I finanziamenti forniti dalla National Science Foundation (IOS-1050701 a BAC), il National Institutes of Health (NS54174 di SM e F30DC0111907 di AML-W.), Il Uehara Memorial Foundation e la Japan Society per la promozione della scienza (G2205 di TK ). Ringraziamo Julian Meeks per il suo sostegno e la guida in tema di registrazioni extracellulari assonale. Ringraziamo Carl Hopkins per la fornitura di una camera di registrazione prototipo.

<ol>
	<li>Meeks, J. P., Jiang, X., Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potential+fidelity+during+normal+and+epileptiform+activity+in+paired+soma-axon+recordings+from+rat+hippocampus.">Action potential fidelity during normal and epileptiform activity in paired soma-axon recordings from rat hippocampus.</a> J. Physiol. 566, 425-441 (2005).</li><li>Pinault, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+single-cell+staining+procedure+performed+in+vivo+under+electrophysiological+control:+morpho-functional+features+of+juxtacellularly+labeled+thalamic+cells+and+other+central+neurons+with+biocytin+or+Neurobiotin.">A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin.</a> J. Neurosci. Methods. 65, 113-136 (1996).</li><li>Joshi, S., Hawken, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loose-patch-juxtacellular+recording+in+vivo--a+method+for+functional+characterization+and+labeling+of+neurons+in+macaque+V1.">Loose-patch-juxtacellular recording in vivo--a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1.</a> J. Neurosci. Methods. 156, 37-49 (2006).</li><li>Margrie, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+whole-cell+recordings+in+the+mammalian+brain+in+vivo.">Targeted whole-cell recordings in the mammalian brain in vivo.</a> Neuron. 39, 911-918 (2003).</li><li>Lima, S. Q., Hrom&#225;dka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PINP:+A+new+method+of+tagging+neuronal+populations+for+identification+during+in+vivo+electrophysiological+recording.">PINP: A new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording.</a> PLoS One. 4, e6099 (2009).</li><li>Foust, A., Popovic, M., Zecevic, D., McCormick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potentials+initiate+in+the+axon+initial+segment+and+propagate+through+axon+collaterals+reliably+in+cerebellar+Purkinje+neurons.">Action potentials initiate in the axon initial segment and propagate through axon collaterals reliably in cerebellar Purkinje neurons.</a> J. Neurosci. 30, 6891-6902 (2010).</li><li>Lehman, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+as+a+transneuronal+tracer.">Herpes simplex virus as a transneuronal tracer.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 22, 695-708 (1998).</li><li>Joris, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dogged+pursuit+of+coincidence.">A dogged pursuit of coincidence.</a> J. Neurophysiol. 96, 969-972 (2006).</li><li>Heiligenberg, W., Rose, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+and+amplitude+computations+in+the+midbrain+of+an+electric+fish:+Intracellular+studies+of+neurons+participating+in+the+jamming+avoidance+response+of+Eigenmannia.">Phase and amplitude computations in the midbrain of an electric fish: Intracellular studies of neurons participating in the jamming avoidance response of Eigenmannia.</a> J. Neurosci. 5, 515-531 (1985).</li><li>Morales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Releasing+the+peri-neuronal+net+to+patch-clamp+neurons+in+adult+CNS.">Releasing the peri-neuronal net to patch-clamp neurons in adult CNS.</a> Pfl&#252;gers Archiv European J. Physiol. 448, 248-258 (2004).</li><li>Friedman, M. A., Hopkins, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrates+for+species+recognition+in+the+time-coding+electrosensory+pathway+of+mormyrid+electric+fish.">Neural substrates for species recognition in the time-coding electrosensory pathway of mormyrid electric fish.</a> J. Neurosci. 18, 1171-1185 (1998).</li><li>Hitschfeld, &. #. 2. 0. 