Questo lavoro è stato supportato da Discovery dei bambini dell&#39;Istituto concessione MC-II-2006-1 (RDM e TED), il NIH Epigenetica Roadmap sovvenzione [1R01DA025744-01 e 3R01DA025744-02S1] (RDM e FLMV), U01AG023746 (SC), il Saigh Foundation (FLMV e TED), 1K08CA140720-01A1 e Lemonade stand di Alex &quot;A&quot; di supporto Award (TED). Ringraziamo il Genome Technology Center di accesso presso il Dipartimento di Genetica presso la Washington University School of Medicine di aiuto con l&#39;analisi genomica. Il Centro è parzialmente supportato dal Servizio Supporto NCI di Grant Cancer Center # P30 CA91842 al Cancer Center Siteman e ICTS / CTSA Grant N. UL1RR024992 dal NationalCenter per le Risorse Ricerca (NCRR), un componente del National Institutes of Health (NIH), e NIH Roadmap for Medical Research. Questa pubblicazione è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente l&#39;opinione ufficiale di NCRR o NIH.

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	<li>Vallania, F. L. M., Druley, T. E., Ramos, E., Wang, J., Borecki, I., Province, M., Mitra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+discovery+of+rare+insertions+and+deletions+in+large+cohorts.">High-throughput discovery of rare insertions and deletions in large cohorts.</a> Genome Research. 20, 1391-1397 (2010).</li><li>Shendure, J., Mitra, R., Varma, C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+Sequencing+Technologies:+Methods+and+Goals.">Advanced Sequencing Technologies: Methods and Goals.</a> Nature Reviews of Genetics. 5, 335-344 (2004).</li><li>The 1000 Genomes Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+map+of+human+genome+variation+from+population-scale+sequencing.">A map of human genome variation from population-scale sequencing.</a> Nature. 467, 1061-1073 (2010).</li><li>Manolio, T. A., Collins, F. S., Cox, N. J., Goldstein, D. B., Hindorff, L. A., Hunter, D. J., McCarthy, M. I., Ramos, E. M., Cardon, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+missing+heritability+of+complex+diseases.">Finding the missing heritability of complex diseases.</a> Nature. 461, 747-753 (2009).</li><li>Reich, D. E., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+allelic+spectrum+of+human+disease.">On the allelic spectrum of human disease.</a> Trends Genet. 17, 502-510 (2001).</li><li>Cohen, J. C., Kiss, R. S., Pertsemlidis, A., Marcel, Y. L., McPherson, R., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+rare+alleles+contribute+to+low+plasma+levels+of+HDL+cholesterol.">Multiple rare alleles contribute to low plasma levels of HDL cholesterol.</a> Science. 305, 869-872 (2004).</li><li>Ji, W., Foo, J. N., O'Roak, B. J., Zhao, H., Larson, M. G., Simon, D. B., Newton-Cheh, C., State, M. W., Levy, D., Lifton, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+independent+mutations+in+renal+salt+handling+genes+contribute+to+blood+pressure+variation.">Rare independent mutations in renal salt handling genes contribute to blood pressure variation.</a> Nat. Genet. 40, 592-599 (2008).</li><li>Ahituv, N., Kavaslar, N., Schackwitz, W., Ustaszewska, A., Martin, J., Hebert, S., Doelle, H., Ersoy, B., Kryukov, G., Schmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+sequencing+at+the+extremes+of+human+body+mass.">Medical sequencing at the extremes of human body mass.</a> Am. J. Hum. Genet. 80, 779-791 (2007).</li><li>Druley, T. E., Vallania, F. L., Wegner, D. J., Varley, K. E., Knowles, O. L., Bonds, J. A., Robison, S. W., Doniger, S. W., Hamvas, A., Cole, F. S., Fay, J. C., Mitra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+rare+allelic+variants+from+pooled+genomic+DNA.">Quantification of rare allelic variants from pooled genomic DNA.</a> Nat. Methods. 6, 263-265 (2009).</li><li>Mitra, R. D., Butty, V., Shendure, J., Housman, D., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+Genotyping+and+Haplotyping+with+Polymerase+Colonies.">Digital Genotyping and Haplotyping with Polymerase Colonies.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 5926-5931 (2003).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

