Este trabalho foi financiado pelo Discovery das Crianças Instituto concessão MC-II-2006-1 (RDM e TED), o NIH Epigenetics Roteiro concessão [1R01DA025744-01 e 3R01DA025744-02S1] (RDM e FLMV), U01AG023746 (SC), o Saigh Foundation (FLMV e TED), 1K08CA140720-01A1 e Alex Lemonade Stand &quot;A&quot; apoio Award (TED). Agradecemos ao Centro do Genoma Acesso à Tecnologia do Departamento de Genética da Washington University School of Medicine de ajuda com a análise genômica. O Centro é parcialmente financiado pelo NCI Cancer Support Center Grant P30 CA91842 # para o Centro de Câncer Siteman e pela ICTS / CTSA Grant # UL1RR024992 do National Center for Research Resources (NCRR), um componente do National Institutes of Health (NIH), e NIH Roadmap for Medical Research. Esta publicação é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente a posição oficial do NCRR ou NIH.

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	<li>Vallania, F. L. M., Druley, T. E., Ramos, E., Wang, J., Borecki, I., Province, M., Mitra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+discovery+of+rare+insertions+and+deletions+in+large+cohorts.">High-throughput discovery of rare insertions and deletions in large cohorts.</a> Genome Research. 20, 1391-1397 (2010).</li><li>Shendure, J., Mitra, R., Varma, C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+Sequencing+Technologies:+Methods+and+Goals.">Advanced Sequencing Technologies: Methods and Goals.</a> Nature Reviews of Genetics. 5, 335-344 (2004).</li><li>The 1000 Genomes Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+map+of+human+genome+variation+from+population-scale+sequencing.">A map of human genome variation from population-scale sequencing.</a> Nature. 467, 1061-1073 (2010).</li><li>Manolio, T. A., Collins, F. S., Cox, N. J., Goldstein, D. B., Hindorff, L. A., Hunter, D. J., McCarthy, M. I., Ramos, E. M., Cardon, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+missing+heritability+of+complex+diseases.">Finding the missing heritability of complex diseases.</a> Nature. 461, 747-753 (2009).</li><li>Reich, D. E., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+allelic+spectrum+of+human+disease.">On the allelic spectrum of human disease.</a> Trends Genet. 17, 502-510 (2001).</li><li>Cohen, J. C., Kiss, R. S., Pertsemlidis, A., Marcel, Y. L., McPherson, R., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+rare+alleles+contribute+to+low+plasma+levels+of+HDL+cholesterol.">Multiple rare alleles contribute to low plasma levels of HDL cholesterol.</a> Science. 305, 869-872 (2004).</li><li>Ji, W., Foo, J. N., O'Roak, B. J., Zhao, H., Larson, M. G., Simon, D. B., Newton-Cheh, C., State, M. W., Levy, D., Lifton, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+independent+mutations+in+renal+salt+handling+genes+contribute+to+blood+pressure+variation.">Rare independent mutations in renal salt handling genes contribute to blood pressure variation.</a> Nat. Genet. 40, 592-599 (2008).</li><li>Ahituv, N., Kavaslar, N., Schackwitz, W., Ustaszewska, A., Martin, J., Hebert, S., Doelle, H., Ersoy, B., Kryukov, G., Schmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+sequencing+at+the+extremes+of+human+body+mass.">Medical sequencing at the extremes of human body mass.</a> Am. J. Hum. Genet. 80, 779-791 (2007).</li><li>Druley, T. E., Vallania, F. L., Wegner, D. J., Varley, K. E., Knowles, O. L., Bonds, J. A., Robison, S. W., Doniger, S. W., Hamvas, A., Cole, F. S., Fay, J. C., Mitra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+rare+allelic+variants+from+pooled+genomic+DNA.">Quantification of rare allelic variants from pooled genomic DNA.</a> Nat. Methods. 6, 263-265 (2009).</li><li>Mitra, R. D., Butty, V., Shendure, J., Housman, D., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+Genotyping+and+Haplotyping+with+Polymerase+Colonies.">Digital Genotyping and Haplotyping with Polymerase Colonies.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 5926-5931 (2003).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Existe uma evidência crescente que a incidência e resposta terapêutica de comuns, fenótipos complexos e doenças tais como a obesidade 8, hipercolesterolemia 4, hipertensão 7 e outros podem ser moderadas por perfis pessoais de variação rara. Identificar os genes e as vias onde essas variantes agregadas em populações afetadas terão profundas implicações diagnósticas e terapêuticas, mas analisando separadamente os indivíduos afetados pode ser o tempo e custo proibitivo. De base populacional análise oferece um método mais eficiente para o levantamento da variação genética em locos múltiplos. Apresentamos um novo reunidas DNA-protocolo sequenciação emparelhado com o pacote de software SPLINTER desenhados para identificar este tipo de variação genética através de populações. Demonstramos a precisão deste método na identificação e quantificação alelos menores dentro de uma grande população combinada de 947 indivíduos, incluindo as variantes raras que eramchamado de novo a partir da sequência reunidas e validado por pyrosequencing individual. A nossa estratégia principalmente difere de outros protocolos pela incorporação de um positivo e um controlo negativo dentro de cada experiência. Isso permite que SPLINTER para conseguir uma precisão muito maior e de energia em comparação com outras abordagens 1. A cobertura óptima de 25 vezes por alelo é fixado de forma independente do tamanho da piscina, tornando a análise de agrupamentos de grandes viável como este requisito apenas as escalas linearmente com o tamanho da piscina. A nossa abordagem é muito flexível e pode ser aplicado a qualquer fenótipo de interesse, mas também para amostras que são naturalmente heterogénea, tais como as populações de células mistas e biópsias de tumores. Dado o interesse cada vez maior na seqüência combinada de regiões-alvo de grande porte como o exome ou genoma, a nossa biblioteca de preparação e análise SPLINTER é compatível com o costume de captura e de todo o exome seqüenciamento, mas o utilitário de alinhamento no pacote SPLINTER não foi projetado para grandesequências de referências. Portanto, temos utilizado com sucesso o alinhador de programação dinâmica, Novoalign, para genome-wide alinhamentos seguido de variante ligando a amostra conjunta (Ramos et al., Submetido). Assim, nossa estratégia de seqüenciamento de pool pode escalar com sucesso para piscinas maiores, com quantidades crescentes de sequência alvo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Seção </td></tr><tr><td> PfuUltra Alta Fidelidade </td><td> Agilent </td><td> 600384 </td><td> 1,4 </td></tr><tr><td> Betaína </td><td> SIGMA </td><td> B2629 </td><td> 1,4 </td></tr><tr><td> M13mp18 ssDNA vector </td><td> NEB </td><td> N4040S </td><td> 1,5 </td></tr><tr><td> pGEM-T Easy </td><td> Promega </td><td> A1360 </td><td> 1,5 </td></tr><tr><td> Quinase de polinucleótido T4 </td><td> NEB </td><td> M0201S </td><td> 2,2 </td></tr><tr><td> Ligase de T4 </td><td> NEB </td><td> M0202S </td><td> 2,2 </td></tr><tr><td> Polietileno Glicol 8000 MW </td><td> SIGMA </td><td> P5413 </td><td> 2,2 </td></tr><tr><td> Sonicador Bioruptor </td><td> Diagenode </td><td> UCD-200-TS</td><td> 2,3 </td></tr></tbody></table>

