Ce travail a été financé par le NIH aux subventions EY005102 SCM et EY018640 à CPR

1. Intact préparation rétine neurale pour les poissons rouges, les souris et les lapins <ol><li> Effectuez toutes les étapes suivantes, y compris ceux décrits dans &quot;2) Coupez-loading», sous ambiante constante (au fond) d&#39;illumination. S&#39;il vous plaît noter que pour les fins du présent protocole, les procédures sont décrites comme étant effectuées dans l&#39;obscurité constante (c&#39;est à dire sous très sombre (c&#39;est à dire «scotopique») des conditions ≤ 0,0001 lux) en utilisant des lunettes de vision nocturne à infrarouge, mais d&#39;autres niveaux d&#39;intensité plus élevée de l&#39;illumination ambiante constante peut être utilisé au lieu de déterminer l&#39;effet des autres niveaux d&#39;éclairage ambiant sur la jonction lacunaire traceur accouplement. </li><li> Dark-adaptation de l&#39;animal expérimental (poissons rouges, souris ou de lapin) pendant au moins 1 heure avant la chirurgie. </li><li> Comme décrit précédemment 7, profondément anesthésier les poissons rouges en les plaçant dans tricaïne méthanesulfonate (MS222, 150 mg / L d&#39;eau du réservoir de poissons tamponnée (bicarbonate de sodium contenant)), et profondément anesthésier les souris avec de la kétamine (100 mg/ Kg, ip) et Rompun (10 mg / kg, ip). Profondément anesthésier le lapin à l&#39;uréthane (dose de charge: 2,0 g / kg, ip) et aussi utiliser une anesthésie locale intraorbitaire (2% Xylocaine), comme décrit précédemment 8. Toutes les procédures expérimentales impliquant le soin et l&#39;utilisation d&#39;animaux doit être effectué conformément aux directives fédérales et d&#39;être examinées et approuvées par les soins des animaux de l&#39;université locale et les comités de l&#39;utiliser. (Remarque:. Dans les expériences décrites ici, toutes les procédures d&#39;expérimentation impliquant le soin et l&#39;utilisation des poissons, des souris et des lapins ont été effectuées en conformité avec les directives du NIH et ont été examinés et approuvés par l&#39;Ohio State University en soins des animaux et du Comité institutionnel Utilisations) </li><li> Pour les poissons, les souris et les lapins, après énucléation, retirez la partie antérieure de chaque globe oculaire. Ensuite, placez un morceau de papier filtre sur le dessus de la partie postérieure de l&#39;œil et inverser le papier filtre et les yeux, de sorte que le papier-filtre se trouve sous la partie postérieure de l&#39;œil. Puis, en utilisant bienpince disséquer la rétine intacte neurones de la partie postérieure de l&#39;œil par un léger arrachement de l&#39;épithélium pigmentaire / choroïde / sclérotique, qui sont attachés les uns aux autres, de la rétine neurale, qui est fixé sur le papier filtre. Comme cela est fait, couper le nerf optique à l&#39;aide fines ressort des ciseaux. La rétine neurale, orientée photorécepteur vers le haut, doit maintenant être fixé sur le papier filtre et séparé du reste de l&#39;œil. </li></ol> 2. Coupez-chargement <ol><li> Immerger les rétines dans une solution oxygénée Ringer (tableau 1) dans une plaque à 6 puits (~ 5 ml / puits) pendant 30 min sous ambiante constante (au fond) d&#39;éclairage (par exemple sous très sombre (c&#39;est à dire «scotopique») conditions) avec ou sans un médicament d&#39;essai. Maintenir rétines de poissons dans oxygénée (5% de CO 2 / 95% O 2) à base de bicarbonate de Ringer à 22 ° C en scellant la plaque de 6 puits avec du parafilm et de maintenir la rétine de souris et le lapin à 36 ° C dans un 5% de CO 2 / 95% d&#39;O <sub&gt; 2 incubateur. Quand un médicament expérimental est utilisé, il doit être présent durant toutes les étapes suivantes jusqu&#39;à la fixation </li><li> Préparer la solution de traceur (typiquement 100 uL) en dissolvant neurobiotin (0,5%), une molécule biotinylée, dans la solution de Ringer immédiatement avant la coupe à travers la rétine. Notez que 0,5% de rhodamine dextrane (élevé (&gt; 10 000) MW) peut être ajouté à la solution. Grâce à son poids moléculaire élevé, la rhodamine dextran ne traverse pas les jonctions et seulement les cellules des étiquettes qui ont été endommagés par la coupe. Comme indiqué dans la Fig. 3, c&#39;est un moyen utile pour distinguer les cellules qui ont accumulé neurobiotin parce qu&#39;ils ont été blessés, de ceux qui ont accumulé le traceur par diffusion à travers les jonctions communicantes. </li><li> Placer la solution neurobiotin sur un verre (ou plastique) boîte de Pétri, appuyez sur le papier filtre, à laquelle la rétine est attaché, sur un papier absorbant pour enlever l&#39;excès de Ringer, tremper une lame de rasoir (ou autre lame tranchante) dans la solution et neurobiotin l&#39;n faire une coupe radiale à travers la rétine et du papier filtre. Si l&#39;on préfère, les entretoises peuvent être utilisés de telle sorte que la coupe est faite à travers la rétine, mais pas le papier filtre. La coupe doit être orientée perpendiculairement à la surface de la rétine. Trempez la lame de rasoir dans la solution neurobiotin nouveau et couper la rétine une seconde fois. Répétez cette jusqu&#39;à 4 coupes par la rétine (voir fig. 1). Utiliser un microscope à dissection lors des coupes de rasoir grâce à la souris et autres petits