Diese Arbeit wurde von der Kinder-Discovery Institute Zuschuss MC-II-2006-1 (RDM und TED), der NIH Epigenetik Roadmap Zuschuss [1R01DA025744-01 und 3R01DA025744-02S1] (RDM und FLMV), U01AG023746 (SC), die Saigh unterstützt Foundation (FLMV und TED), 1K08CA140720-01A1 und Alex &#39;Lemonade Stand &quot;A&quot;-Award-Unterstützung (TED). Wir danken dem Access-Genome Technology Center in der Abteilung für Genetik an der Washington University School of Medicine um Hilfe bei der Genomanalyse. Das Zentrum wird teilweise durch NCI Cancer Center Support Grant # P30 CA91842 dem Siteman Cancer Center und von ICTS / CTSA Grant # UL1RR024992 aus dem NationalCenter for Research Resources (NCRR), eine Komponente von den National Institutes of Health (NIH) unterstützt wird, und NIH-Roadmap for Medical Research. Diese Publikation ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung der NCRR oder NIH.

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	<li>Vallania, F. L. M., Druley, T. E., Ramos, E., Wang, J., Borecki, I., Province, M., Mitra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+discovery+of+rare+insertions+and+deletions+in+large+cohorts.">High-throughput discovery of rare insertions and deletions in large cohorts.</a> Genome Research. 20, 1391-1397 (2010).</li><li>Shendure, J., Mitra, R., Varma, C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+Sequencing+Technologies:+Methods+and+Goals.">Advanced Sequencing Technologies: Methods and Goals.</a> Nature Reviews of Genetics. 5, 335-344 (2004).</li><li>The 1000 Genomes Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+map+of+human+genome+variation+from+population-scale+sequencing.">A map of human genome variation from population-scale sequencing.</a> Nature. 467, 1061-1073 (2010).</li><li>Manolio, T. A., Collins, F. S., Cox, N. J., Goldstein, D. B., Hindorff, L. A., Hunter, D. J., McCarthy, M. I., Ramos, E. M., Cardon, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+missing+heritability+of+complex+diseases.">Finding the missing heritability of complex diseases.</a> Nature. 461, 747-753 (2009).</li><li>Reich, D. E., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+allelic+spectrum+of+human+disease.">On the allelic spectrum of human disease.</a> Trends Genet. 17, 502-510 (2001).</li><li>Cohen, J. C., Kiss, R. S., Pertsemlidis, A., Marcel, Y. L., McPherson, R., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+rare+alleles+contribute+to+low+plasma+levels+of+HDL+cholesterol.">Multiple rare alleles contribute to low plasma levels of HDL cholesterol.</a> Science. 305, 869-872 (2004).</li><li>Ji, W., Foo, J. N., O'Roak, B. J., Zhao, H., Larson, M. G., Simon, D. B., Newton-Cheh, C., State, M. W., Levy, D., Lifton, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+independent+mutations+in+renal+salt+handling+genes+contribute+to+blood+pressure+variation.">Rare independent mutations in renal salt handling genes contribute to blood pressure variation.</a> Nat. Genet. 40, 592-599 (2008).</li><li>Ahituv, N., Kavaslar, N., Schackwitz, W., Ustaszewska, A., Martin, J., Hebert, S., Doelle, H., Ersoy, B., Kryukov, G., Schmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+sequencing+at+the+extremes+of+human+body+mass.">Medical sequencing at the extremes of human body mass.</a> Am. J. Hum. Genet. 80, 779-791 (2007).</li><li>Druley, T. E., Vallania, F. L., Wegner, D. J., Varley, K. E., Knowles, O. L., Bonds, J. A., Robison, S. W., Doniger, S. W., Hamvas, A., Cole, F. S., Fay, J. C., Mitra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+rare+allelic+variants+from+pooled+genomic+DNA.">Quantification of rare allelic variants from pooled genomic DNA.