1. ;. M., Stamper, S. A., Vonderschen, K., Fortune, E. S., Chacron, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+restraint+and+immobilization+on+electrosensory+behaviors+of+weakly+electric+fish.">Effects of restraint and immobilization on electrosensory behaviors of weakly electric fish.</a> ILAR. J. 50, 361-372 (2009).</li><li>Xu-Friedman, M. A., Hopkins, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+mechanisms+of+temporal+analysis+in+the+knollenorgan+pathway+of+mormyrid+electric+fish.">Central mechanisms of temporal analysis in the knollenorgan pathway of mormyrid electric fish.</a> J. Exp. Biol. 202, 1311-1318 (1999).</li><li>Amagai, S., Friedman, M. A., Hopkins, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+coding+in+the+midbrain+of+mormyrid+electric+fish.+I.+Physiology+and+anatomy+of+cells+in+the+nucleus+exterolateralis+pars+anterior.">Time coding in the midbrain of mormyrid electric fish. I. Physiology and anatomy of cells in the nucleus exterolateralis pars anterior.</a> J. Comp. Physiol. A: Neuroethol Sens Neural. Behav. Physiol. 182, 115-130 (1998).</li><li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+making+very+fine,+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically.">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bull World Health Organ. 2, 143-144 (1965).</li><li>Carlson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal-pattern+recognition+by+single+neurons+in+a+sensory+pathway+devoted+to+social+communication+behavior.">Temporal-pattern recognition by single neurons in a sensory pathway devoted to social communication behavior.</a> J. Neurosci. 29, 9417-9428 (2009).</li><li>Mugnaini, E., Maler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytology+and+immunocytochemistry+of+the+nucleus+extrolateralis+anterior+of+the+mormyrid+brain:+possible+role+of+GABAergic+synapses+in+temporal+analysis.">Cytology and immunocytochemistry of the nucleus extrolateralis anterior of the mormyrid brain: possible role of GABAergic synapses in temporal analysis.</a> Anat Embryol. (Berl). 176, 313-336 (1987).</li><li>Kohashi, T., Lyons-Warren, A. M., Mennerick, S., Carlson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+submillisecond+spike+timing+differences+based+on+delay-line+anticoincidence+detection.">Detection of submillisecond spike timing differences based on delay-line anticoincidence detection.</a> J. Neurophysiol. 110, 2295-2311 (2013).</li><li>Colin, W., Donoff, R. B., Foote, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+latex+microspheres+as+a+retrograde+tracer+in+the+peripheral+nervous+system.">Fluorescent latex microspheres as a retrograde tracer in the peripheral nervous system.</a> Brain Res. 486, 334-339 (1989).</li><li>Katz, L. C., Burkhalter, A., Dreyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+latex+microspheres+as+a+retrograde+neuronal+marker+for+in+vivo+and+in+vitro+studies+of+visual+cortex.">Fluorescent latex microspheres as a retrograde neuronal marker for in vivo and in vitro studies of visual cortex.</a> Nature. 310, 498-500 (1984).</li><li>Brown, S. P., Hestrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracortical+circuits+of+pyramidal+neurons+reflect+their+long-range+axonal+targets.">Intracortical circuits of pyramidal neurons reflect their long-range axonal targets.</a> Nature. 457, 1133-1136 (2009).</li><li>Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+recording+from+identifiable+neurons+of+the+locomotor+network+in+the+developing+zebrafish.">In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish.</a> J. Neurosci. Methods. 88, 1-13 (1999).</li><li>Pollak, G. D., Burger, R. M., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+circuitry+of+the+auditory+system.">Dissecting the circuitry of the auditory system.</a> Trends Neurosci. 26, 33-39 (2003).</li><li>Wurtz, R. H., Albano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual-motor+function+of+the+primate+superior+colliculus.">Visual-motor function of the primate superior colliculus.</a> Annu. Rev. Neurosci. 3, 189-226 (1980).