Financiamento concedido pela Fundação Nacional de Ciência (IOS-1050701 para BAC), o National Institutes of Health (NS54174 a SM e F30DC0111907 a AML-W.), A Fundação Memorial Uehara e Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (G2205 para TK ). Agradecemos Julian Meeks por seu apoio e orientação sobre o tema das gravações axonal extracelulares. Agradecemos Carl Hopkins para fornecer uma câmara de gravação protótipo.

<ol>
	<li>Meeks, J. P., Jiang, X., Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potential+fidelity+during+normal+and+epileptiform+activity+in+paired+soma-axon+recordings+from+rat+hippocampus.">Action potential fidelity during normal and epileptiform activity in paired soma-axon recordings from rat hippocampus.</a> J. Physiol. 566, 425-441 (2005).</li><li>Pinault, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+single-cell+staining+procedure+performed+in+vivo+under+electrophysiological+control:+morpho-functional+features+of+juxtacellularly+labeled+thalamic+cells+and+other+central+neurons+with+biocytin+or+Neurobiotin.">A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin.</a> J. Neurosci. Methods. 65, 113-136 (1996).</li><li>Joshi, S., Hawken, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loose-patch-juxtacellular+recording+in+vivo--a+method+for+functional+characterization+and+labeling+of+neurons+in+macaque+V1.">Loose-patch-juxtacellular recording in vivo--a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1.</a> J. Neurosci. Methods. 156, 37-49 (2006).</li><li>Margrie, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+whole-cell+recordings+in+the+mammalian+brain+in+vivo.">Targeted whole-cell recordings in the mammalian brain in vivo.</a> Neuron. 39, 911-918 (2003).</li><li>Lima, S. Q., Hrom&#225;dka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PINP:+A+new+method+of+tagging+neuronal+populations+for+identification+during+in+vivo+electrophysiological+recording.">PINP: A new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording.</a> PLoS One. 4, e6099 (2009).</li><li>Foust, A., Popovic, M., Zecevic, D., McCormick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potentials+initiate+in+the+axon+initial+segment+and+propagate+through+axon+collaterals+reliably+in+cerebellar+Purkinje+neurons.">Action potentials initiate in the axon initial segment and propagate through axon collaterals reliably in cerebellar Purkinje neurons.</a> J. Neurosci. 30, 6891-6902 (2010).</li><li>Lehman, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+as+a+transneuronal+tracer.">Herpes simplex virus as a transneuronal tracer.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 22, 695-708 (1998).</li><li>Joris, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dogged+pursuit+of+coincidence.">A dogged pursuit of coincidence.</a> J. Neurophysiol. 96, 969-972 (2006).</li><li>Heiligenberg, W., Rose, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+and+amplitude+computations+in+the+midbrain+of+an+electric+fish:+Intracellular+studies+of+neurons+participating+in+the+jamming+avoidance+response+of+Eigenmannia.">Phase and amplitude computations in the midbrain of an electric fish: Intracellular studies of neurons participating in the jamming avoidance response of Eigenmannia.</a> J. Neurosci. 5, 515-531 (1985).</li><li>Morales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Releasing+the+peri-neuronal+net+to+patch-clamp+neurons+in+adult+CNS.">Releasing the peri-neuronal net to patch-clamp neurons in adult CNS.</a> Pfl&#252;gers Archiv European J. Physiol. 448, 248-258 (2004).</li><li>Friedman, M. A., Hopkins, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrates+for+species+recognition+in+the+time-coding+electrosensory+pathway+of+mormyrid+electric+fish.">Neural substrates for species recognition in the time-coding electrosensory pathway of mormyrid electric fish.</a> J. Neurosci. 18, 1171-1185 (1998).</li><li>Hitschfeld, &. #. 2. 0. 1. ;. M., Stamper, S. A., Vonderschen, K., Fortune, E. S., Chacron, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+restraint+and+immobilization+on+electrosensory+behaviors+of+weakly+electric+fish.">Effects of restraint and immobilization on electrosensory behaviors of weakly electric fish.</a> ILAR. J. 50, 361-372 (2009).</li><li>Xu-Friedman, M. A., Hopkins, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+mechanisms+of+temporal+analysis+in+the+knollenorgan+pathway+of+mormyrid+electric+fish.">Central mechanisms of temporal analysis in the knollenorgan pathway of mormyrid electric fish.</a> J. Exp. Biol. 202, 1311-1318 (1999).</li><li>Amagai, S., Friedman, M. A., Hopkins, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+coding+in+the+midbrain+of+mormyrid+electric+fish.+I.