imagerie en cliquant acquérir. Dans le cas de la construction DLit 3D, images luminescentes seront acquises pour les filtres d&#39;émission multiples à différentes longueurs d&#39;onde. Photographiques et des images en lumière structurée sera également acquise. </li><li> Pendant l&#39;acquisition de l&#39;image et modifier les niveaux d&#39;image des panneaux seront visibles. Remplissez informations aussi détaillées que possible pour chaque expérience dans l&#39;édition d&#39;image afin d&#39;assurer le suivi facile des images à des moments plus tard, et enregistrer vos images. </li><li> ReRemove les souris à partir d&#39;imagerie IVIS de chambre et de les retourner dans leur cage. Observez la récupération à partir d&#39;unesthesia pour assurer les souris n&#39;ont pas été significativement affectés par la procédure. Les animaux doivent être surveillés en permanence jusqu&#39;à ce qu&#39;ils se remettre complètement de l&#39;anesthésie (généralement 1-2 min). </li></ol> 4. Ex vivo d&#39;imagerie et d&#39;analyse UFC pour la quantification des bactéries dans les poumons <ol><li> Injecter des souris avec la luciférine par voie intrapéritonéale de la même manière que pour l&#39;imagerie, juste avant l&#39;euthanasie. </li><li> Euthanasier les souris par injection intrapéritonéale de 100 mg / kg pentobarbital 5 min après l&#39;injection luciférine. </li><li> Explantation les poumons des souris et les placer dans Petri stérile-plats à l&#39;aide des pinces stériles et des ciseaux. </li><li> Placez boîte de Petri contenant organes explantés dans l&#39;imagerie de chambre et d&#39;acquérir des images de bioluminescence de la même manière que pour la souris tout entière. </li><li> Après l&#39;imagerie, enlever l&#39;organe explanté de boîte de Pétri à l&#39;aide des pinces stériles et homogénéiser dans 1 ml de PBS. </li><li> Faire les dilutions et les tissus plaque sur le support approprié sélectif. Tissu homogénéisé peut être stocké à -80 ° C pour les re-placage devrait-il être nécessaire. Alternativement, tissu homogénéisé peut être utilisé pour l&#39;extraction d&#39;ADN ou d&#39;ARN à quantifier le nombre de bactéries par qPCR. </li></ol> 5. L&#39;analyse de l&#39;imagerie de luminescence <ol><li> Démarrer &quot;logiciel d&#39;imagerie Vivre&quot; et de parcourir les fichiers image. </li><li> Utilisez la palette d&#39;outils «d&#39;ajuster les images. Cliquez sur l&#39;image Régler la correction de modifier / paramètres de filtrage et min / max pour les échelles de couleurs individuelles. </li><li> Utiliser des outils de ROI dans la liste déroulante pour la quantification de l&#39;intensité lumineuse. Sélectionnez ROI forme, le nombre et la taille. Faites glisser le ROI cadre pour la région d&#39;intérêt sur l&#39;image. S&#39;assurer que tous les ROI sont de la même taille et la forme. Cliquez ROI de mesure et d&#39;enregistrer, copier et / ou exporter des données quantitatives. </li><li> Dans le cas de reconstructions 3D DLit, charger une séquence d&#39;images, y compris l&#39;image de la lumière structurée. Cliquez topographie de surface dans l&#39;outil Platte. Dans la liste déroulante, cliquez sur l&#39;onglet Reconstruire pour générer la topographie de la surface. Un gâchis de surface apparaîtra alors dans la fenêtre. </li><li> Sélectionnez DLit reconstruction 3D de la Platte outil. Dans la liste déroulante, cliquez sur l&#39;onglet Propriétés pour définir les propriétés des tissus et de spectre de la source. Le muscle est recommandée dans la plupart des circonstances. Dans la liste déroulante, cliquez sur l&#39;onglet Analyser pour sélectionner la longueur d&#39;onde pour l&#39;analyse. Cliquez sur l&#39;onglet Paramètres et confirmer les valeurs par défaut ou ajuster les paramètres DLit si nécessaire. Cliquez Reconstruire onglet pour commencer l&#39;analyse 3D. </li><li> Lorsque la reconstruction 3D est terminé, la vue 3D affiche les résultats de la reconstruction 3D. Cliquez sur l&#39;onglet pour voir les résultats d&#39;analyse de données pour la densité de photons, voxels et paramètres de l&#39;algorithme DLit. </li><li> Enregistrer et / ou d&#39;exporter les résultats des analyses de la reconstruction 3D dans les chiffres et les fichiers de données. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Les images de bioluminescence de souris infectées par des bactéries bioluminescentes long avec un contrôle de la souris non infectées sont présentés dans la figure 1. Le pulmonaires des souris infectées par des bactéries bioluminescentes produire un signal significatif dans les poumons (figure 1). L&#39;intensité de luminescence est quantifiée comme flux total au sein d&#39;un ROI (région d&#39;intérêt) (figure 2). Les données quantitatives pour l&#39;intensité lumineuse est normalisée pour les unités formant colonies (UFC) de bactéries obtenues à partir des poumons pour confirmer que le signal est produit à partir du bactéries bioluminescentes et peut être comparé au contrôle négatif. L&#39;emplacement et l&#39;intensité du signal peut être encore analysés par DLit reconstruction 3D de la source de luminescence basée sur la tomographie de la surface de 11 souris. Ces analyses permettent de quantifier et de la localisation du signal bioluminescent produite. Les résultats de la reconstruction 3D d&#39;une source luminescente chez des souris infectées démontre que la lumière est produite à partir de poumons de souris (figure 3). Les images ex vivo des poumons de souris résultant de confirmer que la luminescence est émise par les poumons, plutôt que quelque autre tissu ou organe étroitement juxtaposés (figure 2C). <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Imagerie de luminescence des pulmonaires des souris infectées par des bactéries bioluminescentes tagués avec CBRluc. Contrôle de la souris non infectées est sur ​​la gauche et deux souris infectées sont sur ​​la droite. Les souris ont été infectées par des bactéries exprimant CBRluc (n = 2) par voie intra-trachéale. 10 minutes après l&#39;injection de luciférine, des images de luminescence ont été acquis pour 10 min à 4 positions: dorsale, ventrale, côté gauche et côté droit. <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. L&#39;intensité de la lumière quantitative de souris infectées par des bactéries exprimant CBRluc. (A, B) des images de luminescence de l&#39;analyse de ROI et de quantifier le flux total de lumière du retour sur investissement dans les positions dorsale et ventrale, respectivement. Souris non infectées sont à gauche et deux souris infectées sont sur la droite. Luminescence des images ont été acquises à partir de poumons of souris infectés ou non par CBRlux (n = 2). L&#39;intensité de la lumière autour des poumons a été quantifiée par l&#39;analyse du ROI. C) des images ex vivo de poumons de non infectés (en haut) et infectés (en bas deux ensembles de poumons) chez la souris. Luciférine a été injecté 5 miniuts avant de l&#39;euthanasie et les images ont ensuite été acquises. Les valeurs quantifiées sont normalisés à UFC. <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. La reconstruction 3D de source de bioluminescence (s) à partir d&#39;une souris infectée pulmonaires. La souris a été infectée par des bactéries exprimant CBRluc par injection intratrachéale. La séquence d&#39;images a été acquise en utilisant des filtres d&#39;émission de longueurs d&#39;onde différentes de série à partir de 540 nm à 700 nm. Une séquence d&#39;images a été utilisé pour la reconstitution en 3D de la source de luminescence dans les matières animales qui contenait une imagerie structurée. A) La tomographie pour la souris est montré dans différentes positions: avant, arrière, gauche et droite. Les sources lumineuses sont représentées par voxels (cases rouges dans les souris 3D) qui sont situés dans des poumons tel que déterminé par la reconstruction. B) Photon densiy carte de données mesurées et simulées. En comparant les courbes mesurées et simulées densité de photons de fournir les informations sur la qualité de la reconstruction. Bonne qualité des reconstructions entraîner similaires densités mesurées et simulées photon.

