Les auteurs tiennent à remercier le Dr James (Zhijian) Chen (UT Southwestern, biologie moléculaire) pour fournir des réactifs essentiels, y compris les Mavs - / - souris, et le Dr Ren Sun (Université de Californie-Los Angeles, pharmacologie et de médecine moléculaire ) pour fournir le chromosome bactérien artificiel de γHV68 pour cette étude.

1. L&#39;infection de souris avec γHV68 <ol><li> Souris même portée de six à huit semaines vieux, genre assortie (8 à 12 souris / groupe) sont utilisés pour l&#39;infection virale. Permettez-souris pour s&#39;acclimater pendant quatre jours complets (96 heures) après l&#39;expédition. </li><li> Étapes du protocole à l&#39;aide de virus doit être effectué dans un cabinet de biosécurité de niveau 2 (BSL2) en utilisant des BSL2 précautions. </li><li> Préparer une suspension virale (40 à 1 x 10 5 unités formant des plages [UFP]) de γHV68 dans 30 ul de PBS stérile par souris juste avant l&#39;expérience. Gardez suspension virale sur la glace. </li><li> Préparer la solution de kétamine / xylazine (1,5 mg de kétamine et de 0,15 mg xylazine/20 g de poids corporel, 100 ul / souris) pour la sédation de la souris. Assurez-vous que les souris ont été mis sous sédation en effectuant un pincement de l&#39;orteil. </li><li> Souris calmes avec 1,5 mg de kétamine et de 0,15 mg de xylazine par 20 mg de poids corporel (100 ul / souris) par injection intra-péritonéale. </li><li> Livrer suspension virale (30 ul / souris) par voie intranasale, en goutte à gouttela mode, à une narine de la souris sous sédation. </li><li> Lay souris sur un côté pendant 5 - 10 minutes pour faciliter la livraison du virus des voies respiratoires dans les poumons. </li><li> Replacez les souris chez la souris et le moniteur cage jusqu&#39;à ce qu&#39;ils aient complètement remis de la sédation. </li><li> À différents jours après l&#39;infection, le sacrifice des souris par le CO 2 asphyxie et la récolte des poumons après avoir assuré la mort / perte de conscience profonde. Placez-les dans les poumons stériles de 1,5 ml tubes à bouchon vissé contenant 500 ul de 1,0 mm en zircone / silice perles. Garder les tubes sur la glace. Conserver les échantillons à -80 ° C, sinon passer à l&#39;étape suivante, le même jour. La rate ou foie pourraient être recueillies à ce moment pour l&#39;analyse de la latence virale en fonction de délai d&#39;expérience. </li><li> Ajouter 1 ml d&#39;eau froide DMEM sans sérum dans le tube et homogénéiser les poumons en perles battant 30 secondes. Refroidir les tubes sur la glace pendant au moins 1 min. Répétez cette procédure qu&#39;une seule fois. </li><li> Centrifugeuse poumon lysats à 16.000 rcf à 4 ° C pendant 1 min et utiliser supernatant pour déterminer le titre viral par un dosage de la plaque à l&#39;aide d&#39;une monocouche NIH3T3 ou BHK21 (voir la section 5 pour plus de détails). </li></ol> 2. Déterminer γHV68 cinétique de croissance multi-étapes dans les fibroblastes embryonnaires de souris <ol><li> Développer des fibroblastes de souris de type sauvage embryonnaires (MEF) et les lacunes dans un gène de l&#39;hôte à la sous-confluence (environ 80%) de densité avant étalement des cellules. </li><li> Séparer les MEF en 24 et la plaque à 10.000 cellules / puits pour une faible multipilicity-de-infection (MOI) le jour avant l&#39;infection. Des expériences sont normalement effectuées en triple et à une MOI entre 0,001 à 0,05 est généralement utilisé. </li><li> Préparer γHV68 suspension contenant la quantité désirée de virus (0,5 ml par puits). </li><li> Retirer moyen et couvrir MEF avec 0,5 ml de suspension γHV68 par puits. </li><li> Incuber la plaque de culture de tissu incubateur, rock toutes les 30 minutes, et de permettre l&#39;incubation poursuivie pendant 2 h. </li><li> Levée de la suspension virale, et couvrir les cellules avec 0,5 ml fraîche cemplissez milieu DMEM contenant 8% de sérum bovin foetal. </li><li> À différents jours après l&#39;infection, la récolte du milieu et les cellules dans des tubes à centrifuger stérile de 1,5 ml. Geler immédiatement les tubes à -80 ° C. </li><li> Communiqué de γHV68 MEF par congélation à -80 ° C, la décongélation à 37 ° C et bain d&#39;eau vortex. Trois cycles de gel et de dégel est généralement appliquée aux échantillons. </li><li> Déterminer le titre viral par un dosage de la plaque à l&#39;aide d&#39;une monocouche NIH3T3 ou