+Physiology+and+anatomy+of+cells+in+the+nucleus+exterolateralis+pars+anterior.">Time coding in the midbrain of mormyrid electric fish. I. Physiology and anatomy of cells in the nucleus exterolateralis pars anterior.</a> J. Comp. Physiol. A: Neuroethol Sens Neural. Behav. Physiol. 182, 115-130 (1998).</li><li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+making+very+fine,+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically.">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bull World Health Organ. 2, 143-144 (1965).</li><li>Carlson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal-pattern+recognition+by+single+neurons+in+a+sensory+pathway+devoted+to+social+communication+behavior.">Temporal-pattern recognition by single neurons in a sensory pathway devoted to social communication behavior.</a> J. Neurosci. 29, 9417-9428 (2009).</li><li>Mugnaini, E., Maler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytology+and+immunocytochemistry+of+the+nucleus+extrolateralis+anterior+of+the+mormyrid+brain:+possible+role+of+GABAergic+synapses+in+temporal+analysis.">Cytology and immunocytochemistry of the nucleus extrolateralis anterior of the mormyrid brain: possible role of GABAergic synapses in temporal analysis.</a> Anat Embryol. (Berl). 176, 313-336 (1987).</li><li>Kohashi, T., Lyons-Warren, A. M., Mennerick, S., Carlson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+submillisecond+spike+timing+differences+based+on+delay-line+anticoincidence+detection.">Detection of submillisecond spike timing differences based on delay-line anticoincidence detection.</a> J. Neurophysiol. 110, 2295-2311 (2013).</li><li>Colin, W., Donoff, R. B., Foote, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+latex+microspheres+as+a+retrograde+tracer+in+the+peripheral+nervous+system.">Fluorescent latex microspheres as a retrograde tracer in the peripheral nervous system.</a> Brain Res. 486, 334-339 (1989).</li><li>Katz, L. C., Burkhalter, A., Dreyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+latex+microspheres+as+a+retrograde+neuronal+marker+for+in+vivo+and+in+vitro+studies+of+visual+cortex.">Fluorescent latex microspheres as a retrograde neuronal marker for in vivo and in vitro studies of visual cortex.</a> Nature. 310, 498-500 (1984).</li><li>Brown, S. P., Hestrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracortical+circuits+of+pyramidal+neurons+reflect+their+long-range+axonal+targets.">Intracortical circuits of pyramidal neurons reflect their long-range axonal targets.</a> Nature. 457, 1133-1136 (2009).</li><li>Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+recording+from+identifiable+neurons+of+the+locomotor+network+in+the+developing+zebrafish.">In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish.</a> J. Neurosci. Methods. 88, 1-13 (1999).</li><li>Pollak, G. D., Burger, R. M., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+circuitry+of+the+auditory+system.">Dissecting the circuitry of the auditory system.</a> Trends Neurosci. 26, 33-39 (2003).</li><li>Wurtz, R. H., Albano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual-motor+function+of+the+primate+superior+colliculus.">Visual-motor function of the primate superior colliculus.</a> Annu. Rev. Neurosci. 3, 189-226 (1980).</li><li>O'Malley, D. M., Zhou, Q., Gahtan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+neural+circuits+in+the+zebrafish:+a+suite+of+optical+techniques.">Probing neural circuits in the zebrafish: a suite of optical techniques.</a> Methods. 30, 49-63 (2003).</li><li>Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+techniques+for+tracing+pathways+in+the+central+nervous+system+of+developing+and+adult+mammals.">Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals.</a> Brain Res. Bull. 51, 11-28 (2000).</li><li>Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+with+cellular+resolution+reveals+precise+micro-architecture+in+visual+cortex.">Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex.</a> Nature. 433, 597-603 (2005).</li><li>Gahtan, E., O'Malley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+lesioning+of+large+numbers+of+identified+vertebrate+neurons:+applications+in+zebrafish.">Rapid lesioning of large numbers of identified vertebrate neurons: applications in zebrafish.</a> J. Neurosci. Methods. 108, 97-110 (2001).</li><li>Higure, Y., Katayama, Y., Takeuchi, K., Ohtubo, Y., Yoshii, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lucifer+Yellow+slows+voltage-gated+Na++current+inactivation+in+a+light-dependent+manner+in+mice.">Lucifer Yellow slows voltage-gated Na+ current inactivation in a light-dependent manner in mice.</a> J. Physiol. 550, 159-167 (2003).</li><li>Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+voltage-sensitive+dyes+modulate+GABAA+receptor+function.">Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function.