Le financement fourni par la National Science Foundation (IOS-1050701 à BAC), le National Institutes of Health (NS54174 à la SM et F30DC0111907 à AML-W.), Le Uehara Memorial Foundation et la Société japonaise pour la promotion de la science (G2205 aux savoirs traditionnels ). Nous remercions Meeks Julian pour son soutien et des conseils sur le sujet des enregistrements axonales extracellulaires. Nous remercions Carl Hopkins pour fournir une chambre d&#39;enregistrement de prototype.

<ol>
	<li>Meeks, J. P., Jiang, X., Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potential+fidelity+during+normal+and+epileptiform+activity+in+paired+soma-axon+recordings+from+rat+hippocampus.">Action potential fidelity during normal and epileptiform activity in paired soma-axon recordings from rat hippocampus.</a> J. Physiol. 566, 425-441 (2005).</li><li>Pinault, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+single-cell+staining+procedure+performed+in+vivo+under+electrophysiological+control:+morpho-functional+features+of+juxtacellularly+labeled+thalamic+cells+and+other+central+neurons+with+biocytin+or+Neurobiotin.">A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin.</a> J. Neurosci. Methods. 65, 113-136 (1996).</li><li>Joshi, S., Hawken, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loose-patch-juxtacellular+recording+in+vivo--a+method+for+functional+characterization+and+labeling+of+neurons+in+macaque+V1.">Loose-patch-juxtacellular recording in vivo--a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1.</a> J. Neurosci. Methods. 156, 37-49 (2006).</li><li>Margrie, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+whole-cell+recordings+in+the+mammalian+brain+in+vivo.">Targeted whole-cell recordings in the mammalian brain in vivo.</a> Neuron. 39, 911-918 (2003).</li><li>Lima, S. Q., Hrom&#225;dka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PINP:+A+new+method+of+tagging+neuronal+populations+for+identification+during+in+vivo+electrophysiological+recording.">PINP: A new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording.</a> PLoS One. 4, e6099 (2009).</li><li>Foust, A., Popovic, M., Zecevic, D., McCormick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potentials+initiate+in+the+axon+initial+segment+and+propagate+through+axon+collaterals+reliably+in+cerebellar+Purkinje+neurons.">Action potentials initiate in the axon initial segment and propagate through axon collaterals reliably in cerebellar Purkinje neurons.</a> J. Neurosci. 30, 6891-6902 (2010).</li><li>Lehman, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+as+a+transneuronal+tracer.">Herpes simplex virus as a transneuronal tracer.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 22, 695-708 (1998).</li><li>Joris, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dogged+pursuit+of+coincidence.">A dogged pursuit of coincidence.</a> J. Neurophysiol. 96, 969-972 (2006).</li><li>Heiligenberg, W., Rose, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+and+amplitude+computations+in+the+midbrain+of+an+electric+fish:+Intracellular+studies+of+neurons+participating+in+the+jamming+avoidance+response+of+Eigenmannia.">Phase and amplitude computations in the midbrain of an electric fish: Intracellular studies of neurons participating in the jamming avoidance response of Eigenmannia.</a> J. Neurosci. 5, 515-531 (1985).</li><li>Morales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Releasing+the+peri-neuronal+net+to+patch-clamp+neurons+in+adult+CNS.">Releasing the peri-neuronal net to patch-clamp neurons in adult CNS.</a> Pfl&#252;gers Archiv European J. Physiol. 448, 248-258 (2004).</li><li>Friedman, M. A., Hopkins, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrates+for+species+recognition+in+the+time-coding+electrosensory+pathway+of+mormyrid+electric+fish.">Neural substrates for species recognition in the time-coding electrosensory pathway of mormyrid electric fish.</a> J. Neurosci. 18, 1171-1185 (1998).</li><li>Hitschfeld, &. #. 2. 0. 1. ;. M., Stamper, S. A., Vonderschen, K., Fortune, E. S., Chacron, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+restraint+and+immobilization+on+electrosensory+behaviors+of+weakly+electric+fish.">Effects of restraint and immobilization on electrosensory behaviors of weakly electric fish.</a> ILAR. J. 50, 361-372 (2009).</li><li>Xu-Friedman, M. A., Hopkins, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+mechanisms+of+temporal+analysis+in+the+knollenorgan+pathway+of+mormyrid+electric+fish.">Central mechanisms of temporal analysis in the knollenorgan pathway of mormyrid electric fish.</a> J. Exp. Biol. 202, 1311-1318 (1999).</li><li>Amagai, S., Friedman, M. A., Hopkins, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+coding+in+the+midbrain+of+mormyrid+electric+fish.+I.+Physiology+and+anatomy+of+cells+in+the+nucleus+exterolateralis+pars+anterior.">Time coding in the midbrain of mormyrid electric fish. I. Physiology and anatomy of cells in the nucleus exterolateralis pars anterior.