<ol>
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Les études animales ont été effectuées en conformité avec les directives et les règlements énoncés par le soin des animaux et du Comité institutionnel utilisation de la Texas A &amp; M University.

Bien que suivant ces protocoles seront généralement lieu à des images de haute qualité, il est important de considérer quelques questions clés en vue d&#39;obtenir des données précises et cohérentes à partir d&#39;études d&#39;imagerie. Luminescence des images doivent être acquises qui ont compte de 600 à 60 000 pour s&#39;assurer que le signal est au-dessus de fond et la caméra n&#39;est pas saturé. Si le signal obtenu est inférieur à 600 les conditions d&#39;exposition devraient être ajustées pour a...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VETONE</td>
<td>501027 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ketamine </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Butler animal health supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xylazine </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedical</td>
<td>158307</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luciferin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GMT</td>
<td>LUCK-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal plus solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VOR tech pharmaceutical</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cathether (22G x 1&#x201D;)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TERUMO</td>
<td>OX2225CA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Guide wire </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hallowell EMC</td>
<td>210A3491</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Octocope with speculum </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hallowell EMC</td>
<td>000A3748</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xenogen IVIS system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XGI-8-gas Anesthsia System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Living Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transparent nose cones</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Light baffle divider </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

using luciferase to image bacterial infections in mice

L&#39;imagerie est une technique intéressante qui peut être utilisé pour surveiller les processus biologiques. En particulier, la présence de cellules cancéreuses, cellules souches, des types spécifiques de cellules immunitaires, des agents pathogènes viraux, les parasites et les bactéries peuvent être suivies en temps réel au sein des animaux vivants, 1-2. Application de l&#39;imagerie par bioluminescence à l&#39;étude des agents pathogènes présente des avantages par rapport aux stratégies classiques en matière d&#39;analyse des infections dans les modèles animaux 3-4. Les infections peuvent être visualisés dans les animaux individuels au fil du temps, sans exiger l&#39;euthanasie afin de déterminer l&#39;emplacement et la quantité de l&#39;agent pathogène. L&#39;imagerie optique permet un examen complet de tous les tissus et organes, plutôt que de l&#39;échantillonnage de sites déjà connus pour être infectés. En outre, la précision de l&#39;inoculation dans des tissus spécifiques peuvent être directement déterminés avant le transport des animaux vers l&#39;avant qui ont été inoculés sans succès à travers toute l&#39;expérience. La variabilité entre les animaux peuvent être contrôlés, puisque l&#39;imagerie permet à chaque animal à être suivis individuellement. Imaging a le potentiel de réduire considérablement le nombre d&#39;animaux nécessaires en raison de la capacité d&#39;obtenir des données à partir de points de temps de nombreux tissus sans avoir à l&#39;échantillon pour déterminer la charge pathogène 3-4. Ce protocole décrit les méthodes pour visualiser les infections chez les animaux vivants en utilisant l&#39;imagerie par bioluminescence pour les souches recombinantes de bactéries exprimant la luciférase. Le taupin (CBRLuc) et luciférases luciole (FFluc) utilisent comme substrat luciférine 5-6. La lumière produite par les deux CBRluc et FFluc a une longueur d&#39;onde large de 500 nm à 700 nm, ce qui rend ces journalistes luciférases excellent pour l&#39;imagerie optique dans des modèles animaux qui vivent 7-9. C&#39;est principalement parce que les longueurs d&#39;onde de la lumière est supérieure à 600 nm sont nécessaires pour éviter l&#39;absorption par l&#39;hémoglobine et, par conséquent, les voyages à travers les tissus des mammifères de façon efficace. Luciférase est génétiquement introduits dans les bactéries pour produire des signaux de lumière 10. Les souris sont inoculées avec pulmonaires bactéries bioluminescentes intratrachéale pour permettre la surveillance des infections en temps réel. Après l&#39;injection luciférine, les images sont acquises à l&#39;aide du système d&#39;imagerie IVIS. Lors d&#39;imagerie, les souris sont anesthésiés à l&#39;isoflurane utilisant une XGI-8 Gaz Anethesia système. Les images peuvent être analysées pour localiser et quantifier la source du signal, ce qui représente le site de l&#39;infection bactérienne (s) et le nombre, respectivement. Après l&#39;imagerie, la détermination UFC est effectué sur le tissu homogénéisé afin de confirmer la présence de bactéries. Plusieurs doses de bactéries sont utilisées pour corréler le nombre de bactéries à luminescence. Imaging peut être appliquée à l&#39;étude de la pathogenèse et l&#39;évaluation de l&#39;efficacité des composés antibactériens et des vaccins.

