Nous avons amélioré la méthode RiboTag précédemment publiée pour réduire considérablement l’arrière-plan. Cela rend l’application à des modèles complexes comme un système mutant plus simple du point de vue de l’analyse et beaucoup moins coûteux. Mis à part la génération expérimentale d’animaux, la méthode RiboTag est beaucoup plus facile et plus simple que d’autres méthodes d’analyse des ARNH associés au ribosome.
Comme toutes les expériences d’ARN, des conditions strictes sans RNase sont fondamentales pour le succès. Si vous avez une expérience limitée avec l’ARN, vérifiez vos conditions en effectuant d’abord une extraction d’ARN de base, puis passez à autre chose. Lauren Chukrallah, étudiante diplômée de mon laboratoire, démontrera la procédure.
Pour préparer le tampon d’homogénéisation, ajouter 2,5 millilitres d’un tris molaire au pH 7,4, cinq millilitres d’un chlorure de potassium molaire, 600 microlitres d’un chlorure de magnésium molaire et 500 microlitres de MP40 à un tube de 50 millilitres. Ajouter de l’eau traitée au pyrocarbonate de déthyle au tube pour porter le volume à 50 millilitres et mélanger jusqu’à ce que tous les composants soient incorporés. Pour préparer un tampon de lavage à haute teneur en sel, ajouter 2,5 millilitres d’un tris molaire au pH 7,4, 15 millilitres d’un chlorure de potassium molaire, 600 microlitres d’un chlorure de magnésium molaire et 500 microlitres de MP40 à un tube de 50 millilitres.
Apportez-le au volume de 50 millilitres dans de l’eau traitée au pyrocarbonate de déthyle et mélangez-le jusqu’à ce que tous les composants soient incorporés. Pré-peser tous les tubes d’échantillon, enregistrer le poids, et pré-refroidir dans l’azote liquide. Mortier stérile pré-refroidi, pilon et spatule pesant sur la glace sèche.
Ensuite, sur la glace sèche, utiliser le mortier stérile pré-refroidi et le pilon pour briser les échantillons de tissu congelé flash en gros morceaux et le moudre lentement en une poudre fine. À l’aide de la spatule pré-refroidie, racler la poudre du mortier dans un tube de collecte pré-refroidi en prenant soin de garder sur la glace sèche dans la mesure du possible. Peser le tube avec la poudre de tissu.
Calculez la masse des tissus en soustrayant le poids initial du tube du poids du tube avec l’échantillon dedans. Enregistrez cette valeur pour le calcul ultérieur des volumes tampons de lyse. Préparez le tampon de lyse en ajoutant dans 10 millilitres de tramhiothreitol tampon d’homogénéisation, inhibiteur de RNase, Cycloheximide, héparine, et un comprimé inhibiteur de protéase.
Mélanger jusqu’à ce que tous les composants soient incorporés et conserver sur la glace jusqu’à utilisation. Pour chaque 100 milligrammes d’échantillon, ajouter un millilitre de tampon de lyse. Avec la même pipette utilisée pour ajouter le tampon de lyse, pipette soigneusement le lysate résultant de haut en bas pour fragmenter les cellules et mélanger.
Poursuivre le pipetage pendant généralement 25 à 30 coups jusqu’à ce que l’échantillon ne soit plus visqueux. Mettre les échantillons sur la glace pendant 10 minutes pour lyse. Ensuite, faites tourner les échantillons dans une centrifugeuse pré-refroidie à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes à 10 000 fois g.
Une grosse pastille nuageuse lâche se forme au fond du tube. En prenant soin de ne pas déranger la pastille, recueillir le lysate dans un nouveau tube et enregistrer le volume pour chaque échantillon. Pour éviter la dégradation de l’échantillon, assurez-vous que les échantillons demeurent frais tout au long du protocole restant de stockage sur la glace ou à quatre degrés Celsius dans la mesure du possible.
Maintenant, calculez le volume requis de perles magnétiques couplées à la protéine de liaison anticorps appropriée, protéine G.Pour un millilitre de lysate, utilisez 375 microlitres de perles de protéine G pour atteindre 30 milligrammes par millilitre. Placez la solution de perle dans un tube de 1,7 millilitre sur une grille à tube magnétique. Retirer le solvant de perles et ajouter un volume égal de tampon de lyse fraîche aux perles.
Sur un rotateur à tube de banc réglé à 20 RPM à quatre degrés Celsius, faites pivoter le tube cinq minutes pour le laver. Placez le tube sur la grille du tube magnétique et retirez le tampon de lavage. Après avoir répété le lavage deux fois de plus, ajouter le tampon de lyse au volume d’origine pour équilibrer les perles.
