Ce travail a été financée par la subvention des enfants Discovery Institute MC-II-2006-1 (RDM et TED), le NIH épigénétique feuille de route de subvention [1R01DA025744-01 et 3R01DA025744-02S1] (RDM et FLMV), U01AG023746 (SC), le Saigh Fondation (FLMV et TED), 1K08CA140720-01A1 et Lemonade Alex Stand &quot;Une&quot; de soutien Prix (TED). Nous remercions le Centre d&#39;accès Genome Technology dans le département de génétique de l&#39;Université de Washington School of Medicine de l&#39;aide pour l&#39;analyse génomique. Le Centre est financé en partie par le NCI Cancer Support Centre Grant # P30 CA91842 au Centre du cancer Siteman et par ICTS / CSTC Grant # UL1RR024992 de la NationalCenter des ressources de recherche (NCRR), une composante de la National Institutes of Health (NIH), et NIH Roadmap for Medical Research. Cette publication est la seule responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement l&#39;opinion officielle de NCRR ou NIH.

<ol>
	<li>Vallania, F. L. M., Druley, T. E., Ramos, E., Wang, J., Borecki, I., Province, M., Mitra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+discovery+of+rare+insertions+and+deletions+in+large+cohorts.">High-throughput discovery of rare insertions and deletions in large cohorts.</a> Genome Research. 20, 1391-1397 (2010).</li><li>Shendure, J., Mitra, R., Varma, C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+Sequencing+Technologies:+Methods+and+Goals.">Advanced Sequencing Technologies: Methods and Goals.</a> Nature Reviews of Genetics. 5, 335-344 (2004).</li><li>The 1000 Genomes Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+map+of+human+genome+variation+from+population-scale+sequencing.">A map of human genome variation from population-scale sequencing.</a> Nature. 467, 1061-1073 (2010).</li><li>Manolio, T. A., Collins, F. S., Cox, N. J., Goldstein, D. B., Hindorff, L. A., Hunter, D. J., McCarthy, M. I., Ramos, E. M., Cardon, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+missing+heritability+of+complex+diseases.">Finding the missing heritability of complex diseases.</a> Nature. 461, 747-753 (2009).</li><li>Reich, D. E., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+allelic+spectrum+of+human+disease.">On the allelic spectrum of human disease.</a> Trends Genet. 17, 502-510 (2001).</li><li>Cohen, J. C., Kiss, R. S., Pertsemlidis, A., Marcel, Y. L., McPherson, R., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+rare+alleles+contribute+to+low+plasma+levels+of+HDL+cholesterol.">Multiple rare alleles contribute to low plasma levels of HDL cholesterol.</a> Science. 305, 869-872 (2004).</li><li>Ji, W., Foo, J. N., O'Roak, B. J., Zhao, H., Larson, M. G., Simon, D. B., Newton-Cheh, C., State, M. W., Levy, D., Lifton, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+independent+mutations+in+renal+salt+handling+genes+contribute+to+blood+pressure+variation.">Rare independent mutations in renal salt handling genes contribute to blood pressure variation.</a> Nat. Genet. 40, 592-599 (2008).</li><li>Ahituv, N., Kavaslar, N., Schackwitz, W., Ustaszewska, A., Martin, J., Hebert, S., Doelle, H., Ersoy, B., Kryukov, G., Schmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+sequencing+at+the+extremes+of+human+body+mass.">Medical sequencing at the extremes of human body mass.</a> Am. J. Hum. Genet. 80, 779-791 (2007).</li><li>Druley, T. E., Vallania, F. L., Wegner, D. J., Varley, K. E., Knowles, O. L., Bonds, J. A., Robison, S. W., Doniger, S. W., Hamvas, A., Cole, F. S., Fay, J. C., Mitra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+rare+allelic+variants+from+pooled+genomic+DNA.">Quantification of rare allelic variants from pooled genomic DNA.</a> Nat. Methods. 6, 263-265 (2009).