rétines. </li><li> Comme indiqué dans la Fig. 1, submerger la rétine à nouveau dans le milieu de Ringer frais, avec ou sans médicament d&#39;essai, en utilisant une plaque de 6 puits (5 ml Ringer / puits). Incuber la rétine pendant 15 min pour permettre le chargement et la diffusion. </li><li> Laver trois fois pendant 5 min chacun avec un milieu de Ringer frais avec ou sans médicament testé. </li><li> Fixer la rétine avec du paraformaldéhyde 4% dans un tampon phosphate à 0,1 M (PBS, pH 7,4) pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Laver avec 0,1 M PBS pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> Le jour suivant, réagissent wvec 2% streptavidine-Alexa 488 (concentration finale 10 pg / ml) dans 0,1 M PBS + 0,3% de Triton X-100, et de garder une nuit à 4 ° C. </li><li> Laver trois fois chacune pendant 10 minutes avec 0,1 M de PBS à température ambiante </li><li> En PBS, détacher la rétine du papier filtre et ensuite, en utilisant un pinceau fin, placer la rétine, orientée photorécepteur vers le haut, sur une lame. </li><li> Doucement monter avec Vectashield milieu de montage (Vector Laboratories, Burlingame, CA). </li><li> Prenez des photos avec un microscope confocal à balayage laser (par exemple Zeiss 510 META) à l&#39;agrandissement, la même résolution et les paramètres pour chaque condition expérimentale, afin que vous puissiez comparer les effets de différentes conditions expérimentales (par exemple test de médicaments, les conditions d&#39;éclairage) sur l&#39;étendue des l&#39;écart de jonction traceur d&#39;accouplement (Fig. 2A-C et fig. 4A-C). Bien que d&#39;une seule image peut contenir toutes les cellules marquées, il est recommandé que vous collectez un z-stack de la zone d&#39;intérêt et de s&#39;effondrer en un seull&#39;image. </li></ol> 3. Quantification des traceurs de couplage utilisant ImageJ <ol><li> Dans le navigateur d&#39;image LSM, ouvrez l&#39;image, cliquez sur Exporter et enregistrez l&#39;image comme un peu TIF-16 PAS fichier compressé. La barre d&#39;échelle devraient être inclus dans cette image TIF. </li><li> Utiliser NIH ImageJ logiciels, de mesurer l&#39;intensité de fluorescence d&#39;Alexa-488-étiquetés neurobiotin à faible grossissement des images de toute monture rétines. Ouvrez le fichier TIF en utilisant le logiciel ImageJ puis tracer une ligne droite correspondant à la barre d&#39;échelle. Aller à la ANALYSER, SET SCALE et entrez la distance connue et l&#39;unité de longueur, puis cliquez sur OK. Maintenant les résultats de mesure peuvent être présentés dans des unités étalonnées, comme millimètres. </li><li> Sélectionnez la zone d&#39;intérêt en utilisant l&#39;outil de sélection rectangulaire. Le pic de fluorescence doit être placé à la bordure gauche de votre sélection. Assurez-vous qu&#39;il n&#39;ya pas de signal de fluorescence près de la frontière droite. Si non, faire pivoter l&#39;image active (IMAGE, puis tourner). </li><li> CliquezAnalyser et diagramme des profils. Vous devriez voir une courbe avec une décroissance exponentielle de la gauche vers la droite. </li><li> Cliquez sur Copier dans la fenêtre pop-up et le coller dans EXCEL. Maintenant, vous voyez deux colonnes indiquant la distance de la coupe (colonne de gauche) et l&#39;intensité de fluorescence en fonction de la distance de la coupe (colonne de droite). </li><li> Diviser chaque valeur brute de fluorescence par la valeur maximale de fluorescence pour obtenir l&#39;intensité relative de fluorescence. </li><li> Copiez deux colonnes correspondant à la distance de la coupe (X) et l&#39;intensité de fluorescence relative (Y), puis les coller dans le logiciel Origin. </li><li> Fit avec la décroissance exponentielle # 1 fonction (fig. 2D et figure 4D.), Qui est de la forme: Y = Y 0 + Y max * exp (-x / λ) où Y est l&#39;intensité relative de fluorescence, Y o est la fluorescence de fond, Y max est la fluorescence maximale relative, λ est le spACE (longueur) et constante, et x est la distance de la coupe. </li><li> Comparez la constante d&#39;espace (λ) des valeurs à différentes conditions expérimentales en utilisant le test t ou analyse de variance (fig. 2E et Fig. 4E). Notez que les techniques alternatives de quantification ont été décrits par d&#39;autres 13,14. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Des exemples représentatifs de traceur de cellules photoréceptrices de couplage tel que déterminé par la coupe de chargement sont présentés dans les figures 2 et 3 (poissons) et la figure 4 (le lapin). Images confocale ont été prises avec les mêmes réglages pour la comparaison (Fig. 2A-C et fig. 4A-C) et l&#39;intensité de fluorescence a été tracée en fonction de la distance entre le coupé et monté par la fonction exponentielle montré au n ° 3.8 ci-dessus (Fig. 2D et Fig. 4D). Des valeurs constantes de l&#39;espace pour chaque conditionsont présentés aux figures 2E et 4E, ce qui montre que l&#39;ampleur de la jonction lacunaire traceur couplage peut être quantifiée en utilisant la technique du cut-chargement. En outre, les résultats sont hautement reproductibles. L&#39;utilisation de la technique du cut-chargement comme un moyen de quantifier l&#39;ampleur de la jonction lacunaire traceur couplage est également validé par la constatation que l&#39;intensité de fluorescence