Ce travail a été financé par des subventions aux DMH et TDM (NHMRC subventions de projet). DMH est Fellow Grimwade, financé par la Fiducie Miegunyah.

1. Préparation des cellules pour le marquage avec ReAsH / Flash <ol><li> En utilisant des méthodes standard de culture cellulaire pour votre lignée cellulaire d&#39;intérêt, de préparer une culture de cellules adhérentes directement dans une diapositive imagerie des cellules vivantes prêtes pour la transfection. </li><li> Transfecter votre plasmide contenant TC-taggés gène d&#39;intérêt en fonction de votre méthode de transfection de choix. </li></ol> Notez qu&#39;il est important d&#39;utiliser des contrôles positifs et négatifs afin d&#39;évaluer l&#39;ampleur de la liaison spécifique aux balises de TC et d&#39;évaluer des bleedthrough de fluorescence entre les canaux lors de la collecte micrographies confocale. Ainsi, pour deux couleurs (par exemple Flash / cerisier ou ReAsH / CFP ou ReAsH / GFP combinaisons), s&#39;assurer que les échantillons sont préparés pour une seule couleur (par exemple protéine fluorescente seul ou si possible une protéine TC-taggés lié à Flash / ReAsH mais sans fluorescentes protéines) <ol start="3"><li> Un à deux jours après la transfection, les rincer doucement les cellules avec 300 ul préchauffé (à 37 ° C) HBSS. </li><li> Doucement plonger les cellules avec 1 uM flash (ou ReAsH) dans 300 ul de HBSS préchauffée et 10 uM 1,2-éthanedithiol (HAE). </li></ol> Il est important d&#39;ajouter HAE abord avant d&#39;ajouter Flash / ReAsH et faire le tampon juste avant de l&#39;ajouter aux cellules. Incuber pendant exactement 30 minutes à 37 ° C dans le tissu de la culture incubateur. De nos jours l&#39;expérience d&#39;incubation plus longues augmente de manière significative la fluorescence de fond. Nouvelles constructions devraient également être optimisés pour l&#39;étiquetage du temps et Flash / ReAsH de concentration (0,5-2 uM). <ol start="5"><li> Aspirer doucement étiquetage solution à partir de cellules et ensuite le remplacer par 300 ul de HBSS préchauffé + 250 uM 2,3-dimercaptopropanol (BAL) pendant 15 min à 37 ° C. </li><li> Retirer la solution de lavage par aspiration douce et la remplacer par 300 ul de HBSS préchauffé. </li></ol> Après ce lavage, les cellules peuvent être fixées avec du paraformaldéhyde (15 min avec une solution de 3,2%), bien que nous avons constaté que cela augmente la fluorescence non-spécifique de teinture biarsenical. Ainsi nous avons l&#39;habitude d&#39;image des cellules vivantes à la température ambiante. (Notez que la fixation des cellules avant l&#39;étiquetage empêche la liaison de teinture biarsenical.) 2. Imagerie des cellules sur un microscope confocal <ol><li> Sur le microscope confocal, mis en place des paramètres pour l&#39;imagerie des fluorophores individuels (voir tableau 1) et s&#39;assurer qu&#39;il n&#39;y a bleedthrough négligeables entre les canaux. Ceci peut être réalisé en vérifiant fluorophores individuels (dans les échantillons de contrôle) contre chaque paramètre d&#39;acquisition fluorescents différents pour la fluorescence. Réglage de la longueur d&#39;onde d&#39;émission peut aider à minimiser bleedthrough (bien que cela peut également réduire le rapport signal / bruit). </li><li> Aussi régler les paramètres afin que les photomultiplicateurs de la fluorescence maximale dans l&#39;échantillon ne pas saturer le détecteur. (Ceci peut être détecté en utilisant le réglage de Q-LUT sur le SP2 confocale Leica). Une fois les meilleurs paramètres d&#39;imagerie sont déterminées, ne modifiez pas l&#39;un d&#39;eux entre les échantillons. </li><li> D&#39;autres paramètres nous utilisons habituellement (bien que ceux-ci peuvent être optimisés) sont une vitesse de balayage de 200 Hz et de recueillir 4 moyennes de ligne et d&#39;un diamètre de 1 unité sténopé Airy. Le diamètre sténopé peut être étendu si le signal / bruit est un problème, cependant, cela peut entraîner une certaine perte de l&#39;imagerie. </li><li> Recueillir les images confocales en 12 bits (ou supérieur) de format si possible. 