BHK21 (voir la section 5 pour plus de détails). </li><li> Lire titre viral et l&#39;intrigue γHV68 courbe de croissance multi-étape sur la MEF. </li></ol> 3. Dissection moléculaire de la réplication lytique γHV68 dans les fibroblastes embryonnaires de souris <ol><li> Effectuer une infection virale comme décrit dans les étapes 2.1 à 2.6 de la section 2. </li><li> À différents jours après l&#39;infection, éliminer le surnageant. Rincer les cellules avec du PBS froid et les cellules Trypsiniser. Sédimenter les cellules par centrifugation à 1.000 rcf à température ambiante pendant 1 min. Jeter le surnageant etcellules conserver à -80 ° C. </li><li> Extraire l&#39;ADN total (hôte et le génome viral) et l&#39;ARN total selon les méthodes précédemment publiées 5,6. </li><li> Effectuer PCR en temps réel en utilisant l&#39;ADN total et des amorces spécifiques de transcription viraux lytiques, tels que RTA (ORF50), ORF57 et ORF60. Déterminer la quantité relative de γHV68 intracellulaire du génome en référence à un gène de ménage hôte (par exemple, β-actine). </li><li> À éliminer la contamination de l&#39;ADN génomique, le traitement par la DNase sans RNase est essentielle pour la préparation d&#39;ADNc de l&#39;ARN total et d&#39;oligo (dT) 11-19 amorce. Reportez-vous à la référence 5 pour plus de détails sur l&#39;extraction de l&#39;ARN, y compris le traitement à la RNase-Free DNase et RT-PCR. Effectuer PCR en temps réel en utilisant l&#39;ADNc et des amorces comme ci-dessus pour déterminer la quantité relative des transcrits viraux en référence à celle du gène de ménage d&#39;accueil. </li></ol> 4. Génération recombinant utilisant γHV68 chromosomes bactériens artificiels La méthod décrit ici est utilisé pour introduire des mutations dans un gène γHV68 qui est impliqué dans l&#39;interaction hôte-virus. <ol><li> Préparer un fragment d&#39;ADN (environ 1,5 kb) de séquence de type sauvage ou une séquence portant des mutations désirées dans la zone centrale par PCR. </li><li> Préparer chromosome artificiel bactérien (BAC) qui contient une insertion du transposon 7 autour du site de mutation qui inactive le gène spécifique du gène d&#39;intérêt, par purification midi-échelle (OriGene). Magasin d&#39;ADN de BAC à 4 ° C (éviter le gel / dégel ADN de BAC). </li><li> Transfecter ADN de BAC et du produit de PCR contenant les mutations désirées du gène d&#39;intérêt dans les cellules (par exemple, NIH3T3 ou BHK21), qui sont très permissives à la réplication lytique γHV68, avec Lipofectamine 2000 (Invitrogen). </li><li> Gardez séparer les cellules jusqu&#39;à ce que l&#39;effet cytopathogène (ECP) apparaît dans la monocouche. Recueillir contenant le virus surnageant et, si nécessaire, d&#39;amplifier le virus dans les cellules NIH3T3 ou BHK21. </li><li> Infecter des cellules NIH3T3 avecle virus recombinant par centrifugation à 1.800 tours par minute, 30 ° C pendant 30 min. </li><li> Récolte γHV68 infectés par des cellules NIH3T3 et préparer circularisé génome viral en utilisant le protocole Hirt 8,9. </li><li> Transformez Electro-MAX cellules DH10B compétentes (Invitrogen) par électroporation et un écran pour les colonies qui sont résistants au chloramphénicol (Cm), mais sensible à la kanamycine (Kan) (Cm gène de résistance est en épine dorsale BAC, Kan-gène de résistance est en transposon d&#39;insertion). </li><li> Croître les colonies Cm R S Kan dans un milieu contenant chlorophenicol et préparer ADN de BAC à la purification des mini ou midi-échelle (OriGene). </li><li> Vérifier la mutation désirée dans le gène cible par PCR, en utilisant des amorces spécifiques aux régions flanquantes de site de mutation, et le séquençage. </li><li> Confirmer l&#39;absence de réarrangement chromosomique en BAC par digestion avec des enzymes de restriction choisies et l&#39;électrophorèse en champ pulsé. </li><li> Transfecter BAC recombiné dans des cellules NIH 3T3 ou BHK21 avec Lipofectamine2000 (Invitrogen) pour préparer recombinant γHV68. </li><li> Gardez passage de cellules jusqu&#39;à CPE apparaît dans la monocouche. Recueillir le surnageant contenant le virus recombinant et amplifier γHV68 dans NIH3T3 ou BHK21 cellules. </li><li> Déterminer le titre du virus recombinant et de caractériser les propriétés de croissance virale ex vivo et in vivo, comme décrit dans les sections 1 et 2. </li></ol> 5. Déterminer le titre viral par