décroît exponentiellement en fonction de la distance de la coupe dans tous les cas examinés 7,8 (voir aussi fig. 2D et 4D ici), ce qui indique que les photorécepteurs neurobiotin entrés via la coupe au rasoir et non à partir d&#39;autres sites de la rétine. Par ailleurs, l&#39;qualitativement similaire jour / nuit de différence dans le couplage des photorécepteurs traceur cellulaire observée chez les poissons rouges avec des injections traçantes en cônes unique et avec une coupe de chargement 7 corrobore coupe de chargement comme un moyen relativement précise de mesurer l&#39;étendue du couplage des photorécepteurs. La coupe-Ltechnique de oading peuvent également être utilisées pour étudier d&#39;autres types de synapses électriques dans la rétine. Par exemple, la figure 5 montre que le lapin de type A (figure 5A) et de type B (Fig. 5B), les cellules horizontales présentent homologues traceur couplage suivante coupe le chargement et la diffusion de neurobiotin adaptés à l&#39;obscurité sous conditions. <table border="1"><tbody><tr><td> Composé </td><td> Poissons </td><td> Souris </td><td> Lapin </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 130 </td><td> 120 </td><td> 117 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 20 </td><td> 25 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> - </td><td> 1 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> KCL </td><td> 2.5 </td><td> 5 </td><td> 3.1 </td></tr><tr><td> Le glucose </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MgSO 4 7H 2 O- </td><td> - </td><td> 1 </td><td> 1.2 </td></tr><tr><td> La glutamine </td><td> - </td><td> 0.1 </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 0.7 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> Tableau 1: Composition des solutions de la Ringer pour les poissons rouges, la souris et le lapin rétines. Les concentrations sont présentés en mM. Les solutions de Ringer sont buller avec 5% de CO 2 / 95% O 2 et maintenue à 22 ° C (poissons) ou 36 ° C (mammifères). &quot;-&quot;: Pas inclus dans le Ringer pour cette espèce. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig1.jpg" /> Figure 1:. Organigramme montrant la procédure limite de chargement. Après isolement of la rétine neurale intactes, plusieurs coupures radiales ont été faites par une lame qui a été trempé dans une solution neurobiotin 0,5%. La rétine a été incubé pendant le chargement traceurs et de diffusion, puis lavés avant la fixation au paraformaldéhyde 4% (PFA) en tampon phosphate 0,1 M (PB). Tracer couplage a été examiné en utilisant la streptavidine conjuguée à Alexa-488. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig2.jpg" /> Figure 2. Jour-nuit différence de photorécepteur traceur couplage dans le poisson rouge est révélée par la technique du cut-chargement. Photorécepteur écart de jonction neurobiotin traceur couplage a été étendue à la nuit (B) et dans les jours suivant l&#39;application de spipérone (10 M), un antagoniste sélectif de dopamine D receptor 2 (C), mais pas dans la journée dans des conditions de contrôle (A). D) normalisé intensité relative fluorescentes en fonction de la distance entre les coupes (indiquées par des flèches en AC). Val espace E) constantUES obtenue à partir des données des expériences D et d&#39;autres (n = 4). *** P &lt;0,001. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig3.jpg" /> Figure 3. Un exemple représentatif montrant la fluorescence dans la couche de cellules photoréceptrices de la rétine, adaptés à l&#39;obscurité, la nuit suivante goldfish coupé de chargement avec une solution de deux neurobiotin et la rhodamine dextrane. Rhodamine dextrane (en rouge), qui ne diffuse pas à travers l&#39;ouverture de canaux de jonction écart en raison de son poids moléculaire élevé (&gt; 10 000 MW), seules les cellules étiquetées près de la coupe. En revanche, neurobiotin (représenté en vert) diffusé à travers les jonctions communicantes et peuvent être vus dans les cellules photoréceptrices loin de la coupe. L&#39;emplacement de la coupe est indiquée par la flèche dans chaque panneau. Barre d&#39;échelle: 200 um. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig4.jpg" /> Figure 4. Jour-nuit diffèrentrence dans les photorécepteurs de la rétine de couplage traceur lapin est révélée par la technique du cut-chargement. Photorécepteur écart de jonction neurobiotin traceur couplage a été étendue à la nuit (B) et dans les jours suivant l&#39;application de spipérone (10 uM) (C), mais pas dans la journée dans des conditions de contrôle (A). En courant alternatif, les vues perpendiculaires de la reconstruction 3D des photorécepteurs de lapin près de la coupe sont représentés. D) normalisé intensité relative fluorescentes en fonction de la distance entre les coupes. E) Les valeurs de l&#39;espace constante obtenue à partir des données dans des expériences de développement et d&#39;autres (n = 3). *** P &lt;0,001. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig5.jpg" /> Figure 5. Couper le chargement révèle que adaptés à l&#39;obscurité des cellules de lapin sont horizontaux traceurs couplés. Les deux de type A (A) et de type B (B) des cellules horizontales adaptés à l&#39;obscurité rétines de lapin exposées homologues neurobiotin traceur accouplement.