</a> Nat. Methods. 6, 263-265 (2009).</li><li>Mitra, R. D., Butty, V., Shendure, J., Housman, D., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+Genotyping+and+Haplotyping+with+Polymerase+Colonies.">Digital Genotyping and Haplotyping with Polymerase Colonies.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 5926-5931 (2003).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Es gibt zunehmend Hinweise, dass die Inzidenz und therapeutische Reaktion von gemeinsamen, komplexen Phänotypen und Krankheiten wie Fettleibigkeit 8, 4 Hypercholesterinämie, Hypertonie 7 und andere durch persönliche Profile von seltenen Variation kann moderiert werden. Identifikation der Gene und Signalwege, wo diese Varianten Aggregat in die betroffene Bevölkerung tiefe diagnostische und therapeutische Implikationen haben wird, aber die Analyse Betroffenen separat Zeit sein und unerschwinglich. Populations-basierte Analyse bietet eine effizientere Methode zur Erfassung genetischer Variation an verschiedenen Loci. Wir stellen eine neue gepoolte-DNA-Sequenzierung-Protokoll mit der Splinter-Software-Paket entwickelt, um diese Art der genetischen Unterschiede zwischen den Populationen zu identifizieren gepaart. Wir zeigen die Genauigkeit dieser Methode bei der Identifizierung und Quantifizierung von kleineren Allele innerhalb eines großen gepoolten Population von 947 Personen, darunter seltene Varianten, die warenDe-novo-Sequenzierung aus der gepoolten genannt und validiert durch einzelne Pyrosequenzierung. Unsere Strategie unterscheiden sich von anderen Protokollen durch den Einbau von einer positiven und einer negativen Kontrolle in jedem Versuch. Dies ermöglicht SPLINTER viel höhere Genauigkeit und Leistung im Vergleich zu anderen Ansätzen 1 zu erzielen. Die optimale Abdeckung von 25-fach pro Allel wird unabhängig von der Größe des Pools, fixiert damit die Analyse von großen Pools möglich wie diese Anforderung nur skaliert linear mit der Größe des Pools. Unser Ansatz ist sehr flexibel und kann an jeden Phänotyp von Interesse, sondern auch für Proben, die von Natur aus heterogen sind, wie gemischte Zellpopulationen und Tumorbiopsien angewendet werden. Angesichts der ständig wachsenden Interesse an der gepoolten Sequenzierung von großen Zielregionen wie die Exom oder Genom, ist unsere Bibliothek prep und Splinter Analyse kompatibel mit Custom-Abscheidung und-ganze-Exom Sequenzierung, aber die Angleichung Dienstprogramm in der Splinter-Paket wurde nicht entwickelt für großArtikeln Sequenzen. Deshalb haben wir erfolgreich die dynamische Programmierung Aligner eingesetzt, für genomweite Ausrichtungen durch Aufruf Variante aus der Sammelprobe (Ramos et al., Eingereicht) gefolgt Novoalign. So können unsere vereinigt Sequenzierungs-Strategie erfolgreich zu skalieren auf größere mit steigenden Mengen an Ziel-Sequenz.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagenz Namen </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Abschnitt </td></tr><tr><td> PfuUltra High-Fidelity </td><td> Agilent </td><td> 600384 </td><td> 1,4 </td></tr><tr><td> Betain </td><td> SIGMA </td><td> B2629 </td><td> 1,4 </td></tr><tr><td> M13mp18 ssDNA-Vektor </td><td> NEB </td><td> N4040S </td><td> 1,5 </td></tr><tr><td> pGEM-T Easy </td><td> Promega </td><td> A1360 </td><td> 1,5 </td></tr><tr><td> T4 Polynukleotidkinase </td><td> NEB </td><td> M0201S </td><td> 2,2 </td></tr><tr><td> T4-Ligase </td><td> NEB </td><td> M0202S </td><td> 2,2 </td></tr><tr><td> Polyethylenglykol 8000 MW </td><td> SIGMA </td><td> P5413 </td><td> 2,2 </td></tr><tr><td> Bioruptor Sonicator </td><td> Diagenode </td><td> UCD-200-TS</td><td> 2,3 </td></tr></tbody></table>