</li><li>O'Malley, D. M., Zhou, Q., Gahtan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+neural+circuits+in+the+zebrafish:+a+suite+of+optical+techniques.">Probing neural circuits in the zebrafish: a suite of optical techniques.</a> Methods. 30, 49-63 (2003).</li><li>Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+techniques+for+tracing+pathways+in+the+central+nervous+system+of+developing+and+adult+mammals.">Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals.</a> Brain Res. Bull. 51, 11-28 (2000).</li><li>Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+with+cellular+resolution+reveals+precise+micro-architecture+in+visual+cortex.">Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex.</a> Nature. 433, 597-603 (2005).</li><li>Gahtan, E., O'Malley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+lesioning+of+large+numbers+of+identified+vertebrate+neurons:+applications+in+zebrafish.">Rapid lesioning of large numbers of identified vertebrate neurons: applications in zebrafish.</a> J. Neurosci. Methods. 108, 97-110 (2001).</li><li>Higure, Y., Katayama, Y., Takeuchi, K., Ohtubo, Y., Yoshii, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lucifer+Yellow+slows+voltage-gated+Na++current+inactivation+in+a+light-dependent+manner+in+mice.">Lucifer Yellow slows voltage-gated Na+ current inactivation in a light-dependent manner in mice.</a> J. Physiol. 550, 159-167 (2003).</li><li>Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+voltage-sensitive+dyes+modulate+GABAA+receptor+function.">Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function.</a> J. Neurosc. 30, 2871-2879 (2010).</li><li>Oxford, G. S., Pooler, J. P., Narahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+and+external+application+of+photodynamic+sensitizers+on+squid+giant+axons.">Internal and external application of photodynamic sensitizers on squid giant axons.</a> J. Membr. Biol. 36, 159-173 (1977).</li><li>Roberts, T. F., Tschida, K. A., Klein, M. E., Mooney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spine+stabilization+and+synaptic+enhancement+at+the+onset+of+behavioural+learning.">Rapid spine stabilization and synaptic enhancement at the onset of behavioural learning.</a> Nature. 463, 948-952 (2010).</li><li>Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coherent+nonlinear+optical+imaging:+beyond+fluorescence+microscopy.">Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).</li><li>Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+three-dimensional+fluorescence+imaging+of+activity+in+neural+populations+by+objective-coupled+planar+illumination+microscopy.">Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy.</a> Neuron. 57, 661-672 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Una volta padroneggiata, questa tecnica permetterà uno a bersaglio i neuroni identificati, tra cui i singoli assoni, per registrazioni in vivo in molti sistemi modello. Inoltre, questa tecnica permette di registrare attendibilmente uscita spike da neuroni con caratteristiche anatomiche uniche che rendono tradizionali metodi di registrazione in vivo impegnativo. Abbiamo utilizzato questa tecnica per registrare da Ela &quot;piccole cellule&quot; in mormyrid pesci debolmente elettrico. I precedenti tentativi di studiare le proprietà di sintonia di &quot;piccole celle&quot; non hanno avuto successo a causa di condizioni di ripresa difficili 11, 14. Caratteristiche anatomiche simili creano ostacoli all&#39;ottenimento di registrazioni singola unità da molti uditivo vertebrati diversi e neuroni electrosensory 8-10. Per superare queste sfide nel nostro sistema, abbiamo approfittato del fatto che &quot;piccole celle&quot; sono le uniche cellule in ELA che proiettano a Elp. Così, trasporto retrogrado di colorante collocato in Elp limita etichettatura in ELA &quot;piccolocellulari &quot;somas e assoni. etichettatura fluorescente degli assoni consentito il posizionamento degli elettrodi preciso vicino al assoni etichettati, effettuare registrazioni singola unità di cellule