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	<li>Bennett, M. V. L., Zukin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+coupling+and+neuronal+synchronization+in+the+mammalian+brain.">Electrical coupling and neuronal synchronization in the mammalian brain.</a> Neuron. 41, 495-511 (2004).</li><li>Connors, B. W., Long, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+synapses+in+the+mammalian+brain.">Electrical synapses in the mammalian brain.</a> Annu. Rev. Neurosci. 27, 393-418 (2004).</li><li>Vaney, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Many+diverse+types+of+retinal+neurons+show+tracer+coupling+when+injected+with+biocytin+or+Neurobiotin.">Many diverse types of retinal neurons show tracer coupling when injected with biocytin or Neurobiotin.</a> Neurosci. Lett. 125, 187-190 (1991).</li><li>Bloomfield, S. A., V&#246;lgyi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+functional+roles+and+regulation+of+neuronal+gap+junctions+in+the+retina.">The diverse functional roles and regulation of neuronal gap junctions in the retina.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 495-506 (2009).</li><li>Weiler, R., Pottek, M., He, S., Vaney, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+coupling+between+retinal+horizontal+cells+by+retinoic+acid+and+endogenous+dopamine.">Modulation of coupling between retinal horizontal cells by retinoic acid and endogenous dopamine.</a> Brain. Res. Brain. Res. Rev. 32, 121-129 (2000).</li><li>Xin, D., Bloomfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+nitric+oxide+on+horizontal+cells+in+the+rabbit+retina.">Effects of nitric oxide on horizontal cells in the rabbit retina.</a> Vis. Neurosci. 17, 799-811 (2000).</li><li>Ribelayga, C., Cao, Y., Mangel, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circadian+clock+in+the+retina+controls+rod-cone+coupling.">The circadian clock in the retina controls rod-cone coupling.</a> Neuron. 59, 790-801 (2008).</li><li>Ribelayga, C., Mangel, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+circadian+clock-controlled+neural+pathway+in+the+rabbit+retina.">Identification of a circadian clock-controlled neural pathway in the rabbit retina.</a> PLoS One. 5, e11020-e11020 (2010).</li><li>Ouyang, X., Winbow, V. M., Patel, L. S., Burr, G. S., Mitchell, C. K., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+A+mediates+regulation+of+gap+junctions+containing+connexin35+through+a+complex+pathway.">Protein Kinase A mediates regulation of gap junctions containing connexin35 through a complex pathway.</a> Brain. Res. Mol. Brain. Res. 135, 1-11 (2005).</li><li>Patel, L. S., Mitchell, C. K., Dubinsky, W. P., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+gap+junction+coupling+through+the+neuronal+connexin+Cx35+by+nitric+oxide+and+cGMP.">Regulation of gap junction coupling through the neuronal connexin Cx35 by nitric oxide and cGMP.</a> Cell. Commun. Adhes. 13, 41-54 (2006).</li><li>Peters, J. L., Cassone, V. M., Zoran, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+modulates+intercellular+communication+among+cultured+chick+astrocytes.">Melatonin modulates intercellular communication among cultured chick astrocytes.</a> Brain. Res. 1031, 10-19 (2005).</li><li>Cusato, K., Bosco, A., Rozental, R., Guimar&#227;es, C. A., Reese, B. E., Linden, R., Spray, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+mediate+bystander+cell+death+in+developing+retina.">Gap junctions mediate bystander cell death in developing retina.</a> J. Neurosci. 23, 6413-6422 (2003).</li><li>Li, H., Chuang, A. Z., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+coupling+is+controlled+by+connexin+35+phosphorylation+in+zebrafish+retina.">Photoreceptor coupling is controlled by connexin 35 phosphorylation in zebrafish retina.</a> J. Neurosci. 29, 15178-15186 (2009).</li><li>Mills, S. L., Massey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetics+of+tracer+movement+through+homologous+gap+junctions+in+the+rabbit+retina.">The kinetics of tracer movement through homologous gap junctions in the rabbit retina.</a> Vis. Neurosci. 15, 765-777 (1998).</li><li>Mills, S. L., Massey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+biotinylated+tracers+distinguishes+three+types+of+gap+junction+in+retina.">A series of biotinylated tracers distinguishes three types of gap junction in retina.</a> J. Neurosci. 20, 8629-8636 (2000).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