12-bit de format capte une plus grande dynamique de valeurs (de 0 à 4095) pour chaque intensité d&#39;un pixel de 8 bits (0-255). Ceci est important pour assurer le plus riche ensemble de données est enregistrée, ce qui maximise la qualité de l&#39;analyse des données quantitatives. </li><li> Collecter des images pour le canal protéine fluorescente (Cherry, la GFP ou PCP) et aussi pour le canal biarsenical colorant (Flash ou ReAsH) pour tous les échantillons. </li></ol> 3. L&#39;analyse des données <ol><li> Installez le logiciel ImageJ sur votre ordinateur 8. <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </li><li> Assurez-vous que votre version d&#39;ImageJ a les plugins suivants: <ul><li> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/file-opener.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/file-opener.html</a> </li><li> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/image_correlator.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/image_correlator.html</a> </li><li> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lut-editor.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lut-editor.html</a> </li></ul></li><li> Ouvrez ImageJ, et si vous utilisez une version antérieure à v1.32c, cliquer sur les options suivantes pour activer des images multiples pour être ouverts en même temps (ce qui peut être fait en maintenant enfoncé le bouton de contrôle pendant que vous cliquez sur des fichiers différents): <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step1.jpg" alt="Figure 1" /></li><li> Ouvrez les images d&#39;intérêt dans ImageJ. ImageJ va définir automatiquement les intensités des pixels maximum et minimum qui sont affichés à l&#39;écran pour chaque image séparément. Étant donné que les différentes images auront dintensités des pixels DIFFÉRENTES, cela signifie que les images affichées ne sont pas comparables comme affichés. </li><li> Afin de s&#39;assurer que les images ouvertes sont tous sur la même échelle, vous pouvez définir le physique supérieure et inférieure intensités des pixels à afficher (cela ne changera pas le contenu des données réelles des images comme ce serait le cas dans certains autres logiciels). Ces valeurs peuvent être mis sous le menu suivant: <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step2.jpg" alt="Figure 2" /></li><li> Une approche alternative est de travailler avec des piles, ce qui met toutes les images ensemble en un seul fichier et automatiquement à l&#39;échelle (pour la visualisation) toutes les images dans la pile à la même échelle. La meilleure façon de travailler avec les données est de convertir chaque canal d&#39;une pile. Ainsi, pour le canal protéine fluorescente convertir tous à la pile comme indiqué. Vous pouvez facilement sélectionner un canal par l&#39;empilement de toutes les images contenant un nom commun (par exemple &quot;CH00&quot;) dans le titre. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step3.jpg" alt="Figure 3" /></li><li> Maintenant convertir toutes les images ouvertes à 8 bits pour l&#39;analyse. Ce sera effectivement redimensionner la gamme considérée dans une gamme 0-255 (qui définit 8-bit). IMPORTANT: Ne pas économiser plus de l&#39;original 12-bits (ou supérieur) de format ou vous perdrez le contenu de l&#39;information. Notez que certains logiciels ne peuvent afficher des images 8 bits pour ce format est utile pour faire des figures etc <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step4.jpg" alt="Figure 4" /></li><li> Enregistrer une copie dans un nouveau dossier appelé «8-bits convertis» en utilisant l&#39;option &quot;Enregistrer sous ...&quot; option. </li><li> Une méthode pour examiner l&#39;étendue de liaison de teinture biarsenical dans une image entière est d&#39;effectuer une parcelle d&#39;intensité des pixels de corrélation. Cette parcelles chaque valeur de pixel dans un canal par rapport à la valeur du pixel correspondant dans un deuxième canal. D&#39;où une position de pixel élevé dans la fluorescence de la PCP sera aussi élevé dans la fluorescence ReAsH s&#39;il y est élevé contraignant. </li><li> Pour analyser le pixel co-corrélation, assurez-vous que l&#39;ReAsH 8-bit et Cerulean / GFP images sont ouvertes dans ImageJ. </li><li> Ouvrez le &quot;corrélateur d&#39;image&quot; plugin comme indiqué ci-dessous. Sélectionnez &quot;Image1&quot; comme la pile ReAsH ou Flash et &quot;Image2&quot; comme la pile protéine fluorescente. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step5.jpg" alt="Figure 5" /></li><li> La pile qui en résulte peut pas afficher toutes les informations détaillées - ce qui est normal. Enregistrer la pile dans un nouveau dossier appelé &quot;Les diagrammes de dispersion&quot; et donnez lui le nom de fichier que l&#39;échantillon, il se réfère à (par exemple &quot;courbe de corrélation Flash-cerise&quot;) </li><li> Pour afficher les données de manière significative que vous pouvez faire une des deux options. D&#39;abord transformer les données afin qu&#39;il soit au format journal. Ensuite visuellement redimensionner les données comme suit: <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step6.jpg" alt="Figure 6" /></li><li> Alternativement, vous pouvez redimensionner les données visuelles pour ne montrer que de faibles valeurs (par exemple 1-255) et afficher les données en utilisant une LUT spéciaux. Une LUT (Look Up Table) représente une table de couleurs qui sont assignés à chaque valeur de pixel dans une image . Ceci peut être utilisé pour définir un schéma pseudo pour une image et est utile pour définir certaines caractéristiques dans une image. Pour créer un clic LUT personnalisé sur &quot;éditeur LUT» et en faire un nouveau comme celui montré (ce qui peut être sauvé et utilisé plus tard). <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step7.jpg" alt="Figure 7" /></li><li> Régler la plage de luminosité / contraste de 0-255 (comme décrit dans l&#39;étape 13 ci-dessus). Pour «verrouiller» l&#39;image comme à celle indiquée sur l&#39;écran, l&#39;image peut être convertis au format RVB qui enregistre une valeur de 8 bits pour chacune des couleurs rouge, vert et bleu de chaque pixel. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step8.jpg" alt="Figure 8" /> Pour copier et coller des images à d&#39;autres programmes d&#39;abord ouvrir les images 8-bit ou 16-bit. Comme décrit dans l&#39;étape 14 ci-dessus, attribuer une palette de couleurs LUT à l&#39;image. Pour la PCP, d&#39;attribuer le &quot;Cyan&quot; LUT comme décrit ci-dessous ... <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step9.jpg" alt="Figure 9" /></li><li> Sélectionnez l&#39;image et le copier dans le presse-papiers, sélectionnez ... <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step10.jpg" /></li></ol> 4. Les résultats représentatifs: Le succès des cellules de l&#39;étiquetage avec des colorants biarsenical dépend de quelques paramètres clés. Tout d&#39;abord, le calendrier de l&#39;étiquetage avec des colorants est cruciale. Nous avons constaté que de longues périodes de l&#39;étiquetage (plus de 30 min) se traduit par un niveau élevé de coloration de fond non spécifique. La figure 1 montre un résultat typique d&#39;une forme sauvage du fragment huntingtine (25Q) fusionnée à la CFP Cerulean dérivé contenant une balise de TC, comme décrit précédemment 7. Cet échantillon a été coloré pendant 30 min avec ReAsH et il ya peu de fond de l&#39;échantillon manque la balise TC. Nous avons constaté que la fixation des cellules au paraformaldéhyde augmente de fond tout en fixant avec du méthanol abroge la fluorescence de la balise protéine fluorescente. Ainsi là où c&#39;est possible, nous l&#39;image des cellules vivantes. Il est important de noter également que la fixation avantà l&#39;étiquetage avec des colorants biarsenical empêche leur liaison, vraisemblablement dues à des modifications du motif TC. Un autre facteur essentiel pour des résultats constants est la densité de cellules. Nous avons trouvé qu&#39;il était essentiel pour les cellules d&#39;image qui sont vaguement distribuées et aussi que l&#39;agglutination vaste peut conduire à coloration inégale des colorants biarsenical dans différentes cellules. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Balises Tetracysteine ​​et coloration ReAsH dans les cellules vivantes transfectées avec la huntingtine (exon1-25Q)-Cerulean fusions. La balise TC est situé à la jonction de la fusion huntingtine-Cerulean (telle que décrite au point 7). L&#39;intrigue de corrélation d&#39;intensité des pixels permet une évaluation des différences de ReAsH contraignante à travers la cellule et peuvent être utilisées pour cartographier les changements dans ReAsH contraignante en raison du changement de conformation ou d&#39;interactions ligand.