</a> J. Neurosc. 30, 2871-2879 (2010).</li><li>Oxford, G. S., Pooler, J. P., Narahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+and+external+application+of+photodynamic+sensitizers+on+squid+giant+axons.">Internal and external application of photodynamic sensitizers on squid giant axons.</a> J. Membr. Biol. 36, 159-173 (1977).</li><li>Roberts, T. F., Tschida, K. A., Klein, M. E., Mooney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spine+stabilization+and+synaptic+enhancement+at+the+onset+of+behavioural+learning.">Rapid spine stabilization and synaptic enhancement at the onset of behavioural learning.</a> Nature. 463, 948-952 (2010).</li><li>Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coherent+nonlinear+optical+imaging:+beyond+fluorescence+microscopy.">Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).</li><li>Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+three-dimensional+fluorescence+imaging+of+activity+in+neural+populations+by+objective-coupled+planar+illumination+microscopy.">Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy.</a> Neuron. 57, 661-672 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Uma vez dominado, esta técnica permitirá um para atingir os neurônios identificados, incluindo axônios individuais, no gravações vivo em muitos sistemas modelo. Além disso, esta técnica permite registar com segurança de saída de pico de neurónios com características únicas que o tornam anatómicas tradicional em métodos de gravação vivo desafiador. Nós utilizamos esta técnica para gravar a partir de ELA &quot;pequenas células&quot; em mormyrid peixe fracamente elétrico. As tentativas anteriores para estudar as propriedades de ajuste de &quot;pequenas células&quot; não tiveram sucesso devido às condições desafiadoras de gravação 11, 14. Características anatômicas semelhantes criar barreiras para a obtenção de gravações em uma única unidade de diversos vertebrados neurônios electrosensory 8-10 e auditivos. Para superar estes desafios em nosso sistema, aproveitamos o fato de que &quot;pequenas células&quot; são as únicas células em ELA que se projetam para ELP. Assim, o transporte retrógrado de corante colocado no ELP limita rotulagem em ELA a &quot;pequena&quot;somas e axônios de células. marcação fluorescente dos axônios permitiu a colocação do eletrodo precisa ao lado de axônios marcados, fazendo gravações em uma única unidade de células identificadas possíveis apesar somas inacessíveis. Tentamos gravações somáticas, mas não tiveram sucesso, provavelmente devido às sinapses envolvendo em torno de 11 , 17. No entanto, a rotulagem somática era claramente visível, sugerindo que esta técnica pode ser usada para alvejar gravações somáticos em outros tipos celulares e outros circuitos. rotulagem fluorescente de neurónios através de transporte retrógrado in vivo, foi utilizado para orientar gravações alvo in vitro 19-21 . Uma técnica semelhante foi utilizada para alvo de gravações de neurónios motores in vivo em peixes-zebra medula espinal 22. nosso trabalho representa uma nova abordagem de expansão deste, em que ambos de rotulagem e gravação são feitas in vivo dentro do cérebro. nosso método demonstra que, in vivo rotulagem das áreas do sistema nervoso central com um retrógrado tpiloto pode ser expandido para o estudo de outros circuitos intactas com neurónios de projecção semelhante selectivos. Por exemplo, no tratamento de mamíferos auditivo, no colículo inferior (CI), que serve como um centro de retransmissão importante para as entradas de várias estruturas rhombencephalic 23. Injecção de corante para o IC seria etiquetar selectivamente as células de projecção a partir de cada um destes núcleos. O colículo superior (SC) tem uma função semelhante para a visão 24. Preparações da medula espinal são particularmente adequados para esta técnica, tal como a medula espinal é facilmente acessível, a injecção de corante pode ocorrer longe do local de gravação, e pode ser combinado com a gravação intracelular e enchimento de neurónios seleccionados para adquirir a informação anatómica mais detalhada 25. Finalmente, o tracto-tracing é uma técnica bem estabelecida utilizada em todo o sistema nervoso central para mapear complexo circuito 26. O método pode ser utilizado para adicionar a informação funcional para estes estudos, como tem sido feito windicadores de cálcio sensíveis om em cat córtex visual 27. A cirurgia, o que está bem estabelecido, fiável e, regularmente usado para cego in vivo gravações 16, deve ser preenchida com hemorragia mínima e sem danificar a superfície do cérebro para permitir que o animal e o tecido para sobreviver. Com a prática, a aplicação da cirurgia e corante pode ser completado em 30-45 minutos. Nós rotulado com sucesso &quot;pequenas células&quot; axônios em 67% dos preparativos. A maioria das preparações têm apenas 1 ou 2 axônios marcados visíveis, mas alguns têm até 8. Dos 119 unidades marcadas tentaram, obtivemos gravações-unitárias de 26 unidades distribuídas ao longo de 12 preparações (Tabela 2). Assim, os dados foram coletados a partir de 41% de preparações com axônios marcados para uma taxa global de sucesso de 28%. O aspecto crítico da aplicação corante é etiquetar profundidade. A falta de inserção do fio de tungsténio vai resultar em que o corante de ser lavado away. No entanto, se a penetração for muito profunda, axónios marcados não será visível para o direcionamento. Além disso, alguns danos mecânicos na célula deve ocorrer para que o corante deve ser adequadamente feita até 25, 28. No entanto, muito dano vai matar as células. Tentamos marcação com outros corantes e outros métodos (Tabela 2), incluindo a rotulagem anterógrada através de injeção de corante em ELA emparelhado com gravação de axônios marcados em ELP (Tabela 3). Nossa hipótese é que a rotulagem anterógrada não foi bem sucedida porque a rotulagem foi limitada a células com danos somática, tornando-se indiferente. Além disso, os terminais pré-sinápticas podem ter sido perturbada. Em contraste, marcação retrógrada minimiza tanto destas preocupações. A quantidade e localização de aplicação de corante pode ser alterado de acordo com o circuito particular a ser estudado. Rotulagem máxima ocorre com a maior concentração de corante, o que foi conseguido usando fios de tungsténio revestidas. No entanto, para a rotulagem de axônios comprojeções ep, corante pode sair de uma agulha de tungstênio como é avançado. Nestes casos, a injecção de pressão seria mais apropriada. Absorção e transporte Dye são rápidos, com axônios marcados em nossa preparação, sendo visível logo em 2 horas após a injeção e axônios marcados adicionais que aparecem tão tarde quanto 6 horas após a injeção. Assim, a marcação e gravação pode ser realizada num único dia, eliminando dificuldades técnicas associadas com a cirurgia de sobrevivência. Sincronismo irá variar para cada aplicação, dependendo da distância necessária para o transporte de corante. Outro aspecto importante é a colocação do eletrodo. É importante para entrar no tecido próximo do sítio do axónio rotulado para evitar o entupimento da ponta. Para o tecido denso, tal como na ELA, uma longa haste fina no eléctrodo de registo minimiza o excesso de movimento do tecido circundante. Se uma gravação de sucesso não é alcançado na primeira tentativa, repita com eletrodos frescas até uma gravação é obtida ou a TISSue é interrompida para o ponto no qual o axónio já não é visível. No entanto, é também importante para colocar rapidamente o eléctrodo próximo ao axónio para minimizar a quantidade de exposição fluorescente, o que pode causar a fototoxicidade, branqueamento e pode afectar as propriedades fisiológicas da célula 29-31. Uma vez que um segmento do axónio é aspirada com êxito no eléctrodo de registo, as gravações podem ser obtidos por várias horas. Se as unidades são constantemente perdidos em menos de 1 hora, considere fazer pontas de eléctrodos mais pequenos para impedir o axónio de deslizar para fora. Por outro lado, muito pequena de um ponta pode resultar em entupimento, baixo sinal-ruído, ou danos no axónio. Uma diminuição constante no pico de amplitude e o &quot;retorno&quot; de uma unidade de sucção é uma indicação adicional de que a ponta é demasiado grande. Muito sucção pode causar danos irreparáveis ​​para o axônio. Uma solução é permitir que uma pequena fuga na linha de ar de modo a pressão lentamente retorna a zero. Rapidamente equalizar ªe pressão irá resultar em uma relação transitória-fora &#39;push&#39; que pode expulsar o axônio. Embora esta técnica representa uma grande vantagem para a obtenção de gravações específicas identificadas a partir de neurónios de projecção, que não será útil para distinguir interneurónios locais, como corante seria ocupada por todos os tipos de células no local da injecção. Teoricamente, a utilização de fluoróforos com múltiplos locais de injecção pode permitir que este método seja expandida. Por exemplo, a comparação de um único versus dupla marcação pode ser usado para distinguir interneurónios de neurónios de projecção dupla seguintes injecções em dois pontos no circuito 32. Da mesma forma, traçadores retrógrados pode ser combinada com outras técnicas de imagem avançadas, como a imagem de dois fótons, como foi feito recentemente em tentilhão alta centro Vocal (HVC) 32. Além disso, as regiões de gravação são limitados aqueles que perto da superfície quando se utiliza microscópios de epifluorescência, já que só foram capazes de resolver uma emu; estruturas m nos primeiros 30 mm de tecido. No entanto, esta profundidade poderia ser estendido através da utilização de outras técnicas de microscopia, tais como a microscopia de dois fotões 33 ou objectivo acoplado a microscopia de iluminação plana 34. No geral, esta técnica representa um avanço importante no estudo dos circuitos neuronais in vivo, porque pode ser utilizado para gravar a partir de neurónios individuais, em muitos circuitos diferentes em uma variedade de sistemas de modelos - incluindo aqueles que são relativamente inacessíveis.