La méthode de coupe de chargement décrite ici est une technique utile et simple pour déterminer l&#39;étendue de couplage traceur fossé jonction entre les neurones rétiniens dans des conditions d&#39;illumination différentes et à différents moments de la journée et la nuit. Avantages de cette technique incluent la possibilité de quantifier l&#39;ampleur du couplage traceur écart de jonction entre les neurones dans le tissu rétinien intactes sous une variété de conditions d&#39;éclairage pendant le jour et la nuit et de le faire pour les neurones qui ont couplé soma petit diamètre. Limites de la technique dans l&#39;étude des jonctions gap à l&#39;automne des tissus intacts dans deux catégories générales. Premièrement, la diffusion traceur à travers les jonctions ouvertes peuvent être relativement difficiles à observer à cause de a) le faible diamètre de la charge ou associés à des canaux ouverts et b) les volumes relatifs des compartiments cellulaires couplées 1,14,15. Autrement dit, la diffusion du traceur dans une petite cellule à une plus grande cellule ou un groupe de cellules couplées, compARED à la diffusion de traceurs d&#39;une cellule plus grande à une petite cellule, peut-être plus difficile à détecter en raison de la dilution du traceur. Deuxièmement, dans certaines conditions physiologiques, l&#39;étendue de la diffusion de traceur à travers des jonctions communicantes dans les tissus intacts peut ne pas refléter avec précision la force de la conductance jonctions lacunaires en raison de différences dans la conductance des petits porteurs de courant électrique d&#39;ions, par rapport à la perméabilité de traceur relativement importante molécules 1,14,15. En général, les preuves de traceur couplage suggère fortement la présence de fonctionnement, ouvrir des canaux de jonction lacunaire, mais sous certaines conditions physiologiques, la diffusion traceur peut pas se produire ou être observée même si les enregistrements électrophysiologiques suggèrent la présence de fonctionnement, les jonctions ouvertes. Il semble probable que la technique du cut-chargement peut également être utilisé pour étudier l&#39;ampleur du couplage traceur écart de jonction entre les neurones dans le tissu intact depuis d&#39;autres régions du système nerveux centralTEM.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Méthanesulfonate de tricaïne (MS222) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5040 </td><td> 150 mg / L d&#39;eau du réservoir tampon de poisson </td></tr><tr><td> Uréthane </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U2500 </td><td> 2 g / dose kgloading </td></tr><tr><td> Double lunettes de vision nocturne Tube </td><td> Nuit Optique Unis </td><td> D-221 </td><td></td></tr><tr><td> Papier filtre, n ° 4 e année </td><td> Whatman </td><td> 1004-090 </td><td></td></tr><tr><td> Pinces fines, Dumont n ° 5, Biologie, 11 cm de long </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11295-10 </td></tr><tr><td> Ciseaux fins, à ressort, lame 8 mm, droit </td><td> Outils Fine Science </td><td> 15025-10 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Neurobiotin </td><td> Vecteur </td><td> SP-1120 </td><td> 0,5% </td></tr><tr><td> Streptavidine conjuguée à Alexa 488 </td><td> Invitrogen </td><td> S11223 </td><td> 2% </td></tr><tr><td> Dextran rhodamine (élevé (&gt; 10 000) MW) </td><td> Invitrogen </td><td> D1817 </td><td> 0,5% </td></tr><tr><td> Vectashield milieu de montage </td><td> Vecteur </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Zeiss 510 Laser META microscope confocal à balayage </td><td> Carl Zeiss, Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LSM-5 Image Browser 3,2,0,115 </td><td> Carl Zeiss, Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Logiciel ImageJ </td><td> NIH </td><td></td><td></td></tr><tr><td> OriginPro 8.0 </td><td> OriginLab Corp </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cut-loading: a useful tool for examining the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons

En plus de la transmission synaptique chimique, les neurones qui sont connectés par des jonctions communicantes peuvent aussi communiquer rapidement via la transmission synaptique électrique. En plus de preuves indiquent que les jonctions non seulement permettent la circulation du courant électrique et l&#39;activité synchrone entre des cellules interconnectées ou couplés, mais que la force ou l&#39;efficacité de la communication électrique entre les cellules couplées peuvent être modulées à une grande mesure 1,2. En outre, le grand diamètre interne (~ 1,2 nm) de nombreux canaux de jonction lacunaire permet non seulement de flux de courant électrique, mais aussi la diffusion des molécules de signalisation intracellulaire et des métabolites de petites cellules interconnectées entre, de sorte que les jonctions de communication peut également servir de médiateur métaboliques et chimiques . La force de la communication entre les neurones jonctions lacunaires et sa modulation par les neurotransmetteurs et d&#39;autres facteurs peuvent être étudiés par l&#39;enregistrement simultanément électriquement à partir de cellules couplées et en déterminant tIl mesure la diffusion des molécules traceur, qui sont perméables jonction lacunaire, mais pas de membrane perméable, après l&#39;injection iontophorétique en cellules simples. Toutefois, ces procédures peuvent être extrêmement difficiles à réaliser sur les neurones avec des petits corps cellulaires dans le tissu neural intact. De nombreuses études sur les synapses électriques et la modulation de communication électrique ont été menées dans la rétine des vertébrés, puisque chacun des cinq types de neurones rétiniens est reliée électriquement par jonctions lacunaires 3,4. Plus de preuves a montré que le rythme circadien (24 heures) d&#39;horloge dans la rétine et des changements dans la stimulation lumineuse réguler jonction lacunaire couplage 3-8. Par exemple, des travaux récents ont démontré que l&#39;horloge circadienne rétine diminue raccord de jonction écart entre la tige et les cellules photoréceptrices cône pendant la journée, en augmentant l&#39;activation des récepteurs dopaminergiques D2, et augmente considérablement la tige-cône de couplage de la nuit en réduisant l&#39;activation du récepteur D2 <sup&gt; 7,8. Cependant, non seulement ces études extrêmement difficiles à réaliser sur les neurones avec des petits corps cellulaires intactes tissu rétinien de neurones, mais il peut être difficile de contrôler adéquatement les conditions d&#39;illumination pendant l&#39;étude électrophysiologique des neurones rétiniens simples pour éviter la lumière induit des changements dans la jonction lacunaire conductance. Ici, nous présentons une méthode simple de déterminer le degré de couplage traceur fossé jonction entre les neurones rétiniens dans des conditions d&#39;illumination différentes et à différents moments de la journée et la nuit. Cette technique du cut-chargement est une modification de chargement gratter 9-12, qui est basé sur le colorant de charge et de diffusion à travers l&#39;ouverture de canaux de jonction écart. Grattez de chargement fonctionne bien dans des cellules en culture, mais pas en tranches épaisses comme les rétines intactes. La technique du cut-chargement a été utilisée pour étudier couplage des photorécepteurs dans les poissons et les mammifères intactes des rétines 7, 8,13, et peut être utilisé pour étudier le couplage entred&#39;autres neurones de la rétine, comme décrit ici.