detection of rare genomic variants from pooled sequencing using splinter

Como tecnologia de seqüenciamento de DNA foi marcadamente avançou nos últimos anos 2, tornou-se cada vez mais evidente que a quantidade de variação genética entre dois indivíduos é maior do que se pensava anteriormente 3. Em contraste, uma matriz baseada em genotipagem falhou para identificar uma contribuição significativa de variantes da sequência de comuns para a variabilidade fenotípica de doença comum 4,5. Tomados em conjunto, essas observações levaram à evolução da doença comum / variante rara hipótese sugerindo que a maioria da &quot;herdabilidade perdido&quot; em fenótipos comuns e complexas, em vez disso, devido ao perfil pessoal de um indivíduo de variantes raras de DNA ou privada 6-8 . No entanto, caracterizando como rara variação impacta fenótipos complexos requer a análise de muitos indivíduos afetados em muitos loci genômicos, e está idealmente comparado a uma pesquisa similar em uma coorte afetados. Apesar do poder de sequenciação oferecida pelas plataformas de hoje, umainquérito de base populacional de loci genômicos muitos e posterior análise computacional requerido continua proibitivo para muitos investigadores. Para atender a essa necessidade, desenvolvemos uma abordagem conjunta seqüenciamento 1,9 e um pacote de software para a detecção de um romance variante de alta precisão rara a partir dos dados resultantes. A capacidade de genomas piscina de populações inteiras de indivíduos afetados e levantamento do grau de variação genética em várias regiões-alvo em uma biblioteca de sequenciamento único proporciona excelentes economias em custo e tempo com a metodologia tradicional seqüenciamento amostra única. Com uma cobertura média por sequenciação do alelo de 25 vezes, o algoritmo personalizado, lasca, utiliza uma variante interna estratégia de controlo de chamada para chamar inserções, deleções e substituições até quatro pares de bases de comprimento, com elevada sensibilidade e especificidade de pools de até 1 alelo mutante em 500 indivíduos. Descrevemos aqui o método para a preparação do s reunidasequencing biblioteca seguido passo-a-passo sobre como usar o pacote SPLINTER para análise da sequenciação agrupada ( <a href="http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter" target="_blank">http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter</a> ). Nós mostramos uma comparação entre sequenciamento combinada de 947 indivíduos, os quais também foram submetidos genome-wide array, em mais de 20kb de seqüenciamento por pessoa. Concordância entre genotipagem de marcado e novas variantes chamadas na amostra composta foram excelentes. Este método pode ser facilmente dimensionada para qualquer número de loci genómicas e qualquer número de indivíduos. Ao incorporar os controles internos amplicon positivos e negativos em proporções que imitam a população em estudo, o algoritmo pode ser calibrado para um ótimo desempenho. Esta estratégia pode também ser modificados para utilização com captura de hibridação ou indivíduo específicos códigos de barras e pode ser aplicado para a sequenciação de amostras naturalmente heterogéneos, tais como o DNA do tumor.

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Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

Seqüenciamento de DNA pool é uma estratégia rápida e de custo eficaz para detectar variantes raras associadas com fenótipos complexos em grandes grupos. Aqui descrevemos a análise computacional de pool, o seqüenciamento da próxima geração de 32 genes relacionados ao câncer, utilizando o pacote de software SPLINTER. Este método é escalável, e aplicável a qualquer fenótipo de interesse.

Detecção de variantes raras genômico de Seqüenciamento combinados usando SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

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