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Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Méthodes pour l&#39;imagerie par bioluminescence des infections bactériennes chez les animaux vivants sont décrits. Les agents pathogènes sont modifiées pour exprimer la luciférase permettant d&#39;imagerie optique du corps entier des infections chez les animaux vivants. Les modèles animaux peuvent être infectés par des pathogènes exprimer la luciférase et le cours résultant de la maladie de visualiser en temps réel par imagerie par bioluminescence.

En utilisant la luciférase aux infections bactériennes chez les souris image

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

using-luciferase-to-image-bacterial-infections-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.3K vues.  Texas A&M Health Science Center. Méthodes pour l'imagerie par bioluminescence des infections bactériennes chez les animaux vivants sont décrits. Les agents pathogènes sont modifiées pour exprimer la luciférase permettant d'imagerie optique du corps entier des infections chez les animaux vivants. Les modèles animaux peuvent être infectés par des pathogènes exprimer la luciférase et le cours résultant de la maladie de visualiser en temps réel par imagerie par bioluminescence.

Vidéo: Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of guard cells, which are able to close the stomatal pore in response to a number of external factors including light intensity, carbon dioxide concentration, and relative humidity (RH). The stomatal pore is also the main route for pathogen entry into leaves, a crucial step for disease development. Recent studies have unveiled that closure of the pore is effective in minimizing bacterial disease development in Arabidopsis plants; an integral part of plant innate immunity. Previously, we have used epidermal peels to assess stomatal response to live bacteria (Melotto et al. 2006); however maintaining favorable environmental conditions for both plant epidermal peels and bacterial cells has been challenging. Leaf epidermis can be kept alive and healthy with MES buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) for electrophysiological experiments of guard cells. However, this buffer is not appropriate for obtaining bacterial suspension. On the other hand, bacterial cells can be kept alive in water which is not proper to maintain epidermal peels for long period of times. When an epidermal peel floats on water, the cells in the peel that are exposed to air dry within 4 hours limiting the timing to conduct the experiment. An ideal method for assessing the effect of a particular stimulus on guard cells should present minimal interference to stomatal physiology and to the natural environment of the plant as much as possible. We, therefore, developed a new method to assess stomatal response to live bacteria in which leaf wounding and manipulation is greatly minimized aiming to provide an easily reproducible and reliable stomatal assay. The protocol is based on staining of intact leaf with propidium iodide (PI), incubation of staining leaf with bacterial suspension, and observation of leaves under laser scanning confocal microscope. Finally, this method allows for the observation of the same live leaf sample over extended periods of time using conditions that closely mimic the natural conditions under which plants are attacked by pathogens.

We have developed a simple and reproducible protocol to access stomatal response to live bacteria. This method minimizes wounding and manipulation of the leaf as compared to the use of epidermal peels reported previously.

Évaluer la réponse stomatique à Live cellules bactériennes en utilisant l&#39;imagerie feuilles entières

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

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Immunologie et infection

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

Mesure de la charge bactérienne et les réponses immunitaires chez des souris infectées avec des Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