un dosage de la plaque <ol><li> Cultiver des cellules NIH3T3 à la sous-confluence (environ 80%) de densité avant étalement des cellules. </li><li> Diviser NIH3T3 en 24 et plaque à 20.000 cellules / puits le jour avant l&#39;infection. </li><li> Préparer un facteur 10 surnageants de virus dilué en série avec un milieu DMEM contenant 8% de sérum de veau nouveau-né (NCS). </li><li> Retirer moyen et couvrir les cellules NIH3T3 avec 0,5 ml de suspension γHV68. </li><li> Incuber la plaque en incubateur de culture tissulaire, du rock toutes les 30 min, et permettent d&#39;incubation de procéderpendant 2 h. </li><li> Retirer suspension virale et des cellules de couverture avec 0,5 ml du milieu DMEM contenant 2% de NCS et la méthylcellulose à 0,75% (Sigma). </li><li> Incuber la plaque en incubateur de culture tissulaire. Comptez plaques au jour 6 après l&#39;infection. La coloration de la monocouche, par exemple avec du violet de cristal, peut faciliter le comptage plaque. </li><li> Calculer le titre viral dans les lysats de tissus non dilués ou lysats cellulaires en utilisant la formule suivante: Titre (UFP / ml) = D x N x 1000 pl / ml ÷ V pi. N, le nombre moyen de plaque à une dilution appropriée, D, dilutions (comme le 5, 10, 100 .....) V (pi), volume de surnageant dilué en série par puits. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Trois figures représentatives sont présentées ici, y compris γHV68 réplication lytique dans le poumon de type sauvage et Mavs - / - souris 10, γHV68 phénotypes de réplication lytiques dans les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF), et recombinant γHV68 portant des mutations dans les sites de phosphorylation qui sont modulés par l&#39;IKKβ MAVS-dépendante. Ces trois expériences concordantes de créer un régime de définir les rôles des composantes immunitaires innées dans γHV68 réplication lytique in vivo et ex vivo. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3140/3140fig1.jpg" /> Figure 1 γHV68 charges dans les poumons des Mavs + / + et - Mavs. / - Souris. A) Deux voies de signalisation principal innée en aval de MAVS. Les relais de signalisation Mavs molécule adaptatrice de cytosoliques RIG-I-like receptors pour activer NFkB et les facteurs réglementaires interféron (IRF) qui, à son tour, en hausse de réguler l&#39;expression des gènes de cytokines pro-inflammatoires et les interférons. B) Mavs + / + et - / - Mavs souris ont été infectées avec 40 PFU γHV68 par voie intranasale et les charges virales dans les poumons à des points de temps indiqués ont été de dissuader<html> minée par un dosage de la plaque à l&#39;aide NIH3T3 monocouche. Chaque symbole représente une souris. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3140/3140fig2.jpg" /> Figure 2. ΓHV68 cinétique de réplication lytiques dans les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF). La réplication lytique de γHV68 sur Mavs + / + et Mavs - / - MEF a été évaluée par des courbes de croissance multi-étapes (A) et quantitative PCR en temps réel (B). Pour les deux expériences, le même nombre de MEF et la quantité de γHV68 ont été utilisés pour l&#39;infection virale à une multiplicité de l&#39;infection (MOI) de 0,01. (A) Les cellules et les surnageants ont été récoltés à des moments indiqués et soumis à un essai sur plaque pour déterminer les titres viraux. (B) L&#39;ARN total a été extrait de γHV68 infecté par MEF et analysées par quantitative en temps réel PCR avec des amorces spécifiques pour certaines transcriptions lytiques (RTA, ORF57 et ORF60). ig3.jpg &quot;/&gt; Figure 3. La cinétique de réplication lytiques de recombinants portant des mutations γHV68 dans le domaine de transactivation RTA qui abolissent la phosphorylation par IKKγ. (A) courbes de croissance multi-étapes de recombinaison virus de type sauvage (γHV68.wt) et le virus mutant (γHV68.mut) dans Mavs + / + et Mavs - / - cellules FAE (MOI = 0,01). FAE ont été infectées par le γHV68 à une MOI de 0,01. Les cellules et les surnageants ont été récoltés à des moments indiqués et les titres viraux ont été déterminés par un dosage de la plaque à l&#39;aide du NIH 3T3 monocouche. (B) le niveau d&#39;ARNm γHV68 RTA dans γHV68 infectés par des cellules NIH3T3 (MOI = 0,01). À 30 h post-infection, l&#39;ARN total a été extrait des cellules NIH 3T3 infectées par γHV68 et analysées par quantitative PCR en temps réel.