C&#39;è una crescente evidenza che l&#39;incidenza e la risposta terapeutica dei comuni fenotipi complessi e le malattie come l&#39;obesità 8, 4 ipercolesterolemia, ipertensione 7 e altri possono essere moderato da profili personali di variazione rare. Identificare i geni e le vie in cui queste varianti aggregati in popolazioni colpite avranno profonde implicazioni diagnostiche e terapeutiche, ma analizzando separatamente gli individui affetti possono essere tempi e costi proibitivi. Basato sulla popolazione analisi offre un metodo più efficiente per la rilevazione variazione genetica a loci multipli. Vi presentiamo un nuovo pool-protocollo di sequenziamento del DNA in coppia con il pacchetto software SPLINTER progettato per identificare questo tipo di variazione genetica nelle popolazioni. Dimostriamo l&#39;accuratezza di questo metodo per identificare e quantificare gli alleli minori all&#39;interno di una vasta popolazione aggregata di 947 persone, incluse le varianti rare che eranochiamato de novo dal sequenziamento pool e convalidati da pirosequenziamento individuale. La strategia differisce principalmente da altri protocolli per l&#39;incorporazione di un controllo positivo e uno negativo in ogni esperimento. Questo permette SPLINTER di ottenere una precisione molto più elevata e potenza rispetto ad altre soluzioni 1. La copertura ottimale di 25-volte per allele è fissata indipendentemente dalla dimensione della piscina, rendendo l&#39;analisi di grandi vasche fattibile questo requisito solo bilance linearmente con la dimensione del pool. Il nostro approccio è molto flessibile e può essere applicato a qualsiasi fenotipo di interesse, ma anche a campioni che sono naturalmente eterogenei, come le popolazioni di cellule miste e biopsie tumorali. Dato il crescente interesse per la sequenza in pool dalle regioni di destinazione di grandi dimensioni come il exome o genoma, la nostra preparazione biblioteca e l&#39;analisi SPLINTER è compatibile con i costumi-capture e con tutto il exome sequenziamento, ma l&#39;utilità di allineamento nel pacchetto SPLINTER non è stato progettato per granderiferimenti sequenze. Pertanto, abbiamo utilizzato con successo la mascherina di programmazione dinamica, Novoalign, per genome-wide allineamenti seguiti da variante chiamando dal campione composito (Ramos et al., Ha presentato). Quindi, la nostra strategia di sequenziamento pool in grado di scalare con successo per piscine di grandi dimensioni con quantità crescenti di sequenza bersaglio.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente Nome </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Sezione </td></tr><tr><td> PfuUltra High-Fidelity </td><td> Agilent </td><td> 600384 </td><td> 1,4 </td></tr><tr><td> Betaina </td><td> SIGMA </td><td> B2629 </td><td> 1,4 </td></tr><tr><td> M13mp18 ssDNA vettore </td><td> NEB </td><td> N4040S </td><td> 1,5 </td></tr><tr><td> pGEM-T facile </td><td> Promega </td><td> A1360 </td><td> 1,5 </td></tr><tr><td> Polinucleotide chinasi T4 </td><td> NEB </td><td> M0201S </td><td> 2,2 </td></tr><tr><td> Ligasi T4 </td><td> NEB </td><td> M0202S </td><td> 2,2 </td></tr><tr><td> Polietilene glicole 8000 MW </td><td> SIGMA </td><td> P5413 </td><td> 2,2 </td></tr><tr><td> Bioruptor ultrasuoni </td><td> Diagenode </td><td> UCD-200-TS</td><td> 2,3 </td></tr></tbody></table>