</a> J. Comp. Physiol. A: Neuroethol Sens Neural. Behav. Physiol. 182, 115-130 (1998).</li><li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+making+very+fine,+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically.">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bull World Health Organ. 2, 143-144 (1965).</li><li>Carlson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal-pattern+recognition+by+single+neurons+in+a+sensory+pathway+devoted+to+social+communication+behavior.">Temporal-pattern recognition by single neurons in a sensory pathway devoted to social communication behavior.</a> J. Neurosci. 29, 9417-9428 (2009).</li><li>Mugnaini, E., Maler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytology+and+immunocytochemistry+of+the+nucleus+extrolateralis+anterior+of+the+mormyrid+brain:+possible+role+of+GABAergic+synapses+in+temporal+analysis.">Cytology and immunocytochemistry of the nucleus extrolateralis anterior of the mormyrid brain: possible role of GABAergic synapses in temporal analysis.</a> Anat Embryol. (Berl). 176, 313-336 (1987).</li><li>Kohashi, T., Lyons-Warren, A. M., Mennerick, S., Carlson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+submillisecond+spike+timing+differences+based+on+delay-line+anticoincidence+detection.">Detection of submillisecond spike timing differences based on delay-line anticoincidence detection.</a> J. Neurophysiol. 110, 2295-2311 (2013).</li><li>Colin, W., Donoff, R. B., Foote, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+latex+microspheres+as+a+retrograde+tracer+in+the+peripheral+nervous+system.">Fluorescent latex microspheres as a retrograde tracer in the peripheral nervous system.</a> Brain Res. 486, 334-339 (1989).</li><li>Katz, L. C., Burkhalter, A., Dreyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+latex+microspheres+as+a+retrograde+neuronal+marker+for+in+vivo+and+in+vitro+studies+of+visual+cortex.">Fluorescent latex microspheres as a retrograde neuronal marker for in vivo and in vitro studies of visual cortex.</a> Nature. 310, 498-500 (1984).</li><li>Brown, S. P., Hestrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracortical+circuits+of+pyramidal+neurons+reflect+their+long-range+axonal+targets.">Intracortical circuits of pyramidal neurons reflect their long-range axonal targets.</a> Nature. 457, 1133-1136 (2009).</li><li>Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+recording+from+identifiable+neurons+of+the+locomotor+network+in+the+developing+zebrafish.">In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish.</a> J. Neurosci. Methods. 88, 1-13 (1999).</li><li>Pollak, G. D., Burger, R. M., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+circuitry+of+the+auditory+system.">Dissecting the circuitry of the auditory system.</a> Trends Neurosci. 26, 33-39 (2003).</li><li>Wurtz, R. H., Albano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual-motor+function+of+the+primate+superior+colliculus.">Visual-motor function of the primate superior colliculus.</a> Annu. Rev. Neurosci. 3, 189-226 (1980).</li><li>O'Malley, D. 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Methods. 108, 97-110 (2001).</li><li>Higure, Y., Katayama, Y., Takeuchi, K., Ohtubo, Y., Yoshii, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lucifer+Yellow+slows+voltage-gated+Na++current+inactivation+in+a+light-dependent+manner+in+mice.">Lucifer Yellow slows voltage-gated Na+ current inactivation in a light-dependent manner in mice.</a> J. Physiol. 550, 159-167 (2003).</li><li>Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+voltage-sensitive+dyes+modulate+GABAA+receptor+function.">Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function.</a> J. Neurosc. 30, 2871-2879 (2010).</li><li>Oxford, G. S., Pooler, J. P., Narahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+and+external+application+of+photodynamic+sensitizers+on+squid+giant+axons.">Internal and external application of photodynamic sensitizers on squid giant axons.</a> J. Membr. Biol. 36, 159-173 (1977).</li><li>Roberts, T. F., Tschida, K. A., Klein, M. E., Mooney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spine+stabilization+and+synaptic+enhancement+at+the+onset+of+behavioural+learning.">Rapid spine stabilization and synaptic enhancement at the onset of behavioural learning.</a> Nature. 463, 948-952 (2010).</li><li>Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coherent+nonlinear+optical+imaging:+beyond+fluorescence+microscopy.">Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).</li><li>Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+three-dimensional+fluorescence+imaging+of+activity+in+neural+populations+by+objective-coupled+planar+illumination+microscopy.">Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy.</a> Neuron. 57, 661-672 (2008).