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

En réponse à une infection virale, les Mavs dépendantes immunitaires innées des voies de signalisation sont activés pour promouvoir la production de cytokines inflammatoires antiviraux 10-14. Utilisation γHV68 murin comme un virus oncogène humain modèle pour le sarcome de Kaposi associé au virus de l&#39;herpès et le virus d&#39;Epstein-Barr 3,4, nous avons découvert que γHV68 usurpe la voie MAVS-IKKβ de promouvoir la réplication virale lytique via l&#39;activation de la transcription...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-019 </td></tr><tr><td> Electro-MAX cellules DH10B compétentes </td><td> Invitrogen </td><td> 18290-015 </td></tr><tr><td> Méthylcellulose </td><td> Sigma </td><td> M0512 </td></tr><tr><td> POWERPREP HP plasmide système Miniprep </td><td> OriGene </td><td> NP100004 </td></tr><tr><td> POWERPREP HP plasmide système Midiprep </td><td> OriGene </td><td> NP100006 </td></tr></tbody></table>

dissecting host-virus interaction in lytic replication of a model herpesvirus

En réponse à une infection virale, une foule se développe diverses réactions défensives, telles que l&#39;activation de l&#39;immunité innée voies de signalisation qui conduisent à la production de cytokines 1,2 antiviral. Afin de coloniser l&#39;hôte, les virus sont obligatoire pour échapper réponses de l&#39;hôte antiviraux et de manipuler des voies de signalisation. Démêler l&#39;interaction hôte-virus fera la lumière sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre l&#39;infection virale. ΓHV68 murin est étroitement liée à oncogène humain sarcome de Kaposi associé au virus de l&#39;herpès et Epsten-Barr 3,4. γHV68 infection chez les souris de laboratoire fournit un modèle animal docile petite pour examiner toute la durée de réponse de l&#39;hôte et l&#39;infection virale in vivo, qui ne sont pas disponibles pour les herpèsvirus humains. Dans ce protocole, nous vous présentons un panel de méthodes de caractérisation phénotypique et dissection moléculaire des composants de l&#39;hôte de signalisation dans γHV68 replic lytiquetion à la fois in vivo et ex vivo. La disponibilité de souches de souris génétiquement modifiées permet l&#39;interrogation des rôles des voies de signalisation hôtes pendant γHV68 infection aiguë in vivo. En outre, des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) isolés à partir de ces souches de souris déficientes peut en outre être utilisé pour décortiquer les rôles de ces molécules in vivo au cours de γHV68 réplication lytique ex. En utilisant des tests de biologie moléculaire et virologiques, nous pouvons identifier le mécanisme moléculaire de interactions hôte-virus et d&#39;identifier l&#39;hôte et des gènes viraux essentiels à la réplication virale lytique. Enfin, un chromosome artificiel bactérien (BAC) système facilite l&#39;introduction de mutations dans le facteur viral (s) spécifiquement interrompre l&#39;interaction hôte-virus. ΓHV68 recombinant portant ces mutations peuvent être utilisés pour récapituler les phénotypes de γHV68 réplication lytique dans les MEF déficientes en clé d&#39;hôte de signalisation composants.Ce protocole offre une excellente stratégie pour interroger interaction hôte-pathogène à de multiples niveaux d&#39;intervention in vivo et ex vivo. Récemment, nous avons découvert que γHV68 usurpe une voie de signalisation immunitaire inné pour promouvoir la réplication virale lytique 5. Plus précisément, γHV68 infection de novo active la kinase IKKβ immunitaire et IKKβ activée phosphoryle le facteur de transcription virale maître, de réplication et de transactivateur (RTA), afin de promouvoir virale activation de la transcription. Ce faisant, γHV68 efficacement son activation transcriptionnelle couples d&#39;accueillir l&#39;activation immunitaire innée, ce qui facilite la transcription virale et la réplication lytique. Cette étude fournit un excellent exemple de ce que peut être appliqué à d&#39;autres virus d&#39;interroger les interactions hôte-virus.