identificate possibili nonostante somas inaccessibili. Abbiamo tentato registrazioni somatiche, ma non hanno avuto successo, probabilmente a causa delle circostanti sinapsi engulfing 11 , 17. Tuttavia il marchio somatica era chiaramente visibile suggerendo che questa tecnica potrebbe essere utilizzato per mirare registrazioni somatiche in altri tipi cellulari e altri circuiti. etichettatura fluorescente di neuroni attraverso trasporto retrogrado in vivo è stato usato per guidare registrazioni mirate in vitro 19-21 . Una tecnica simile è stata utilizzata per la mirata in registrazioni dal vivo motoneuroni zebrafish midollo spinale 22. nostro lavoro rappresenta una nuova espansione di questo approccio, in cui sia l&#39;etichettatura e la registrazione sono fatte in vivo all&#39;interno del cervello. nostro metodo dimostra che in vivo etichettatura delle aree del sistema nervoso centrale con un retrogrado tcorridore può essere ampliato per lo studio di altri circuiti intatti con i neuroni di proiezione allo stesso modo selettivo. Per esempio, in elaborazione uditiva mammiferi, il collicolo inferiore (IC) serve come un centro importante relè per ingressi da più strutture rhombencephalic 23. Iniezione di colorante nella IC avrebbe etichettare selettivamente le cellule di proiezione da ciascuno di questi nuclei. Il collicolo superiore (SC) ha una funzione simile per la visione 24. Preparazioni midollo spinale sono particolarmente adatti per questa tecnica, come il midollo spinale è facilmente accessibile, iniezione colorante può verificarsi lontano dal sito di registrazione, e può essere combinato con registrazione intracellulare e riempimento dei neuroni selezionati per acquisire informazioni più dettagliate anatomico 25. Infine, tratto-tracing è una tecnica ben consolidata utilizzata in tutto il sistema nervoso centrale per mappare circuiteria complessa 26. Il nostro metodo può essere utilizzato per aggiungere informazioni funzionali a questi studi come è stato fatto wIndicatori di calcio-sensibili esima in gatto corteccia visiva 27. L&#39;intervento, che è ben stabilita, affidabile, e regolarmente utilizzati per ciechi in vivo registrazioni 16, deve essere completato con minimo sanguinamento e nessun danneggiamento della superficie del cervello per consentire l&#39;animale e il tessuto di sopravvivere. Con la pratica, l&#39;applicazione chirurgia e colorante può essere completato in 30-45 minuti. Abbiamo etichettato con successo &quot;piccole cellule&quot; assoni nel 67% dei preparativi. La maggior parte dei preparativi sono solo 1 o 2 assoni etichettati visibili, ma alcuni hanno ben 8. Delle 119 unità etichettati tentato, abbiamo ottenuto le registrazioni singola unità da 26 unità distribuite su 12 preparati (Tabella 2). Pertanto, i dati sono stati raccolti da 41% di preparazioni assoni etichettati per una percentuale di successo del 28%. L&#39;aspetto critico di applicazione colorante viene etichettando profondità. Inserimento superficiale del filo di tungsteno comporterà il colorante essendo aw lavatoay. Tuttavia, se la penetrazione è troppo profonda, assoni etichettati non saranno visibili per il targeting. Inoltre, alcuni danni meccanici alla cella deve verificarsi per la tintura di essere adeguatamente ripreso 25, 28. Tuttavia, troppi danni uccide le cellule. Abbiamo tentato di etichettatura con altri coloranti e altri metodi (Tabella 2), tra cui l&#39;etichettatura anterograda attraverso iniezione colorante in ELA in coppia con la registrazione da assoni etichettati a Elp (Tabella 3). Ipotizziamo che l&#39;etichettatura anterograda non è riuscita perché l&#39;etichettatura è stata limitata alle cellule con danni somatici, rendendoli insensibili. Inoltre, i terminali presinaptici possono essere stati disturbati. Al contrario, marcatura retrograda minimizza sia di queste preoccupazioni. La quantità e la posizione di applicazione colorante possono essere modificati secondo la particolare circuito studiato. Etichettatura massima si verifica con la maggiore