detection of rare genomic variants from pooled sequencing using splinter

Als DNA-Sequenzierung-Technologie hat sich in den letzten Jahren 2 vorgeschoben hat sich immer deutlicher gezeigt, dass die Menge an genetischer Variation zwischen zwei beliebigen Individuen größer als bisher angenommen 3 ist. Im Gegensatz dazu hat sich Array-basierte Genotypisierung konnten keine signifikante Anteil an gemeinsamen Sequenzvarianten auf die phänotypische Variabilität von 4,5 häufige Erkrankung zu identifizieren. Zusammengenommen haben diese Beobachtungen auf die Entwicklung der Volkskrankheit / seltene Variante Hypothese, dass die Mehrheit der &quot;fehlenden Erblichkeit&quot; in gemeinsamen und komplexen Phänotypen statt beruht auf einer individuellen persönlichen Profil von seltenen oder private DNA-Varianten 8.6 geführt . Allerdings charakterisieren, wie selten Variation komplexen Phänotypen beeinflusst erfordert die Analyse von vielen Betroffenen an vielen genomischen Loci, und eignet sich ideal zu einer ähnlichen Befragung in einem nicht betroffenen Kohorte verglichen. Trotz der Macht durch die Sequenzierung der heutigen Plattformen, eine angebotenebevölkerungsbezogene Umfrage von vielen genomischen Loci und der anschließenden computergestützten Analyse erforderlich bleibt unerschwinglich für viele Forscher. Um diesem Bedarf zu begegnen, haben wir eine Pool-Sequenzierung Ansatz 1,9 und eine neuartige Software-Paket 1 für hochgenaue Erfassung seltene Variante aus den resultierenden Daten entwickelt. Die Fähigkeit, Pool Genome von ganzen Populationen von betroffenen Einzelpersonen und Befragung der Grad der genetischen Variation an verschiedenen Zielregionen in einer einzigen Bibliothek Sequenzierung bietet eine hervorragende Kosten-und Zeitersparnis zu herkömmlichen Single-Probe-Sequenzierung Methodik. Mit einer mittleren Sequenzierung Deckung pro Allel des 25-fachen, nutzt unsere benutzerdefinierten Algorithmus, Splinter, eine interne Variante Aufruf Regelstrategie zu Insertionen, Deletionen und Substitutionen rufen bis zu vier Basenpaare lang mit hoher Sensitivität und Spezifität aus Pools von bis zu 1 mutierte Allel in 500 Individuen. Hier beschreiben wir die Verfahren zur Herstellung der gepoolten sequencing Bibliothek gefolgt von Schritt-für-Schritt-Anleitung, den Splitter-Paket für gepoolten Analyse Sequenzierung (verwenden <a href="http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter" target="_blank">http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter</a> ). Wir zeigen einen Vergleich zwischen gepoolten Sequenzierung von 947 Individuen, von denen alle unterzog sich auch genomweite Array, an über 20kb der Sequenzierung pro Person. Übereinstimmung zwischen Genotypisierung von getaggt und neue Varianten in der Sammelprobe genannt waren ausgezeichnet. Diese Methode kann einfach skaliert werden bis zu einer beliebigen Anzahl von genomischen Loci und einer beliebigen Anzahl von Individuen. Durch die Integration der internen positiven und negativen Kontrollen Amplikon in Verhältnissen, die die Bevölkerung imitieren untersuchten, kann der Algorithmus für eine optimale Leistung zu kalibrieren. Diese Strategie kann auch zur Verwendung mit der Hybridisierung Fang oder individualspezifischen Barcodes geändert werden und dann zur Sequenzierung von natürlich heterogenen Proben, wie Tumor-DNA eingesetzt werden.

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Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

Pooled DNA-Sequenzierung ist eine schnelle und kostengünstige Strategie, um seltene Varianten mit komplexen Phänotypen assoziiert in großen Kohorten zu erkennen. Hier beschreiben wir die computergestützte Analyse von gepoolten, Next-Generation-Sequenzierung von 32 Krebs-Genen unter Verwendung des SPLINTER Software-Paket. Diese Methode ist skalierbar und für jeden interessierenden Phänotyp.

Nachweis seltener Varianten von Genomic Pooled-Sequenzierung mit SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

detection-rare-genomic-variants-from-pooled-sequencing-using

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Biology

15.0K Aufrufe.  Washington University School of Medicine. Pooled DNA-Sequenzierung ist eine schnelle und kostengünstige Strategie, um seltene Varianten mit komplexen Phänotypen assoziiert in großen Kohorten zu erkennen. Hier beschreiben wir die computergestützte Analyse von gepoolten, Next-Generation-Sequenzierung von 32 Krebs-Genen unter Verwendung des SPLINTER Software-Paket. Diese Methode ist skalierbar und für jeden interessierenden Phänotyp.