<ol>
	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Ann. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+covalent+labeling+of+recombinant+protein+molecules+inside+live+cells.">Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells.</a> Science. 281, 269-2672 (1998).</li><li>Uttamapinant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorophore+ligase+for+site-specific+protein+labeling+inside+living+cells.">A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 10914-10919 (2010).</li><li>Ignatova, Z., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+protein+stability+and+aggregation+in+vivo+by+real-time+fluorescent+labeling.">Monitoring protein stability and aggregation in vivo by real-time fluorescent labeling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 523-528 (2004).</li><li>Coleman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+detection+of+prion+protein+with+biarsenical+labeling+and+FlAsH+fluorescence.">Conformational detection of prion protein with biarsenical labeling and FlAsH fluorescence.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 564-568 (2009).</li><li>Luedtke, N. W., Dexter, R. J., Fried, D. B., Schepartz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveying+polypeptide+and+protein+domain+conformation+and+association+with+FlASH+and+ReAsH.">Surveying polypeptide and protein domain conformation and association with FlASH and ReAsH.</a> Nat. Chem. Biol. 3, 779-784 (2007).</li><li>Ramdzan, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+sensors+that+distinguish+monomeric+proteins+from+oligomers+in+live+cells.">Conformation sensors that distinguish monomeric proteins from oligomers in live cells.</a> Chem. Biol. 17, 371-379 (2010).</li><li>Abramoff, M. a. g. e. l. h. a. e. s., PJ, S. J. R. a. m. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+with+ImageJ.">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Hearps, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biarsenical+dye+Lumio+exhibits+a+reduced+ability+to+specifically+detect+tetracysteine-containing+proteins+within+live+cells.">The biarsenical dye Lumio exhibits a reduced ability to specifically detect tetracysteine-containing proteins within live cells.</a> J. Fluor. 17, 593-597 (2007).</li><li>Adams, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo:+Synthesis+and+biological+applications.">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> J. Am. Chem. Soc. 124, 6063-6076 (2002).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Meth. 2, 905-909 (2005).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