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Une fois maîtrisée, cette technique permettra de cibler une neurones identifiés, y compris les axones individuels, pour les enregistrements in vivo dans de nombreux systèmes modèles. En outre, cette technique permet d&#39;enregistrer de manière fiable sortie pic de neurones présentant des caractéristiques anatomiques uniques qui font traditionnelle dans les méthodes d&#39;enregistrement in vivo difficile. Nous avons utilisé cette technique pour enregistrer à partir d&#39;ELA »petites cellules» dans mormyrid poissons faiblement électriques. Les tentatives précédentes pour étudier les propriétés de réglage de &quot;petites cellules&quot; ont échoué en raison des conditions d&#39;enregistrement difficiles 11, 14. Caractéristiques anatomiques similaires créent des obstacles à l&#39;obtention des enregistrements mono-unité d&#39;un grand nombre de vertébrés auditif différent et les neurones électrosensoriel 8-10. Pour relever ces défis dans notre système, nous avons profité du fait que les &quot;petites cellules&quot; sont les seules cellules dans ELA projet de PEL. Ainsi, le transport rétrograde de colorant placé dans PEL limite étiquetage sein d&#39;ELA pour &quot;petit&quot;soma et les axones cellulaires. Marquage fluorescent des axones ont permis le placement des électrodes précise à côté axones marqués, des enregistrements seule unité de cellules identifiées possibles malgré somas inaccessibles. Nous avons tenté enregistrements somatiques, mais sans succès, probablement due aux alentours synapses avalement 11 , 17. Cependant, somatique étiquetage était clairement visible ce qui suggère que cette technique pourrait être utilisée pour cibler les enregistrements somatiques dans d&#39;autres types cellulaires et d&#39;autres circuits. Marquage fluorescent des neurones par le transport rétrograde in vivo a été utilisé pour guider les enregistrements cibles in vitro 19-21 . Une technique similaire a été utilisée pour cible enregistrements in vivo des neurones moteurs chez le poisson zèbre moelle épinière 22. Notre travail représente une nouvelle extension de cette approche, dans laquelle les deux étiquetage et d&#39;enregistrement sont réalisées in vivo dans le cerveau. Notre méthode démontre que in vivo l&#39;étiquetage des zones du système nerveux central avec un rétrograde tcoureur peut être étendue à l&#39;étude d&#39;autres circuits intacts avec les neurones de projection similaire sélectifs. Par exemple, dans le traitement auditif des mammifères, le colliculus inférieur (IC) sert de centre de relais important pour les apports de multiples structures rhombencephalic 23. Injection de colorant dans le circuit intégré serait marquer sélectivement les cellules de projection de chacun de ces noyaux. Le colliculus supérieur (CS) a une fonction similaire à la vision 24. Les préparatifs de la moelle épinière sont particulièrement bien adaptés à cette technique, comme la moelle épinière est facilement accessible, injection de colorant peut se produire loin du site d&#39;enregistrement, et il peut être combiné avec l&#39;enregistrement intracellulaire et le remplissage de certains neurones d&#39;acquérir des informations anatomiques détaillées 25. Enfin, des voies de traçage est une technique bien établie utilisée dans le système nerveux central pour cartographier circuits complexes 26. Notre méthode peut être utilisée pour ajouter des informations fonctionnelles à ces études comme cela a été fait avecindicateurs sensibles au calcium Ith cortex visuel du chat 27. La chirurgie, qui est bien établi, fiable et régulièrement utilisé pour les aveugles in vivo des enregistrements 16, doit être complété par des saignements minimes et aucun dommage à la surface du cerveau pour permettre à l&#39;animal et le tissu pour survivre. Avec la pratique, l&#39;application de la chirurgie et de teinture peut être complété en 30-45 minutes. Nous avons étiqueté avec succès &quot;à petites cellules&quot; axones dans 67% des préparations. La plupart des préparations n&#39;ont que de 1 ou 2 axones marqués visibles, mais certains en avoir autant que 8. Sur les 119 unités marquées tentatives, nous avons obtenu des enregistrements-ensemble de 26 logements répartis sur 12 préparations (tableau 2). Ainsi, les données ont été recueillies auprès de 41% des préparations à axones marqués pour un taux de réussite global de 28%. L&#39;aspect critique de l&#39;application de teinture est l&#39;étiquetage profondeur. Faible insertion du fil de tungstène se traduira, dans le colorant étant aw lavéay. Toutefois, si la pénétration est trop profonde, les axones marqués ne seront pas visibles pour le ciblage. En outre, certains dommages mécaniques à la cellule doit se produire pour que le colorant soit dûment pris en hausse de 25, 28. Cependant, trop de dégâts va tuer les cellules. Nous avons tenté d&#39;étiquetage avec d&#39;autres colorants et d&#39;autres méthodes (tableau 2), y compris marquage antérograde par injection de colorant dans ELa jumelé avec l&#39;enregistrement à partir des axones marqués dans PEL (tableau 3). Nous émettons l&#39;hypothèse que l&#39;étiquetage antérograde n&#39;a pas réussi parce que l&#39;étiquetage a été limitée aux cellules avec des dommages somatiques, ce qui les rend insensibles. En outre, les bornes de pré-synaptiques peuvent avoir été dérangé. En revanche, l&#39;étiquetage rétrograde minimise ces deux préoccupations. La quantité et le lieu d&#39;application de teinture peuvent être modifiés en fonction du circuit particulier à l&#39;étude. Étiquetage maximale se produit avec la plus grande concentration de colorant, ce qui nous avons obtenu l&#39;aide de fils de tungstène enrobées. Toutefois, pour l&#39;étiquetage des axones avec dedes projections de PE, colorant peuvent se détacher de l&#39;aiguille de tungstène comme il est avancé. Dans ces cas, l&#39;injection sous pression serait plus approprié. Absorption de colorant et le transport sont rapides, avec des axones marqués dans notre préparation étant visible dès 2 heures après l&#39;injection et les axones marqués supplémentaires apparaissant le plus tard 6 heures après l&#39;injection. Ainsi, l&#39;étiquetage et l&#39;enregistrement peut être accompli en une seule journée, en éliminant les difficultés techniques liées à la chirurgie de survie. Timing variera pour chaque application en fonction de la distance nécessaire pour le transport colorant. Un autre aspect essentiel est le placement des électrodes. Il est important pour entrer dans le tissu à proximité du site de l&#39;axone marquée pour éviter le colmatage de la pointe. Pour les tissus denses tels que dans ELA une longue tige mince sur l&#39;électrode d&#39;enregistrement minimise l&#39;excès mouvement du tissu environnant. Si un enregistrement réussi n&#39;est pas atteint à la première tentative, répétée avec des électrodes frais jusqu&#39;à ce que l&#39;enregistrement soit obtenu ou la tissue est interrompu à l&#39;endroit où l&#39;axone n&#39;est plus visible. Cependant, il est également important de placer rapidement l&#39;électrode à côté de l&#39;axone pour minimiser la quantité d&#39;exposition fluorescent, ce qui peut provoquer la phototoxicité, le blanchiment et peuvent affecter les propriétés physiologiques de la cellule 29-31. Une fois un segment de l&#39;axone est aspiré avec succès dans l&#39;électrode d&#39;enregistrement, les enregistrements peuvent être obtenues pendant plusieurs heures. Si les unités sont toujours perdus en moins de 1 heure, envisager de faire des petites pointes d&#39;électrodes pour empêcher l&#39;axone de glisser. D&#39;autre part, trop petit d&#39;une pointe peut entraîner l&#39;obstruction, à faible rapport signal-bruit, ou des dommages à l&#39;axone. Une baisse constante pic d&#39;amplitude et le «retour» d&#39;une unité avec aspiration supplémentaire est une indication que la pointe est trop grand. Trop aspiration peut causer des dommages irréparables à l&#39;axone. Une solution consiste à permettre à une fuite dans la conduite d&#39;air de sorte que la pression revient lentement à zéro. Égaliser rapidement èmepression e se traduira par un parent-aller &#39;push&#39; transitoire qui peut expulser l&#39;axone. Bien que cette technique représente un atout majeur pour obtenir des enregistrements ciblées de neurones de projection identifiés, il ne sera pas utile pour distinguer les interneurones locaux, comme colorant sera repris par tous les types de cellules au site d&#39;injection. Théoriquement, l&#39;utilisation de plusieurs fluorophores avec des sites d&#39;injection séparés peut permettre que cette méthode soit élargi. Par exemple, la comparaison de simple et d&#39;une double-étiquetage pourrait être utilisée pour distinguer les interneurones de neurones de projection suite à deux injections à deux points dans le circuit 32. De même, les traceurs rétrogrades peuvent être combinés avec d&#39;autres techniques d&#39;imagerie avancées, telles que l&#39;imagerie à deux photons, comme l&#39;a fait récemment en diamant mandarin Haute centre Vocal (HVc) 32. En outre, des régions d&#39;enregistrement sont limités à ceux près de la surface lors de l&#39;utilisation des microscopes à épifluorescence, car nous n&#39;étions en mesure de résoudre 1 &amp;mu, les structures de m dans les 30 premiers um de tissu. Toutefois, cette profondeur pourrait être étendu grâce à l&#39;utilisation d&#39;autres techniques de microscopie, telles que la microscopie à deux photons 33 ou objectif couplé microscopie d&#39;éclairage planaire 34. Dans l&#39;ensemble, cette technique représente un progrès important dans l&#39;étude des circuits neuronaux in vivo, car il peut être utilisé pour enregistrer des neurones simples dans de nombreux circuits dans une variété de systèmes modèles - y compris ceux qui sont relativement inaccessibles.