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Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

Une méthode facile et pratique pour déterminer l&#39;étendue de couplage traceur fossé jonction entre les neurones rétiniens est décrite. Cette technique permet d&#39;étudier la fonction des synapses électriques entre les neurones dans la rétine intacte sous différentes conditions d&#39;éclairage et à différents moments de la journée et la nuit.

Coupez-chargement: Un outil utile pour examiner l&#39;étendue du couplage Tracer Gap jonction entre neurones rétiniens

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.3K vues.  Ohio State University College of Medicine. Une méthode facile et pratique pour déterminer l'étendue de couplage traceur fossé jonction entre les neurones rétiniens est décrite. Cette technique permet d'étudier la fonction des synapses électriques entre les neurones dans la rétine intacte sous différentes conditions d'éclairage et à différents moments de la journée et la nuit.

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Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Enregistrements Patch Clamp à partir de neurones rétiniens souris dans une préparation adaptés à l&#39;obscurité Slice

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Recherche

Neurosciences

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Dissection d&#39;un oeil de la souris pour un mont entiers de l&#39;épithélium pigmentaire rétinien

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and gene expression programs for extremely rare cell subsets has been a challenge using standard whole-tissue approaches. Gene expression profiling of individual cells allows for unprecedented access to cell types that comprise only a small percentage of the total tissue1-7. In addition, this technique can be used to examine the gene expression programs that are transiently expressed in small numbers of cells during dynamic developmental transitions8.
This issue of cellular diversity arises repeatedly in the central nervous system (CNS) where neuronal connections can occur between quite diverse cells9. The exact number of distinct cell types is not precisely known, but it has been estimated that there may be as many as 1000 different types in the cortex itself10. The function(s) of complex neural circuits may rely on some of the rare neuronal types and the genes they express. By identifying new markers and helping to molecularly classify different neurons, the single-cell approach is particularly useful in the analysis of cell types in the nervous system. It may also help to elucidate mechanisms of neural development by identifying differentially expressed genes and gene pathways during early stages of neuronal progenitor development.
As a simple, easily accessed tissue with considerable neuronal diversity, the vertebrate retina is an excellent model system for studying the processes of cellular development, neuronal differentiation and neuronal diversification. However, as in other parts of the CNS, this cellular diversity can present a problem for determining the genetic pathways that drive retinal progenitors to adopt a specific cell fate, especially given that rod photoreceptors make up the majority of the total retinal cell population11. Here we report a method for the identification of the transcripts expressed in single retinal cells (Figure 1). The single-cell profiling technique allows for the assessment of the amount of heterogeneity present within different cellular populations of the retina2,4,5,12. In addition, this method has revealed a host of new candidate genes that may play role(s) in the cell fate decision-making processes that occur in subsets of retinal progenitor cells8. With some simple adjustments to the protocol, this technique can be utilized for many different tissues and cell types.

A method for the isolation of single retinal cells and subsequent amplification of their cDNAs is described. Single-cell transcriptomics reveals the degree of cellular heterogeneity present in a tissue and uncovers new marker genes for rare cell populations. The accompanying protocol can be adjusted to suit many different cell types.

Une seule cellule de profilage de développer et d&#39;âge mûr neurones de la rétine

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis

Antibodies provide the ability to gain novel insight into various events taking place in living systems. The ability to produce highly specific antibodies to target proteins has allowed for very precise biological questions to be addressed. Importantly, antibodies have been implicated in the pathogenesis of a number of human diseases including systemic lupus erythematosus (SLE), rheumatoid arthritis (RA), paraneoplastic syndromes, multiple sclerosis (MS) and human T-lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP) 1-9. How antibodies cause disease is an area of ongoing investigation, and data suggests that interactions between antibodies and various intracellular molecules results in inflammation, altered cellular messaging, and apoptosis 10. It has been shown that patients with MS and HAM/TSP produce autoantibodies to the intracellular RNA binding protein heterogeneous ribonuclear protein A1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. Recent data indicate that antibodies to both intra-neuronal and surface antigens are pathogenic 3, 5-9, 11. Thus, a procedure that allows for the study of intracellular antibody:protein interactions would lend great insight into disease pathogenesis.
Genes are commonly transfected into primary cells and cell lines in culture, however transfection of antibodies into cells has been hindered by alteration of antibody structure or poor transfection efficiency 12. Other methods of transfection include antibody transfection based on cationic liposomes (consisting of DOTAP/DOPE) and polyethylenimines (PEI); both of which resulted in a ten-fold decrease in antibody transfection compared to controls 12. The method performed in our study is similar to cationic lipid-mediated methods and uses a lipid-based mechanism to form non-covalent complexes with the antibodies through electrostatic and hydrophobic interactions 13. We utilized Ab-DeliverIN reagent, which is a lipid formulation capable of capturing antibodies through non-covalent electrostatic and hydrophobic interactions and delivering them inside cells. Thus chemical and genetic couplings are not necessary for delivery of functional antibodies into living cells. This method has enabled us to perform various antibody tracing and protein localization experiments, as well as the analyses of the molecular consequences of intracellular antibody:protein interactions 9.
In this protocol, we will show how to transfect antibodies into neurons rapidly, reproducibly and with a high degree of transfection efficiency. As an example, we will use anti-hnRNP A1 and anti-IgG antibodies. For easy quantification of transfection efficiency we used anti-hnRNP A1 antibodies labelled with Atto-550-NHS and FITC-labeled IgG. Atto550 NHS is a new label with high molecular absorbtion and quantum yield. Excitation source and fluorescent filters for Atto550 are similar to Cy3 (Ex. 556 Em. 578). In addition, Atto550 has high photostability. FITC-labeled IgG were used as a control to show that this method is versatile and not dye dependent. This approach and the data that is generated will assist in understanding of the role that antibodies to intracellular target antigens might play in the pathogenesis of human diseases.

A rapid approach to investigate interactions and effects on molecular mechanisms related to the presence of antibodies in an intracellular environment is described. The method involves transfection of antibodies into live cells using a non-covalent complex formation based on a lipid formulation. The technique is adaptable to immortalized cell lines and primary cells.