detection of rare genomic variants from pooled sequencing using splinter

Come tecnologia di sequenziamento del DNA è nettamente avanti negli ultimi anni 2, è diventato sempre più evidente che la quantità di variazione genetica tra due individui è maggiore di quanto si pensasse 3. Al contrario, array-based genotipizzazione non è riuscito a identificare un contributo significativo di varianti di sequenza comuni per la variabilità fenotipica di malattia comune 4,5. Prese insieme, queste osservazioni hanno portato alla evoluzione della malattia comune / ipotesi Variant Rare suggerendo che la maggioranza dei &quot;ereditabilità mancante&quot; in fenotipi comuni e complesso è invece dovuta al profilo personale di un individuo di varianti di DNA rare o private 6-8 . Tuttavia, caratterizzando come la variazione raro impatto fenotipi complessi richiede l&#39;analisi di molti individui affetti in molti loci genomici, ed è idealmente rispetto a un&#39;indagine simile in una coorte inalterato. Nonostante la potenza sequenza offerto dalle piattaforme di oggi,basato sulla popolazione sondaggio di molti loci genomici e la successiva analisi computazionale richiesto rimane proibitivo per molti ricercatori. Per rispondere a questa esigenza, abbiamo sviluppato un approccio di sequenziamento pool 1,9 e un pacchetto software nuovo 1 per il rilevamento ad alta precisione rara variante dai dati risultanti. La capacità di genomi piscina da intere popolazioni di individui interessati e di indagine il grado di variazione genetica a più aree mirate in una libreria sequenza unica, offre ottimi risparmi sui costi e il tempo alla tradizionale single-campione metodologia di sequenziamento. Con una copertura di sequenziamento per allele media di 25 volte, il nostro algoritmo personalizzato, SPLINTER, utilizza una strategia di controllo interno variante chiamata per chiamare inserimenti, cancellazioni e sostituzioni fino a quattro paia di basi di lunghezza con alta sensibilità e specificità da pool di fino a 1 allele mutante in 500 individui. Qui si descrive il metodo per preparare il pool sequencing biblioteca seguita passo-passo le istruzioni su come usare il pacchetto per l&#39;analisi di sequenziamento SPLINTER aggregati ( <a href="http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter" target="_blank">http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter</a> ). Mostriamo un confronto tra sequenziamento pool di 947 individui, ognuno dei quali sono stati sottoposti a genome-wide array, a più di 20kb di sequenziamento a persona. Concordanza tra genotipizzazione di tag e varianti romanzo intitolato nel campione pool erano eccellenti. Questo metodo può essere facilmente scalabile a qualsiasi numero di loci genomici e qualsiasi numero di individui. Con l&#39;integrazione dei controlli interni ampliconi positivi e negativi a rapporti che imitano la popolazione in studio, l&#39;algoritmo può essere calibrato per ottenere prestazioni ottimali. Questa strategia può anche essere modificato per l&#39;utilizzo con la cattura ibridazione o individuale-specifici codici a barre e può essere applicato alla sequenza di campioni naturalmente eterogenei, come il DNA tumorale.

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Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

Sequenziamento del DNA pool è una strategia rapida ed efficace per individuare le varianti rare associate a fenotipi complessi in coorti di grandi dimensioni. Qui si descrive l&#39;analisi computazionale del pool, sequenziamento di prossima generazione di 32 geni legati al cancro utilizzando il pacchetto software SPLINTER. Questo metodo è scalabile, e applicabile a qualsiasi fenotipo di interesse.

Rilevamento di Rare varianti genomiche da Sequencing pool Uso SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

detection-rare-genomic-variants-from-pooled-sequencing-using

Research

JoVE Journal

Biology

15.0K Views.  Washington University School of Medicine. Sequenziamento del DNA pool è una strategia rapida ed efficace per individuare le varianti rare associate a fenotipi complessi in coorti di grandi dimensioni. Qui si descrive l'analisi computazionale del pool, sequenziamento di prossima generazione di 32 geni legati al cancro utilizzando il pacchetto software SPLINTER. Questo metodo è scalabile, e applicabile a qualsiasi fenotipo di interesse.