<table border="1" cellspacing="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tricaine Methanesulfonate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E10521</td>
 <td>MS-222</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gallamine Triethiodide </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G8134</td>
 <td>Flaxedil</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lidocaine Hydrochloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>L5647</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hickman's Ringer Solution </td>
 <td>NA</td>
 <td>NA</td>
 <td>NaCl (6.48 g/l), KCl (0.15 g/l), CaCl2&bull;2H20 (0.29 g/l), MgSO4 (0.12 g/l), NaHCO3 (0.084 g/l), NaH2PO4 (0.06 g/l)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peristaltic Pump</td>
 <td>Gilson or Rainin</td>
 <td>Minipulse 3 Model 312; RP-1</td>
 <td>10.0 &plusmn; 1.0 rpm, Alternatively, a gravity-fed line with a flow-meter</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection Microscope </td>
 <td>Nikon</td>
 <td>SM2645</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Super Glue</td>
 <td>Super Glue Corporation</td>
 <td>SGH2</td>
 <td>2g tube</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Omni Drill 35</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>503-598</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ball Mill Carbide Drill Bit #1/4</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>501860</td>
 <td>0.19 DIA (bit diameter = 0.48 mm) </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low Temp Cautery Kit</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>500391</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manual Micromanipulator</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>M3301R</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dextran Conjugated Alexa Fluor 568</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>D-22912</td>
 <td>2mM concentration; 10,000MW The choice of dye wavelength should be selected to match the microscope filter settings</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Epifluorescent Microscope</td>
 <td>Nikon </td>
 <td>E600 FN</td>
 <td>A remote focus accessory is helpful for fine focus TRITC filter - or appropriate filter to match focal planes for different dye wavelengths</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low Power Objective</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>93182</td>
 <td>CFI Plan Achromat Series, 4X N.A. 0.1, W.D. 30mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High Power Objective</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>93148</td>
 <td>CFI Fluor Series, 40X WI N.A. 0.8, W.D. 2.0 mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>White Light Source</td>
 <td>Dolan-Jenner</td>
 <td>Model 190</td>
 <td>Fiber Optic Illuminator</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescent Light Source </td>
 <td>Lumen Dynamics</td>
 <td>X-Cite 120Q</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low-light Level Camera</td>
 <td>Photometrics</td>
 <td>CoolSnap ES</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Digital Manometer</td>
 <td>Omega Engineering</td>
 <td>HHP-201</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Motorized Micromanipulator</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>MP-285</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Headstage</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>CV-7B</td>
 <td>Axon Instruments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amplifier</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>MultiClamp 700B</td>
 <td>Axon Instruments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Data Acquisition System</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>Digidata 1322A</td>
 <td>Axon Instruments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Isolated Pulse Stimulator</td>
 <td>A-M Systems</td>
 <td>2100</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>P-97</td>
 <td>Program settings for our application: Heat: ramp + 1, Pull: '0', Velocity: 60, Time: 90 Box filament</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipette Glass</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>1B100F-4</td>
 <td>Borosilicate capillary glass with filament (1 mm OD, 0.58 mm ID) </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

retrograde fluorescent labeling allows for targeted extracellular single-unit recording from identified neurons in vivo