Conserver à quatre degrés Celsius ou sur la glace jusqu’à utilisation. Ajouter 50 microlitres des perles équilibrées pour chaque millilitre de lysate et tourner à quatre degrés Celsius pendant une heure. Placez ensuite le tube sur la grille magnétique et recueillez le lysate dans un tube frais.
Jetez les perles usées. Pour le lysate, ajouter 25 microlitres des perles équilibrées pour chaque millilitre et tourner à quatre degrés Celsius pendant une heure. Conserver le reste des perles de protéines G équilibrées à quatre degrés Celsius pendant la nuit.
Le matin, placez le tube sur la grille magnétique et recueillez le lysate dans un tube frais. Jetez les perles usées. À partir du lysate défriché, conservez 50 microlitres comme commande d’entrée de l’échantillon.
Conserver à moins 80 degrés Celsius. Pour chaque millilitre du lysate défriché, ajouter cinq microgrammes d’anticorps anti-HA. Pour éviter la perte d’échantillon, sceller le bouchon du tube avec un film de laboratoire et faire pivoter les échantillons de 16 à 18 heures à quatre degrés Celsius.
Pour chaque millilitre du lysate défriché, ajouter 300 microlitres de perles de protéines G. Reseal le bouchon de tube avec le film de laboratoire et tournez pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Placez le tube d’échantillon sur la grille magnétique pour permettre aux perles de se séparer du lysate IPed.
Pipette hors lysate d’écoulement et jeter, en conservant les perles. Ajouter 800 microlitres de tampon de lavage à haute teneur en sel aux perles. Placer le tube sur un rotateur pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.
Placez le tube d’échantillon sur la grille magnétique et laissez les perles se séparer du lavage. Retirer et jeter le lavage. Ajouter 800 microlitres de tampon de lavage à haute teneur en sel aux perles.
Fermez le tube et laissez-le tourner pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Placez le tube d’échantillon sur la grille magnétique et laissez les perles se séparer du lavage. Retirer et jeter le lavage.
Répétez le lavage une fois de plus. Après le lavage, ajouter 3,5 microlitres de 14,2 molaires bêta-mercaptoéthanol aux perles et mélanger en tourbillonnant pendant 15 secondes. Extraire l’ARN à l’aide d’un kit commercial de purification de l’ARN selon les instructions du fabricant.
Elute l’échantillon dans 30 microlitres d’eau libre RNase. Conservez l’échantillon à moins 80 degrés Celsius. Dans cette étude, très peu d’ARN a été isolé des échantillons manquant de Cre ou de Rpl22HA démontrant l’efficacité de ce protocole pour réduire l’arrière-plan de propriété intellectuelle et isoler les ARN ribosomal marqués ha authentiques.
Une série d’anticorps dans les protocoles d’isolement d’ARN ont été examinés dans les échantillons positifs de Cre et de Rpl22HA. Ces résultats démontrent que la sélection des reagents peut avoir un impact significatif sur l’efficacité de la propriété intellectuelle. L’efficacité du système RiboTag pour isoler l’ARN ribosome-associé a été examinée.
Tant pour l’entrée de type sauvage que pour les génotypes IP, la concentration d’intrants était significativement plus élevée que la concentration de propriété intellectuelle, ce qui indique qu’il y avait plus d’ARN dans l’échantillon d’entrée. Dans le total des bassins d’ARN, on s’attendait à ce que les valeurs du nombre d’arn soient proches de 10, et un RIN plus élevé était corrélé à une plus grande intégrité et qualité présumées de l’échantillon. Bien que les échantillons de propriété intellectuelle aient eu un RIN inférieur à celui des intrants, les RIN se trouvaient toujours dans une fourchette acceptable et ne dépendaient pas du génotype de l’échantillon.
En plus de se reproduire et de maintenir des conditions exemptes de RNase, les chercheurs devraient s’assurer qu’ils recueillent et conservent chaque échantillon suggéré. L’ARN d’entrée est particulièrement essentiel pour plusieurs types d’analyses en aval. Pour notre laboratoire, nous effectuons généralement le séquençage d’ARN après immunoprécipitation.
Cela nous permet d’interroger l’ensemble du dôme de transcription pour l’association ribosome. Les solutions de rechange incluraient l’analyse de microréseau ou le RT-PCR quantitatif. Pour nous, ce système nous permet d’identifier les changements dans les ARN ribosome-associés avec la mutation des protéines liantes spécifiques d’ARN.