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Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

Nous décrivons un protocole pour identifier les rôles clés des molécules de l&#39;hôte de signalisation dans la réplication lytique d&#39;un virus de l&#39;herpès modèle, gamma herpèsvirus 68 (γHV68). L&#39;utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées et des fibroblastes embryonnaires de γHV68 réplication lytique, le protocole permet à la fois la caractérisation phénotypique et moléculaire de l&#39;interrogatoire interactions virus-hôte dans la réplication virale lytique.

Dissection hôte-virus interaction dans la réplication lytique d&#39;un virus de l&#39;herpès modèle

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

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Immunology and Infection

10.8K vues.  UT Southwestern Medical Center. Nous décrivons un protocole pour identifier les rôles clés des molécules de l'hôte de signalisation dans la réplication lytique d'un virus de l'herpès modèle, gamma herpèsvirus 68 (γHV68). L'utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées et des fibroblastes embryonnaires de γHV68 réplication lytique, le protocole permet à la fois la caractérisation phénotypique et moléculaire de l'interrogatoire interactions virus-hôte da...

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Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative tumor of vascular endothelial cells and produces rare B cell lymphoproliferative diseases in the form of pleural effusion lymphomas (PEL) and some forms of multicentric Castleman's disease.3-5 Only 1-5% of cells in KS lesions actively support lytic replication of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), the etiological agent associated with KS, and it is clear that cellular factors must interact with viral factors in the process of oncogenesis and tumor progression.6,7 Identifying novel host-factor determinants which contribute to KS pathology is essential for developing prognostic markers for tumor progression and metastasis as well as for developing novel therapeutics for the treatment of KS.8 The accompanying video details the methods we use to identify host cell gene expression programs altered in dermal microvascular endothelial cells (DMVEC) after KSHV infection and in KS tumor tissue.9 Once dysregulated genes are identified by microarray analysis, changes in protein expression are confirmed by immunoblot and dual labeled immunofluorescence. Changes in transcriptional expression of dysregulated genes are confirmed in vitro by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Validation of in vitro findings using archival KS tumor tissue is also performed by dual labeled immunochemistry and tissue microarrays.8,10 Our approach to identifying dysregulated genes in the KS tumor tissue microenvironment will allow the development of in vitro and subsequently in vivo model systems for discovery and evaluation of potential novel therapeutic for the treatment of KS.