L&#39;objectif global de cette méthode consiste à enregistrer les réponses-ensemble d&#39;une population identifiée de neurones. Dans enregistrements électrophysiologiques in vivo des neurones individuels sont essentielles pour comprendre comment les circuits neuronaux fonctionnent dans des conditions naturelles. Traditionnellement, ces enregistrements ont été effectués «en aveugle», ce qui signifie l&#39;identité de la cellule enregistrée est inconnu au début de l&#39;enregistrement. Identité cellulaire peut être déterminé par la suite via intracellulaire 1, 2 ou juxtacellulaire lâche-patch 3 iontophorèse de colorant, mais ces enregistrements ne peut pas être pré-destiné aux neurones spécifiques dans les régions où les types de cellules fonctionnellement hétérogènes. Les protéines fluorescentes peuvent être exprimés de manière spécifique du type cellulaire permettant visuellement guidé par électrophysiologie unicellulaire 4-6. Cependant, il ya beaucoup de systèmes modèles pour lesquels ces outils génétiques ne sont pas disponibles. Même dans des systèmes modèles génétiquement accessibles, le désiré propromoteur peut être inconnu ou neurones génétiquement homogènes peut avoir différents modèles de projection. De même, les vecteurs viraux ont été utilisés pour étiqueter les sous-groupes spécifiques de neurones de projection 7, mais l&#39;utilisation de cette méthode est limitée par la toxicité et le manque de spécificité trans-synaptique. Ainsi, les techniques supplémentaires qui offrent des pré-visualisation spécifique pour enregistrer des neurones individuels identifiés in vivo sont nécessaires. Pré-visualisation du neurone cible est particulièrement utile pour des conditions d&#39;enregistrement difficiles, pour lesquels les enregistrements mono-cellulaires classiques sont souvent excessivement difficile 8-11. La nouvelle technique décrite dans cet article utilise le transport rétrograde d&#39;un colorant fluorescent appliqué en utilisant des aiguilles de tungstène pour étiqueter rapidement et sélectivement un sous-ensemble spécifique de cellules dans une région particulière du cerveau en fonction de leurs projections axonales uniques, offrant ainsi un repère visuel pour obtenir des enregistrements électrophysiologiques ciblées à partir de neurones identifiés dans un circuit intact withina vertébré CNS. Le roman progrès le plus significatif de notre méthode est l&#39;utilisation d&#39;un marquage fluorescent pour cibler des cellules spécifiques dans un système de modèle accessible non génétiquement. Poissons faiblement électriques sont un excellent modèle pour l&#39;étude des circuits neuronaux en éveil, se comportant 12 animaux. Nous avons utilisé cette technique pour étudier le traitement sensoriel par des «petites cellules» dans le noyau exterolateral antérieure (ELA) de poissons mormyrid faiblement électrique. «Les petites cellules&quot; sont suppose être temps neurones de comparaison importants pour détecter des différences milliseconde dans les temps d&#39;arrivée des pointes présynaptiques 13. Cependant, les caractéristiques anatomiques telles que la myéline dense, engloutissant synapses et les organismes à petites cellules ont rendu extrêmement difficile d&#39;enregistrer à partir de ces cellules en utilisant des méthodes traditionnelles 11, 14. Nous démontrons ici que notre méthode de nouveaux marqueurs de manière sélective ces cellules dans 28% des préparations, permettant des enregistrements, fiables et robustes et caracrisation des réponses à la stimulation électrosensoriel.

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Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Transport rétrograde de colorant fluorescent marque une sous-population de neurones en fonction de projection anatomique. Axones marqués peuvent être ciblés visuellement<em&gt; In vivo</em&gt;, Permettant l&#39;enregistrement extracellulaire axones identifiés. Cette technique facilite l&#39;enregistrement lorsque les neurones ne peuvent pas être étiquetés par manipulation génétique ou sont difficiles à isoler en utilisant «aveugle»<em&gt; In vivo</em&gt; Approches.

Marquage fluorescent rétrograde Permet ciblée extracellulaire seule unité d&#39;enregistrement de neurones identifiés<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

retrograde-fluorescent-labeling-allows-for-targeted-extracellular

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

19.8K vues.  Washington University in St. Louis. Transport rétrograde de colorant fluorescent marque une sous-population de neurones en fonction de projection anatomique. Axones marqués peuvent être ciblés visuellement In vivo, Permettant l'enregistrement extracellulaire axones identifiés. Cette technique facilite l'enregistrement lorsque les neurones ne peuvent pas être étiquetés par manipulation génétique ou sont difficiles à isoler en utilisant «aveugle» In vivo Appr...