This protocol outlines the steps required to longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging tomography with integrated &mu;CT (DLIT-&mu;CT) and the subsequent use of this data to generate a four dimensional (4D) movie of the infection cycle. To develop the 4D infection movies and to validate the DLIT-&mu;CT imaging for bacterial infection studies using an IVIS Spectrum CT, we used infection with bioluminescent C. rodentium, which causes self-limiting colitis in mice. In this protocol, we outline the infection of mice with bioluminescent C. rodentium and non-invasive monitoring of colonization by daily DLIT-&mu;CT imaging and bacterial enumeration from feces for 8 days.
The use of the IVIS Spectrum CT facilitates seamless co-registration of optical and &mu;CT scans using a single imaging platform. The low dose &mu;CT modality enables the imaging of mice at multiple time points during infection, providing detailed anatomical localization of bioluminescent bacterial foci in 3D without causing artifacts from the cumulative radiation. Importantly, the 4D movies of infected mice provide a powerful analytical tool to monitor bacterial colonization dynamics in vivo.

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Multi-modality imaging is a valuable approach for studying bacterial colonization in small animal models. This protocol outlines infection of mice with bioluminescent Citrobacter rodentium and the longitudinal monitoring of bacterial colonization using composite 3D diffuse light imaging tomography with &mu;CT imaging to create a 4D movie of C. rodentium infection.

4D imagerie multimodalité des<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infections chez les souris

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Chronique à long terme<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infection des voies respiratoires chez les souris

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood vessels resulting in vascular leak, the development of purpuric rashes and eventual tissue necrosis. Studying the pathogenesis of this infection was previously limited by the human specificity of the bacteria, which makes in vivo models difficult. In this protocol, we describe a humanized model for this infection in which human skin, containing dermal microvessels, is grafted onto immunocompromised mice. These vessels anastomose with the mouse circulation while maintaining their human characteristics. Once introduced into this model, N. meningitidis adhere exclusively to the human vessels, resulting in extensive vascular damage, inflammation and in some cases the development of purpuric rash. This protocol describes the grafting, infection and evaluation steps of this model in the context of N. meningitidis infection. The technique may be applied to numerous human specific pathogens that infect the blood stream.

Neisseria meningitidis is a human specific pathogen that infects blood vessels. In this protocol human microvessels are introduced into a mouse by grafting human skin onto immunocompromised mice. Bacteria adhere extensively to the human vessels, leading to vascular damage and development of the purpuric rash typically observed in human cases.

Souris humanisée modèle pour étudier les infections bactériennes Cibler la microvascularisation

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

Évaluation de l’invasion bactérienne des cellules cardiaques en culture et colonisation cardiaque chez des souris infectées à l’aide de Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Génération et multi-phénotypique criblage à haut contenu de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Mutants de transposon

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Cultures placentaire et déciduale organe humain pour l&#39;étude des infections à l&#39;interface materno-fœtale

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for infectious diseases. Larval zebrafish naturally prey on the unicellular protozoan Paramecium caudatum. This protocol describes the use of P. caudatum as a vehicle for food-borne infection in larval zebrafish. P. caudatum internalize a wide range of bacteria and bacterial cells remain viable for several hours. Zebrafish then prey on P. caudatum, the bacterial load is released in the foregut upon digestion of the paramecium&#160;vehicle, and the bacteria colonize the intestinal tract. The protocol includes a detailed description of paramecia maintenance, loading with bacteria, determination of bacterial degradation and dose, as well as infection of zebrafish by feeding with paramecia. The advantage of using this method of food-borne infection is that it closely mimics the mode of infection observed in human disease, leads to more robust colonization compared to immersion protocols, and allows the study of a wide range of pathogens. Food-borne infection in the zebrafish model can be used to investigate bacterial gene expression within the host, host-pathogen interactions, and hallmarks of pathogenicity including bacterial burden, localization, dissemination and morbidity.

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Zebrafish (Danio rerio) are becoming a widely-used vertebrate animal model for microbial colonization and pathogenesis. This protocol describes the use of the protozoan Paramecium caudatum as a vehicle for food-borne infection in zebrafish larvae. P. caudatum readily internalizes bacteria and get taken up by larval zebrafish through natural preying behavior.

Utilisant le protozoaire Paramecium caudatum comme vecteur d’Infections d’origine alimentaire chez les larves de poisson zèbre

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Un haut débit de Shigella-test bactéricide spécifique

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...