concentrazione di colorante, che abbiamo realizzato con fili di tungsteno rivestiti. Tuttavia, per l&#39;etichettatura di assoni con deproiezioni ep, colorante può venire fuori un ago di tungsteno in quanto è avanzato. In questi casi, la pressione di iniezione sarebbe più appropriato. Assorbimento della tintura e il trasporto sono rapidi, con assoni etichettato la nostra preparazione e sia ben visibile fin da 2 ore dopo l&#39;iniezione e ulteriori assoni etichettati appaiono più tardi sei ore dopo l&#39;iniezione. Pertanto, l&#39;etichettatura e la registrazione può essere realizzato in un solo giorno, eliminando le difficoltà tecniche connesse con la chirurgia sopravvivenza. Timing varierà per ogni applicazione a seconda della distanza necessaria per il trasporto colorante. Un altro aspetto critico è il posizionamento degli elettrodi. È importante immettere il tessuto vicino al sito dell&#39;assone marcato per evitare l&#39;ostruzione della punta. Per il tessuto denso come in ELA, un lungo, gambo sottile sulla elettrodo di registrazione minimizza eccesso movimento del tessuto circostante. Se una registrazione di successo non si ottiene al primo tentativo, ripetere con elettrodi freschi fino a una registrazione si ottiene o il papue è interrotto al punto in cui l&#39;assone non è più visibile. Tuttavia, è anche importante per velocemente l&#39;elettrodo vicino alla assone per minimizzare la quantità di esposizione fluorescente, che può causare fototossicità, candeggio e possono influenzare le proprietà fisiologiche della cellula 29-31. Una volta che un segmento di assone viene aspirato con successo nella elettrodo di registrazione, le registrazioni possono essere ottenuti per diverse ore. Se le unità sono sempre persi in meno di 1 ora, considerare la possibilità di punte degli elettrodi più piccoli per evitare l&#39;assone di scivolare fuori. D&#39;altra parte, troppo piccola di una punta può provocare l&#39;intasamento, bassa segnale-rumore, o danni al assone. Una diminuzione costante nel picco di ampiezza e il &#39;ritorno&#39; di una unità con l&#39;aggiunta di aspirazione è un&#39;indicazione che la punta è troppo grande. Troppo aspirazione può causare danni irreparabili al assone. Una soluzione è quella di consentire una piccola perdita nella linea aria quindi la pressione lentamente ritorna a zero. Rapidamente equalizzazione Thpressione e si tradurrà in un parente-esteriore &#39;push&#39; transitoria che può espellere l&#39;assone. Sebbene questa tecnica rappresenta un grande vantaggio per l&#39;ottenimento di registrazioni mirate di neuroni di proiezione identificati, non sarà utile per distinguere interneuroni locali, come colorante sarebbe assorbito da tutti i tipi di cellule nel sito di iniezione. Teoricamente, l&#39;uso di più fluorofori con siti di iniezione può consentire questo metodo per essere espanso. Per esempio, il confronto di singolo-versus doppia etichettatura potrebbe essere utilizzata per distinguere interneuroni da neuroni di proiezione successivo alla doppia iniezioni in due punti del circuito 32. Allo stesso modo, traccianti retrogradi può essere combinato con altre tecniche di imaging avanzate, come ad esempio due fotoni di imaging, come è stato fatto recentemente in diamante mandarino Alta centro Vocal (HVC) 32. Inoltre, le regioni di registrazione sono limitate a quelle vicino alla superficie quando si usano microscopi epifluorescenza, come siamo stati solo in grado di risolvere 1 &amp;mu; strutture m entro i primi 30 micron di tessuto. Tuttavia, questa profondità potrebbe essere esteso mediante l&#39;uso di altre tecniche di microscopia, come la microscopia a due fotoni 33 o oggettiva-accoppiato planare illuminazione microscopia 34. Complessivamente, questa tecnica rappresenta un avanzamento importante nello studio dei circuiti neurali in vivo perché può essere utilizzato per registrare da singoli neuroni in molti circuiti diversi in una varietà di sistemi modello - compresi quelli che sono relativamente inaccessibile.