</li><li>Mitra, R. D., Butty, V., Shendure, J., Housman, D., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+Genotyping+and+Haplotyping+with+Polymerase+Colonies.">Digital Genotyping and Haplotyping with Polymerase Colonies.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 5926-5931 (2003).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Il ya des preuves croissantes que l&#39;incidence et la réponse thérapeutique des communes, des phénotypes complexes et des maladies comme l&#39;obésité 8, l&#39;hypercholestérolémie 4, 7 et l&#39;hypertension que d&#39;autres peuvent être animée par des profils personnels de variation rare. Identifier les gènes et les voies où ces variantes globales dans les populations touchées ont de profondes implications diagnostiques et thérapeutiques, mais l&#39;analyse les personnes touchées séparément peut prendre du temps et de coûts prohibitifs. Basée sur la population d&#39;analyse offre une méthode plus efficace pour l&#39;arpentage variation génétique à des loci multiples. Nous présentons une nouvelle mise en commun d&#39;ADN protocole de séquençage jumelé avec le logiciel SPLINTER conçu pour identifier ce type de variation génétique entre les populations. Nous démontrons l&#39;exactitude de cette méthode dans l&#39;identification et la quantification des allèles mineurs au sein d&#39;une population importante mise en commun de 947 personnes, y compris les variantes rares qui étaientappelé de novo à partir du séquençage commun et validé par pyroséquençage individuelle. Notre stratégie se différencie principalement de protocoles autres par l&#39;incorporation d&#39;un positif et un contrôle négatif au sein de chaque expérience. Cela permet d&#39;atteindre une précision SPLINTER beaucoup plus élevé et la puissance par rapport à d&#39;autres approches 1. La couverture optimale de 25 fois par allèle est fixé indépendamment de la taille de la piscine, faisant l&#39;analyse de grands bassins possible que cette condition que les échelles de façon linéaire avec la taille du pool. Notre approche est très flexible et peut être appliquée à n&#39;importe quel phénotype d&#39;intérêt, mais aussi à des échantillons qui sont naturellement hétérogènes, tels que des populations de cellules mixtes et des biopsies tumorales. Compte tenu de l&#39;intérêt sans cesse croissant dans le séquençage de mise en commun des régions cibles importantes telles que la exome ou du génome, notre préparation bibliothèque et de l&#39;analyse SPLINTER est compatible avec mesure de capture et l&#39;ensemble de exome séquençage, mais l&#39;utilité d&#39;alignement dans le paquet SPLINTER n&#39;était pas conçu pour grandséquences de références. Par conséquent, nous avons utilisé avec succès l&#39;alignement de la programmation dynamique, Novoalign, pour l&#39;ensemble du génome alignements suivies par la variante d&#39;appel de l&#39;échantillon global (Ramos et al., Soumis). Ainsi, notre stratégie de séquençage en commun peut évoluer avec succès à de plus grandes piscines avec des quantités croissantes de la séquence cible.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Section </td></tr><tr><td> PfuUltra Haute Fidélité </td><td> Agilent </td><td> 600384 </td><td> 1.4 </td></tr><tr><td> La bétaïne </td><td> SIGMA </td><td> B2629 </td><td> 1.4 </td></tr><tr><td> M13mp18 ADNsb vecteur </td><td> ONÉ </td><td> N4040S </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> pGEM-T Easy </td><td> Promega </td><td> A1360 </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> T4 polynucléotide kinase </td><td> ONÉ </td><td> M0201S </td><td> 2.2 </td></tr><tr><td> Ligase T4 </td><td> ONÉ </td><td> M0202S </td><td> 2.2 </td></tr><tr><td> Polyéthylène glycol 8000 MW </td><td> SIGMA </td><td> P5413 </td><td> 2.2 </td></tr><tr><td> Sonicateur Bioruptor </td><td> Diagenode </td><td> UCD-200-TS</td><td> 2.3 </td></tr></tbody></table>