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi&#039;s Sarcoma-associated Herpesvirus KSHV

Host cell factors play a critical role in the establishment and maintenance of Kaposi's sarcoma (KS). We outline methods to identify host cell factors altered in KSHV-infected DMVEC cells, and in KS tumor tissue. Cellular genes altered by virus will serve as potential target(s) for novel therapeutics.

L&#39;identification des gènes induite par une dysrégulation de Kaposi associé au sarcome de Herpesvirus (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative ...

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Immunologie et infection

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

Dissection Innate Immune signalisation Evasion virale de la production de cytokines

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

À haut débit de dosage de phénotype<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Association Typhimurium, Invasion, et la réplication dans les macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Etudier communautés microbiennes<em&gt; In Vivo</em&gt;: Un modèle d&#39;interaction hôte intermédiaire Entre<em&gt; Candida albicans</em&gt; Et<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Dans les Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis comme un organisme modèle pour l&#39;évaluation de l&#39;interaction des bactéries anaérobies avec des cellules hôtes

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 norm. After the development and first validation step, two distinct characterization steps were performed according to the AFNOR norm: (a) characterization of the qRT-PCR assay alone and (b) characterization of the whole analytical method. The validation of the whole analytical method included the portrayal of all steps between the extraction of nucleic acids and the final PCR analysis. 
Validation of the whole method is very important for virus detection by qRT-PCR in order to get an accurate determination of the viral genome load. Since the extraction step is the primary source of loss of biological material, it may be considered the main source of error of quantification between one protocol and another. For this reason, the AFNOR norm NF-U-47-600 recommends including the range of plasmid dilution before the extraction step. In addition, the limits of quantification depend on the source from which the virus is extracted. Viral genome load results, which are expressed in international units (IU), are easier to use in order to compare results between different laboratories. 
This new method of characterization of qRT-PCR should facilitate the harmonization of data presentation and interpretation between laboratories.

Here, we present a protocol for the development and validation of a quantitative PCR method used for the detection and quantification of EHV-2 DNA in equine respiratory fluids. The EHV-2 qRT-PCR validation protocol involves a three-part procedure: development, characterization of qRT-PCR assay alone, and characterization of the whole analytical method.

Développement et validation d&#39;une méthode de PCR quantitative pour équidé herpèsvirus-2 Diagnostics dans respiratoires Fluides

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle de la barrière hémato-encéphalique utilisant la spectroscopie d&#39;impédance: un regard sur T Cell-endothélial cellulaire Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Cytométrie en flux Analyse des cellules tueuses naturelles lytique Activité dans le sang humain

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research is deciphering how these dynamic protein complexes act to integrate signals from multiple sources in order to direct a specific biological response, and how this becomes deregulated in many disease settings. Despite the importance of this key biochemical mechanism, there is a lack of experimental techniques that can facilitate the specific and sensitive deconvolution of these multi-molecular signaling complexes.
Here this shortcoming is addressed through the combination of a protein complementation assay with a conformation-specific nanobody, which we have termed Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel technique facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any pair of interacting proteins, to the exclusion of un-complexed individual proteins and complexes formed with competing binding partners. 
The BiCAP technique is adaptable to a wide array of downstream experimental assays, and the high degree of specificity afforded by this technique allows more nuanced investigations into the mechanics of protein complex assembly than is currently possible using standard affinity purification techniques.

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

This manuscript describes the protocol for Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel method facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any two interacting proteins, while excluding un-complexed individual proteins as well as complexes formed with competing binding partners.

Dissection multi-signalisation Complexes protéiques par Purification d’affinité de complémentation bimoléculaire (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.