<table border="1" cellspacing="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tricaine Methanesulfonate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E10521</td>
 <td>MS-222</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gallamine Triethiodide </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G8134</td>
 <td>Flaxedil</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lidocaine Hydrochloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>L5647</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hickman's Ringer Solution </td>
 <td>NA</td>
 <td>NA</td>
 <td>NaCl (6.48 g/l), KCl (0.15 g/l), CaCl2&bull;2H20 (0.29 g/l), MgSO4 (0.12 g/l), NaHCO3 (0.084 g/l), NaH2PO4 (0.06 g/l)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peristaltic Pump</td>
 <td>Gilson or Rainin</td>
 <td>Minipulse 3 Model 312; RP-1</td>
 <td>10.0 &plusmn; 1.0 rpm, Alternatively, a gravity-fed line with a flow-meter</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection Microscope </td>
 <td>Nikon</td>
 <td>SM2645</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Super Glue</td>
 <td>Super Glue Corporation</td>
 <td>SGH2</td>
 <td>2g tube</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Omni Drill 35</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>503-598</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ball Mill Carbide Drill Bit #1/4</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>501860</td>
 <td>0.19 DIA (bit diameter = 0.48 mm) </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low Temp Cautery Kit</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>500391</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manual Micromanipulator</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>M3301R</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dextran Conjugated Alexa Fluor 568</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>D-22912</td>
 <td>2mM concentration; 10,000MW The choice of dye wavelength should be selected to match the microscope filter settings</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Epifluorescent Microscope</td>
 <td>Nikon </td>
 <td>E600 FN</td>
 <td>A remote focus accessory is helpful for fine focus TRITC filter - or appropriate filter to match focal planes for different dye wavelengths</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low Power Objective</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>93182</td>
 <td>CFI Plan Achromat Series, 4X N.A. 0.1, W.D. 30mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High Power Objective</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>93148</td>
 <td>CFI Fluor Series, 40X WI N.A. 0.8, W.D. 2.0 mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>White Light Source</td>
 <td>Dolan-Jenner</td>
 <td>Model 190</td>
 <td>Fiber Optic Illuminator</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescent Light Source </td>
 <td>Lumen Dynamics</td>
 <td>X-Cite 120Q</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low-light Level Camera</td>
 <td>Photometrics</td>
 <td>CoolSnap ES</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Digital Manometer</td>
 <td>Omega Engineering</td>
 <td>HHP-201</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Motorized Micromanipulator</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>MP-285</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Headstage</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>CV-7B</td>
 <td>Axon Instruments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amplifier</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>MultiClamp 700B</td>
 <td>Axon Instruments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Data Acquisition System</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>Digidata 1322A</td>
 <td>Axon Instruments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Isolated Pulse Stimulator</td>
 <td>A-M Systems</td>
 <td>2100</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>P-97</td>
 <td>Program settings for our application: Heat: ramp + 1, Pull: '0', Velocity: 60, Time: 90 Box filament</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipette Glass</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>1B100F-4</td>
 <td>Borosilicate capillary glass with filament (1 mm OD, 0.58 mm ID) </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

retrograde fluorescent labeling allows for targeted extracellular single-unit recording from identified neurons in vivo