detection of rare genomic variants from pooled sequencing using splinter

Comme la technologie de séquençage d&#39;ADN a nettement progressé ces dernières années 2, il est devenu de plus en plus évident que le montant de la variation génétique entre deux individus quelconques est supérieure qu&#39;on ne le pensait 3. En revanche, basée sur la baie de génotypage n&#39;a pas réussi à identifier une contribution significative de variantes de séquences communes à la variabilité phénotypique de la maladie commune 4,5. Pris ensemble, ces observations ont conduit à l&#39;évolution de la maladie commune / hypothèse variante rare ce qui suggère que la majorité de la «héritabilité manquant» dans phénotypes communs et complexe est plutôt due à profil personnel d&#39;un individu de variants d&#39;ADN rares ou privé 6-8 . Toutefois, caractériser la manière dont la variation influe rares phénotypes complexes nécessite l&#39;analyse de nombreuses personnes touchées à de nombreux loci génomiques, et est idéalement par rapport à une enquête similaire dans une cohorte affectée. Malgré la puissance offerte par les plates-formes de séquençage d&#39;aujourd&#39;hui, unbasée sur la population des loci génomiques de nombreux et l&#39;analyse subséquente de calcul nécessaire reste prohibitif pour de nombreux chercheurs. Pour répondre à ce besoin, nous avons développé une approche de séquençage en commun 1,9 et un paquet de nouveaux logiciels de détection de 1 pour la variante haute précision rare à partir des données qui en résultent. La capacité de génomes piscine à partir des populations entières de personnes touchées et de l&#39;enquête du degré de variation génétique au niveau de plusieurs régions ciblées dans une bibliothèque de séquençage simple offre d&#39;excellentes économies de temps et à la méthodologie de séquençage traditionnel échantillon unique. Avec une couverture moyenne par séquençage de l&#39;allèle de 25 fois, notre algorithme personnalisé, SPLINTER, utilise une stratégie de variante de contrôle interne appelant à appeler des insertions, des suppressions et les substitutions jusqu&#39;à quatre paires de bases en longueur avec une grande sensibilité et la spécificité de piscines allant jusqu&#39;à 1 allèle mutant dans 500 individus. Nous décrivons ici la méthode pour la préparation de la mise en commun sequencing bibliothèque suivie d&#39;une étape-par-étape sur la façon d&#39;utiliser le package SPLINTER pour l&#39;analyse de séquençage en commun ( <a href="http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter" target="_blank">http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter</a> ). Nous montrons une comparaison entre le séquençage commun de 947 personnes, qui ont tous également subi l&#39;échelle du génome tableau, à plus de 20kb de séquençage par personne. Concordance entre le génotypage de marquage et de nouveaux variants appelés dans l&#39;échantillon cumulé étaient excellents. Cette méthode peut être facilement mise à l&#39;échelle jusqu&#39;à un certain nombre de loci génomiques et n&#39;importe quel nombre de personnes. En intégrant les contrôles internes amplicons positifs et négatifs à des taux qui imitent la population à l&#39;étude, l&#39;algorithme peut être calibré pour des performances optimales. Cette stratégie peut également être modifié pour une utilisation avec la capture d&#39;hybridation ou spécifiques à l&#39;individu des codes à barres et peut être appliquée au séquençage d&#39;échantillons naturellement hétérogènes, tels que l&#39;ADN tumoral.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER at JoVE.com

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

Séquençage de l&#39;ADN groupé est une stratégie rapide et rentable de détecter les variants rares associés à des phénotypes complexes dans de grandes cohortes. Nous décrivons ici l&#39;analyse computationnelle de mise en commun, séquençage de prochaine génération de 32 gènes liés au cancer en utilisant le logiciel SPLINTER. Cette méthode est évolutive, et applicable à tout phénotype d&#39;intérêt.

Détection de rares variantes génomiques à partir de séquençage regroupés à l&#39;aide SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

detection-rare-genomic-variants-from-pooled-sequencing-using

Research

JoVE Journal

Biology

15.0K vues.  Washington University School of Medicine. Séquençage de l'ADN groupé est une stratégie rapide et rentable de détecter les variants rares associés à des phénotypes complexes dans de grandes cohortes. Nous décrivons ici l'analyse computationnelle de mise en commun, séquençage de prochaine génération de 32 gènes liés au cancer en utilisant le logiciel SPLINTER. Cette méthode est évolutive, et applicable à tout phénotype d'intérêt.