L&#39;approche de la localisation de la protéine étiquette avec une protéine fluorescente et les propriétés conformationnelles avec un second colorant offre beaucoup de potentiel pour la cartographie où les différentes conformations de protéines s&#39;accumulent dans les cellules et les événements qui changent la dynamique de la conformation des protéines. ReAsH / Flash a été d&#39;abord utilisé comme un capteur de cellules pour le repliement des protéines cellulaires de mammifères de l&#39;acide rétino...

<table border="1"><tbody><tr><th> Le nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> 8-même μ-diapositives </td><td> Ibidi </td><td> 80826 </td><td> Nous trouvons ces diapositives de chambre pour être particulièrement utile pour la culture de cellules pour l&#39;imagerie. </td></tr><tr><td> TC-Flash II dans la cellule de détection Tag Tetracysteine ​​Kit * * * fluorescence verte pour imagerie des cellules vivantes </td><td> Invitrogen </td><td> T34561 (Flash) ou T34562 (ReAsH) </td><td></td></tr><tr><td> Hanks Balanced Salt Solution </td><td> Invitrogen </td><td> 14175-103 </td><td></td></tr><tr><td> 2,3-dimercapto-1-ol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D1129-5ML </td><td></td></tr><tr><td> 1,2-éthanedithiol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 02390-25ML </td><td></td></tr></tbody></table>

reash/flash labeling and image analysis of tetracysteine sensor proteins in cells

Les protéines fluorescentes et les colorants sont des outils essentiels pour l&#39;étude du trafic des protéines, la localisation et la fonction des cellules. Alors que les protéines fluorescentes telles que la fluorescence protéine verte (GFP) ont été largement utilisés en tant que partenaires de fusion aux protéines de suivre les propriétés d&#39;une protéine d&#39;intérêt de 1, les développements récents avec de petites balises permettent de nouvelles fonctionnalités de protéines pour être examinés dans les cellules, comme le changement conformationnel et en protéines d&#39;association 2, 3. Un système de petite étiquette comporte un motif tetracysteine ​​(CCXXCC) génétiquement inséré dans une protéine cible, qui se lie aux colorants biarsenical, ReAsH (rouge fluorescent) et Flash (vert fluo), avec une spécificité élevée même dans des cellules vivantes 2. Le système TC / biarsenical colorant offre beaucoup moins de contraintes stériques de la protéine de l&#39;hôte que les protéines fluorescentes qui a permis à plusieurs nouvelles approches pour mesurer les changements de conformation et d&#39;interactions protéine-protéine 4-7. Nous avons récemment développé une nouvelle application de balises TC que les capteurs d&#39;oligomérisation dans les cellules exprimant la huntingtine mutante, qui, lorsqu&#39;il est muté agrégats dans les neurones dans la maladie de Huntington 7. La huntingtine a été marqué avec deux colorants fluorescents, un pour une protéine fluorescente pour suivre la localisation des protéines, et le second un tag TC qui ne lie que les colorants biarsenical dans les monomères. Par conséquent, les changements dans colocalisation entre la protéine et la réactivité de teinture biarsenical permis teneur en oligomères submicroscopiques à être spatialement cartographié l&#39;intérieur des cellules. Ici, nous décrivons comment étiqueter TC-protéines étiquetées fusionné à une protéine fluorescente (Cherry, la GFP ou PCP) avec le flash ou ReAsH en direct les cellules de mammifères et de la façon de quantifier la fluorescence à deux couleurs (Cherry / Flash, CFP / Flash ou GFP / combinaisons ReAsH).

Watch this Scientific Journal Video about ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells at JoVE.com

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

Les colorants biarsenical Flash et ReAsH se lient spécifiquement aux motifs tetracysteine ​​en protéines et peut sélectivement l&#39;étiquette protéines dans les cellules vivantes. Récemment, cette stratégie d&#39;étiquetage a été utilisé pour développer des capteurs pour les conformations de protéines différentes ou des états oligomériques. Nous décrivons la méthode d&#39;étiquetage et des méthodes pour analyser quantitativement contraignant.

ReAsH / Flash d&#39;étiquetage et d&#39;analyse d&#39;images de protéines dans les cellules du capteur Tetracysteine

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

reashflash-labeling-image-analysis-tetracysteine-sensor-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

16.9K vues.  Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute. Les colorants biarsenical Flash et ReAsH se lient spécifiquement aux motifs tetracysteine ​​en protéines et peut sélectivement l'étiquette protéines dans les cellules vivantes. Récemment, cette stratégie d'étiquetage a été utilisé pour développer des capteurs pour les conformations de protéines différentes ou des états oligomériques. Nous décrivons la méthode d'étiquetage et des méthodes pour analyser quantitativement contraignant.

