Ce protocole est conçu pour étudier la diaphonie des cellules épithéliales et des cellules immunitaires innées de première ligne, en particulier les cellules T innées, ce qui est notre intérêt. Des cellules primaires provenant de sources humaines sont utilisées dans cette technique, permettant une étude individuelle de la diaphonie physiologique pertinente à ce qui se passe chez l’homme. Les lymphocytes T innés ont été impliqués dans l’amélioration de la survie des patients infectés par la grippe.
Savoir comment ils sont activés pourrait aider à développer un traitement antigrippal et antiviral. Cette méthode est conçue pour identifier les facteurs qui peuvent activer les lymphocytes T innés, ce qui peut aider à développer des mesures préventives contre l’infection par le virus respiratoire. Au jour zéro, infecter les cellules épithéliales nasales humaines, ou HNEC.
Tout d’abord, comptez les cellules en ajoutant 150 microlitres de 1x trypsine EDTA à la chambre apicale de l’insert membranaire et 350 microlitres de 1x trypsine EDTA à la chambre basale du puits représentatif. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes ou jusqu’à ce que les cellules se détachent de la membrane. Rincez les cellules sur la membrane en pipetant de haut en bas et recueillez la suspension dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre.
Ajouter 200 microlitres de DMEM pour éteindre l’activité de la trypsine. Ensuite, comptez les cellules via la coloration bleu trypan. Calculez la multiplicité requise de l’infection, ou MOI, du virus en fonction du nombre de cellules par puits.
Diluer le stock de virus en conséquence avec un RPMI complet sur la glace. Pour les puits restants pour l’expérience d’infection, ajoutez un 1x DPBS dans les chambres apicales des inserts membranaires. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes et retirer le 1x DPBS.
Changez le milieu basal dans les inserts membranaires pour compléter le milieu RPMI en transférant les inserts sur une nouvelle plaque avec RPMI complet ajouté aux puits. Ajouter l’inoculum de virus préparé dans la chambre apicale de l’insert membranaire. Incuber à 35 degrés Celsius dans une atmosphère de dioxyde de carbone à 5% pendant une heure et retirer l’inoculum viral de la chambre apicale.
Changer le milieu basal de l’insert membranaire en milieu RPMI frais et incuber à 35 degrés Celsius dans une atmosphère de dioxyde de carbone à 5% pendant 24 à 72 heures. Ensemencez le nombre requis de cellules mononucléaires du sang périphérique, ou PBMC, dans un milieu RPMI complet en ajoutant directement la suspension pbMC dans la chambre basale de chaque puits de HNE infectés à partir du jour zéro. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 24 à 48 heures.
Pour recueillir le surnageant apical, ajoutez 1x DBPS à chaque chambre apicale et incubez à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, collectez le DPBS dans des tubes de 1,5 millilitre. Aliquotez le surnageant pour le dosage de la plaque dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et congelez immédiatement le stock et les aliquotes à moins 80 degrés Celsius.
Pour recueillir les HNECs sous forme d’ARN, transférez l’insert membranaire dans un puits propre. Ajouter le tampon de lyse de l’ARN à la chambre apicale et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Recueillir le surnageant dans un tube centrifuge de 1,5 millilitre et le stocker à moins 80 degrés Celsius jusqu’à l’extraction de l’ARN pour analyse moléculaire.
Enfin, récoltez les PBMC en grattant doucement la surface du puits avec la large base d’une pointe de pipette stérile pour déloger les PBMC activés qui peuvent adhérer à la surface du puits. Recueillir le milieu basal contenant des PBMC dans un tube de centrifugeuse de deux millilitres. Rincez les puits deux fois avec 300 microlitres de 1x DPBS et collectez le lavage dans le même tube de deux millilitres.
Centrifugez le tube de deux millilitres et recueillez le surnageant dans un tube frais de deux millilitres sans perturber la pastille de cellule. Conservez le surnageant aspiré à moins 80 degrés Celsius pour l’analyse des cytokines et des chimiokines. Remettez en suspension la pastille de cellule restante dans 200 microlitres de 1x DPBS.
Ce protocole peut être utilisé pour étudier les lymphocytes T innés après une infection grippale sans avoir besoin de cellules épithéliales et immunitaires provenant du même donneur. Un échantillon de la progression attendue des HNESPC à mesure qu’ils se développent sur la couche d’alimentation 3T3 est montré ici. Ceux-ci ont été utilisés pour la différenciation dans la culture d’interface air/liquide afin d’obtenir des HNEC multicouches avec des cellules fonctionnelles, ciliées et gobelet.
À l’aide des HNEC, l’activation des lymphocytes T innés peut être étudiée à l’aide de la cytométrie en flux. Ces résultats montrent la détection de cellules T invariantes associées aux muqueuses, ou cellules MAIT, V delta one, cellules gamma delta T et cellules T tueuses naturelles, ou cellules NKT. Ces cellules ont été significativement augmentées en co-culture impliquant des HNEC infectés par le virus de la grippe.
Cette configuration peut ensuite être appliquée à d’autres souches du virus de la grippe ou à des populations de cellules immunitaires innées pour observer leur activation respective dans des conditions de co-culture avec des cellules épithéliales infectées. Un calcul précis du nombre de cellules épithéliales nasales humaines pour s’assurer que la bonne multiplicité d’infection est utilisée est important pour des niveaux optimaux et le moment de l’activation. La diaphonie entre les cellules épithéliales et les cellules immunitaires innées attire de plus en plus l’attention, et cela peut être appliqué à toute autre méthode impliquant l’immunologie respiratoire aiguë ou chronique.