La transfection d&#39;anticorps dans les neurones comme outil pour étudier la pathogenèse des maladies

Antibodies provide the ability to gain novel insight into various events taking place in living systems.  The ability to produce highly specific ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Rapide Micro-iontophorèse de glutamate et le GABA: un outil utile d&#39;étudier l&#39;intégration synaptique

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

A Dual Tracer PET-MRI Protocol for the Quantitative Measure of Regional Brain Energy Substrates Uptake in the Rat

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the rat. The developed method is a small-animal positron emission tomography (PET) protocol, in which&#160;11C-AcAc and 18F-fluorodeoxyglucose (18F-FDG) are injected sequentially in each animal. This dual tracer PET acquisition is possible because of the short half-life of 11C (20.4 min). The rats also undergo a magnetic resonance imaging (MRI) acquisition seven days before the PET protocol. Prior to image analysis, PET and MRI images are coregistered to allow the measurement of regional cerebral uptake (cortex, hippocampus, striatum, and cerebellum). A quantitative measure of 11C-AcAc and 18F-FDG brain uptake (cerebral metabolic rate; &#956;mol/100 g/min) is determined by kinetic modeling using the image-derived input function (IDIF) method. Our new dual tracer PET protocol is robust and flexible; the two tracers used can be replaced by different radiotracers to evaluate other processes in the brain. Moreover, our protocol is applicable to the study of brain fuel supply in multiple conditions such as normal aging and neurodegenerative pathologies such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases.

Small-animal positron emission tomography enables the assessment of the brain&#39;s two main energy substrates:&#160;glucose and ketones. In the present method, 11C-acetoacetate and 18F-fluorodeoxyglucose are injected sequentially in each animal, and their uptake is measured quantitatively in specific brain regions determined from the magnetic resonance images.

Un protocole double Tracer TEP-IRM pour la mesure quantitative de la régionale cerveau substrats énergétiques absorption chez le rat

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and subsequently digests this material, commonly through lysosomal degradation. Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) whose phagocytic function has been described in a broad range of conditions from neurodegenerative disease (e.g., beta-amyloid clearance in Alzheimer&#8217;s disease) to development of the healthy brain (e.g., synaptic pruning)1-6. The following protocol is an engulfment assay developed to visualize and quantify microglia-mediated engulfment of presynaptic inputs in the developing mouse retinogeniculate system7. While this assay was used to assess microglia function in this particular context, a similar approach may be used to assess other phagocytes throughout the brain (e.g., astrocytes) and the rest of the body (e.g., peripheral macrophages) as well as other contexts in which synaptic remodeling occurs (e.g. ,brain injury/disease).

Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) with a high capacity to phagocytose or engulf material in their extracellular environment. Here, a broadly applicable, reliable, and highly quantitative assay for visualizing and measuring microglia-mediated engulfment of synaptic components is described.

Un enlisement test: Un protocole pour évaluer les interactions entre les neurones du système nerveux central et les phagocytes

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Contrôle optique d&#39;une protéine Neuronal L&#39;utilisation d&#39;un acide aminé Unnatural génétiquement codificateur dans Neurones

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.

Préparation de la souris Retinal Cryo-sections pour l'immunohistochimie

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

A Standardized Pipeline for Examining Human Cerebellar Grey Matter Morphometry using Structural Magnetic Resonance Imaging

Multiple lines of research provide compelling evidence for a role of the cerebellum in a wide array of cognitive and affective functions, going far beyond its historical association with motor control. Structural and functional neuroimaging studies have further refined understanding of the functional neuroanatomy of the cerebellum beyond its anatomical divisions, highlighting the need for the examination of individual cerebellar subunits in healthy variability and neurological diseases. This paper presents a standardized pipeline for examining cerebellum grey matter morphometry that combines high-resolution, state-of-the-art approaches for optimized and automated cerebellum parcellation (Automatic Cerebellum Anatomical Parcellation using U-Net Locally Constrained Optimization; ACAPULCO) and voxel-based registration of the cerebellum (Spatially Unbiased Infra-tentorial Template; SUIT) for volumetric quantification. 
The pipeline has broad applicability to a range of neurological diseases and is fully automated, with manual intervention only required for quality control of the outputs. The pipeline is freely available, with substantial accompanying documentation, and can be run on Mac, Windows, and Linux operating systems. The pipeline is applied in a cohort of individuals with Friedreich ataxia (FRDA), and representative results, as well as recommendations on group-level inferential statistical analyses, are provided. This pipeline could facilitate reliability and reproducibility across the field, ultimately providing a powerful methodological approach for characterizing and tracking cerebellar structural changes in neurological diseases.

A standardized pipeline is presented for examining cerebellum grey matter morphometry. The pipeline combines high-resolution, state-of-the-art approaches for optimized and automated cerebellum parcellation and voxel-based registration of the cerebellum for volumetric quantification.

Un pipeline standardisé pour l’examen de la morphométrie de la matière grise cérébelleuse humaine à l’aide de l’imagerie par résonance magnétique structurelle

Multiple lines of research provide compelling evidence for a role of the cerebellum in a wide array of cognitive and affective functions, going far beyond ...