<table border="1" cellspacing="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tricaine Methanesulfonate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E10521</td>
 <td>MS-222</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gallamine Triethiodide </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G8134</td>
 <td>Flaxedil</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lidocaine Hydrochloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>L5647</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hickman's Ringer Solution </td>
 <td>NA</td>
 <td>NA</td>
 <td>NaCl (6.48 g/l), KCl (0.15 g/l), CaCl2&bull;2H20 (0.29 g/l), MgSO4 (0.12 g/l), NaHCO3 (0.084 g/l), NaH2PO4 (0.06 g/l)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peristaltic Pump</td>
 <td>Gilson or Rainin</td>
 <td>Minipulse 3 Model 312; RP-1</td>
 <td>10.0 &plusmn; 1.0 rpm, Alternatively, a gravity-fed line with a flow-meter</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection Microscope </td>
 <td>Nikon</td>
 <td>SM2645</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Super Glue</td>
 <td>Super Glue Corporation</td>
 <td>SGH2</td>
 <td>2g tube</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Omni Drill 35</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>503-598</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ball Mill Carbide Drill Bit #1/4</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>501860</td>
 <td>0.19 DIA (bit diameter = 0.48 mm) </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low Temp Cautery Kit</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>500391</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manual Micromanipulator</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>M3301R</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dextran Conjugated Alexa Fluor 568</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>D-22912</td>
 <td>2mM concentration; 10,000MW The choice of dye wavelength should be selected to match the microscope filter settings</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Epifluorescent Microscope</td>
 <td>Nikon </td>
 <td>E600 FN</td>
 <td>A remote focus accessory is helpful for fine focus TRITC filter - or appropriate filter to match focal planes for different dye wavelengths</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low Power Objective</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>93182</td>
 <td>CFI Plan Achromat Series, 4X N.A. 0.1, W.D. 30mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High Power Objective</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>93148</td>
 <td>CFI Fluor Series, 40X WI N.A. 0.8, W.D. 2.0 mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>White Light Source</td>
 <td>Dolan-Jenner</td>
 <td>Model 190</td>
 <td>Fiber Optic Illuminator</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescent Light Source </td>
 <td>Lumen Dynamics</td>
 <td>X-Cite 120Q</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low-light Level Camera</td>
 <td>Photometrics</td>
 <td>CoolSnap ES</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Digital Manometer</td>
 <td>Omega Engineering</td>
 <td>HHP-201</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Motorized Micromanipulator</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>MP-285</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Headstage</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>CV-7B</td>
 <td>Axon Instruments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amplifier</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>MultiClamp 700B</td>
 <td>Axon Instruments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Data Acquisition System</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>Digidata 1322A</td>
 <td>Axon Instruments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Isolated Pulse Stimulator</td>
 <td>A-M Systems</td>
 <td>2100</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>P-97</td>
 <td>Program settings for our application: Heat: ramp + 1, Pull: '0', Velocity: 60, Time: 90 Box filament</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipette Glass</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>1B100F-4</td>