L&#39;obiettivo generale di questo metodo è quello di registrare le risposte-unità singole da una popolazione di neuroni identificati. Nelle registrazioni elettrofisiologiche in vivo di singoli neuroni sono fondamentali per la comprensione di come i circuiti neurali funzionano in condizioni naturali. Tradizionalmente, queste registrazioni sono state effettuate &#39;cieco&#39;, intendendo l&#39;identità della cellula registrata è sconosciuto all&#39;inizio della registrazione. Identità cellulare può essere determinata successivamente via intracellulare 1, juxtacellular 2 o loose-patch 3 ionoforesi di colorante, ma queste registrazioni non può essere pre-mirati a specifici neuroni in regioni con tipi di cellule funzionalmente eterogenee. Proteine ​​fluorescenti possono essere espressi in modo specifico tipo cellulare permettendo visivamente a guida singola cellula elettrofisiologia 4-6. Tuttavia, ci sono molti sistemi modello per cui questi strumenti genetici non sono disponibili. Anche in sistemi modello geneticamente accessibili, il PRO desideratomoter può essere sconosciuto o neuroni geneticamente omogenee può avere diversi modelli di proiezione. Allo stesso modo, vettori virali sono stati utilizzati per etichettare specifici sottogruppi di neuroni di proiezione 7, ma l&#39;uso di questo metodo è limitato dalla tossicità e la mancanza di specificità trans-sinaptica. Pertanto, sono necessari ulteriori tecniche che offrono specifiche di pre-visualizzazione per registrare da singoli neuroni identificati in vivo. Pre-visualizzazione del neurone bersaglio è particolarmente utile per le difficili condizioni di registrazione, per cui le registrazioni monocellulari classici sono spesso proibitivo 8-11. La nuova tecnica descritta in questo articolo utilizza il trasporto retrogrado di un colorante fluorescente applicato utilizzando aghi di tungsteno per etichettare rapidamente e selettivamente uno specifico sottoinsieme di cellule all&#39;interno di una particolare regione del cervello in base alle loro uniche proiezioni assonali, fornendo in tal modo un segnale visivo per ottenere registrazioni elettrofisiologiche mirate dai neuroni identificati in un intatto circuito withina vertebrato CNS. Il romanzo progresso più significativo del nostro metodo è l&#39;uso di marcatori fluorescenti per indirizzare specifici tipi cellulari in un sistema modello accessibile non geneticamente. Pesci debolmente elettrici sono un sistema ottimo modello per lo studio di circuiti neurali in sveglio, comportandosi animali 12. Abbiamo utilizzato questa tecnica per studiare l&#39;elaborazione sensoriale da &quot;piccole celle&quot; nel nucleo exterolateral anteriore (ELA) di pesci debolmente elettrico mormyrid. &quot;Piccole celle&quot; sono ipotizzate per essere in tempo comparatore neuroni importanti per rilevare differenze submillisecond nei tempi di arrivo dei picchi presinaptici 13. Tuttavia, le caratteristiche anatomiche come mielina denso, sinapsi engulfing, e corpi cellulari piccoli hanno reso estremamente difficile per registrare da queste cellule con metodi tradizionali 11, 14. Qui mostriamo che il nostro nuovo metodo etichette selettivamente queste cellule nel 28% dei preparativi, consentendo affidabili, registrazioni e caratte robustirizzazione delle risposte a stimoli electrosensory.

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Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Trasporto retrogrado di colorante fluorescente etichetta una sotto-popolazione di neuroni basati su proiezione anatomica. Assoni con etichetta possono essere mirati visivamente<em&gt; In vivo</em&gt;, Permettendo registrazione extracellulare da assoni identificati. Questa tecnica facilita la registrazione quando i neuroni non possono essere etichettati con la manipolazione genetica o sono difficili da isolare con &#39;cieco&#39;<em&gt; In vivo</em&gt; Approcci.

Retrograda Etichettatura fluorescente Consente mirata extracellulare singola unità di registrazione da parte dei neuroni identificati<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

retrograde-fluorescent-labeling-allows-for-targeted-extracellular

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

19.8K Views.  Washington University in St. Louis. Trasporto retrogrado di colorante fluorescente etichetta una sotto-popolazione di neuroni basati su proiezione anatomica. Assoni con etichetta possono essere mirati visivamente In vivo, Permettendo registrazione extracellulare da assoni identificati. Questa tecnica facilita la registrazione quando i neuroni non possono essere etichettati con la manipolazione genetica o sono difficili da isolare con 'cieco' In vivo Approcci.