Vidéo: ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

Robotique et d&#39;analyse d&#39;images dynamiques pour les études d&#39;expression génique dans les tissus végétaux

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Recherche

Biologie

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

L&#39;examen de la dynamique conformationnelle des protéines membranaires In situ Avec site-dirigé marquage fluorescent

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Analyse phénotypique et isolement de cellules souches hématopoïétiques murines et Lineage-engagés progéniteurs

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induction et analyse des épithéliale à mésenchymateuses transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

Analyse automatisée de dynamique Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signaux de séquences d&#39;images

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific positions in DNA, RNA, proteins and small biomolecules. This natural methylation reaction can be expanded to a wide variety of alkylation reactions using synthetic cofactor analogues. Replacement of the reactive sulfonium center of AdoMet with an aziridine ring leads to cofactors which can be coupled with DNA by various DNA MTases. These aziridine cofactors can be equipped with reporter groups at different positions of the adenine moiety and used for Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). As a typical example we give a protocol for biotinylation of pBR322 plasmid DNA at the 5&#8217;-ATCGAT-3&#8217; sequence with the DNA MTase M.BseCI and the aziridine cofactor 6BAz in one step. Extension of the activated methyl group with unsaturated alkyl groups results in another class of AdoMet analogues which are used for methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). Since the extended side chains are activated by the sulfonium center and the unsaturated bond, these cofactors are called double-activated AdoMet analogues. These analogues not only function as cofactors for DNA MTases, like the aziridine cofactors, but also for RNA, protein and small molecule MTases. They are typically used for enzymatic modification of MTase substrates with unique functional groups which are labeled with reporter groups in a second chemical step. This is exemplified in a protocol for fluorescence labeling of histone H3 protein. A small propargyl group is transferred from the cofactor analogue SeAdoYn to the protein by the histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7/9 followed by click labeling of the alkynylated histone H3 with TAMRA azide. MTase-mediated labeling with cofactor analogues is an enabling technology for many exciting applications including identification and functional study of MTase substrates as well as DNA genotyping and methylation detection.

DNA and proteins are sequence-specifically labeled with affinity or fluorescent reporter groups using DNA or protein methyltransferases and synthetic cofactor analogues. Depending on the cofactor specificity of the enzymes, aziridine or double activated cofactor analogues are employed for one- or two-step labeling.

Étiquetage spécifique de la séquence des acides nucléiques et des protéines avec Methyltransferases et le cofacteur Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

Protéines immunofluorescence Analyse des endogènes et exogènes Centromere-kinétochoriens

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

Des dosages pour la dégradation des protéines mal repliées dans des cellules

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Une interface utilisateur graphique pour le suivi assisté par logiciel de la concentration de protéines dans les protrusions cellulaires dynamiques

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are highly efficient at virus transmission plays a key role in virus epidemics in fields. Studying virus-insect vector interactions can advance our understanding of virus transmission and epidemics with the aim of designing novel strategies to control plant viruses and their vector insects. Immunofluorescence labeling has been widely used to analyze interactions between pathogens and hosts and is used here in the white-backed planthopper (WBPH, Sogatella furcifera), which efficiently transmits the southern rice black streaked dwarf virus (SRBSDV, genus Fijivirus, family Reoviridae), to locate the virions and insect proteins in the midgut epithelial cells. Using laser scanning confocal microscopy, we studied the morphological characteristics of midgut epithelial cells, cellular localization of insect proteins, and the colocalization of virions and an insect protein. This protocol can be used to study virus activities in insects, functions of insect proteins, and interactions between virus and vector insect.

This protocol for immunofluorescent labeling of both plant virus proteins and vector insect proteins in excised insect guts can be used to study interactions among virus and vector insects, insect protein functions and molecular mechanisms underlying virus transmission.

Marquage immunofluorescent de protéines de virus végétaux et d’insectes vecteurs dans les intestins d’hémiptères

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...