 <td>Borosilicate capillary glass with filament (1 mm OD, 0.58 mm ID) </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

retrograde fluorescent labeling allows for targeted extracellular single-unit recording from identified neurons in vivo

O objetivo geral deste método é o de registrar as respostas única unidade de uma população identificada de neurônios. Nos registros eletrofisiológicos in vivo dos neurônios individuais são fundamentais para a compreensão de como os circuitos neurais funcionam em condições naturais. Tradicionalmente, estes registos foram efectuados &quot;cego&quot;, o que significa a identidade da célula registada é desconhecido no início da gravação. Identidade celular pode ser posteriormente determinada via intracelular 1, juxtacellular 2 ou solta-patch 3 iontoforese de corante, mas estas gravações não podem ser pré-alvejado a neurônios específicos em regiões com tipos de células funcionalmente heterogêneos. As proteínas fluorescentes podem ser expressas de uma forma específica do tipo de célula permitindo visualmente guiada electrofisiologia unicelular 4-6. No entanto, existem muitos sistemas modelo para o qual estas ferramentas genéticas não estão disponíveis. Mesmo em sistemas modelo geneticamente acessíveis, o desejado promoter pode ser desconhecido ou neurônios geneticamente homogêneos pode ter diferentes padrões de projeção. Do mesmo modo, os vectores virais têm sido utilizados para etiquetar subgrupos específicos de neurónios de projecção 7, mas a utilização deste método é limitada pela toxicidade e falta de especificidade trans-sináptica. Assim, são necessárias técnicas adicionais que oferecem pré-visualização específico para gravar a partir de neurônios individuais identificados in vivo. Pré-visualização do neurônio alvo é particularmente útil para condições de gravação difíceis, para que as gravações de uma única célula clássicos muitas vezes são proibitivamente difícil 8-11. A nova técnica descrita neste artigo usa transporte retrógrado de um corante fluorescente aplicada com o uso de agulhas de tungstênio para rotular rapidamente e seletivamente um subconjunto específico de células dentro de uma determinada região do cérebro com base em suas projeções axonais únicos, proporcionando assim uma indicação visual para obter registros eletrofisiológicos alvo de neurônios identificados em um circuito intacto withind vertebrado SNC. O novo avanço mais significativo do nosso método é a utilização de rotulagem fluorescente para atingir tipos celulares específicos num sistema modelo acessíveis não geneticamente. Peixe fracamente elétrico é um sistema excelente modelo para o estudo de circuitos neurais no acordado, comportando 12 animais. Nós utilizamos esta técnica para estudar o processamento sensorial por &quot;pequenas células&quot; no núcleo exterolateral anterior (ELA) de peixes mormyrid fracamente elétrico. &quot;Pequenas células&quot; são supor para ser tempo de comparação neurônios importantes para a detecção de diferenças submillisecond nos tempos de chegada dos picos pré-sinápticos 13. No entanto, as características anatômicas, como mielina denso, engolindo as sinapses, e os corpos de pequenas células tornaram extremamente difícil para gravar a partir destas células através de métodos tradicionais 11, 14. Aqui demonstramos que o nosso novo método seletivamente rotula essas células em 28% das preparações, permitindo confiáveis, robustos e gravações caracteríszação das respostas à estimulação electrosensory.

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Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Transporte retrógrado de corante fluorescente rotula uma sub-população de neurónios baseado em projecção anatómica. Axônios rotulados pode ser alvo visualmente<em&gt; In vivo</em&gt;, Permitindo a gravação extracelular de axónios identificados. Esta técnica permite a gravação quando os neurónios não podem ser marcados através de manipulação genética ou são difíceis de isolar usando &quot;cega&quot;<em&gt; In vivo</em&gt; Abordagens.

Labeling fluorescentes retrógrada Permite alvejado Extracelular Gravação Single-unidade dos neurônios identificados<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

retrograde-fluorescent-labeling-allows-for-targeted-extracellular

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

19.8K visualizações.  Washington University in St. Louis. Transporte retrógrado de corante fluorescente rotula uma sub-população de neurónios baseado em projecção anatómica. Axônios rotulados pode ser alvo visualmente In vivo, Permitindo a gravação extracelular de axónios identificados. Esta técnica permite a gravação quando os neurónios não podem ser marcados através de manipulação genética ou são difíceis de isolar usando "cega" In vivo Abordagens.