Bu çalışma Çocuk Discovery Enstitüsü hibe MC-II-2006-1 (RDM ve TED), NIH Epigenetik Yol Haritası hibe [1R01DA025744-01 ve 3R01DA025744-02S1] (RDM ve FLMV), U01AG023746 (SC), Saigh tarafından desteklenmiştir Vakfı (FLMV ve TED), 1K08CA140720-01A1 ve Alex&#39;in Limonata &quot;A&quot; Ödülü desteği (TED) durun. Biz genomik analizi ile yardım için Washington Üniversitesi Tıp Okulu&#39;nda Genetik Bölümü Genom Teknoloji Erişim Merkezi teşekkür ederim. Merkezi kısmen Araştırma Kaynakları için NationalCenter (NCRR), Sağlık (NIH), Ulusal Sağlık Enstitüleri bir bileşeni # UL1RR024992 NCI Kanser Merkezi Destek Hibe Siteman Kanser Merkezi&#39;ne # P30 CA91842 tarafından ICTS / CTSA hibe ile desteklenen ve bir Tıbbi Araştırma NIH Yol Haritası. Bu yayın sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka NCRR veya NIH resmi görüşü temsil etmez.

<ol>
	<li>Vallania, F. L. M., Druley, T. E., Ramos, E., Wang, J., Borecki, I., Province, M., Mitra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+discovery+of+rare+insertions+and+deletions+in+large+cohorts.">High-throughput discovery of rare insertions and deletions in large cohorts.</a> Genome Research. 20, 1391-1397 (2010).</li><li>Shendure, J., Mitra, R., Varma, C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+Sequencing+Technologies:+Methods+and+Goals.">Advanced Sequencing Technologies: Methods and Goals.</a> Nature Reviews of Genetics. 5, 335-344 (2004).</li><li>The 1000 Genomes Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+map+of+human+genome+variation+from+population-scale+sequencing.">A map of human genome variation from population-scale sequencing.</a> Nature. 467, 1061-1073 (2010).</li><li>Manolio, T. A., Collins, F. S., Cox, N. J., Goldstein, D. B., Hindorff, L. A., Hunter, D. J., McCarthy, M. I., Ramos, E. M., Cardon, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+missing+heritability+of+complex+diseases.">Finding the missing heritability of complex diseases.</a> Nature. 461, 747-753 (2009).</li><li>Reich, D. E., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+allelic+spectrum+of+human+disease.">On the allelic spectrum of human disease.</a> Trends Genet. 17, 502-510 (2001).</li><li>Cohen, J. C., Kiss, R. S., Pertsemlidis, A., Marcel, Y. L., McPherson, R., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+rare+alleles+contribute+to+low+plasma+levels+of+HDL+cholesterol.">Multiple rare alleles contribute to low plasma levels of HDL cholesterol.</a> Science. 305, 869-872 (2004).</li><li>Ji, W., Foo, J. N., O'Roak, B. J., Zhao, H., Larson, M. G., Simon, D. B., Newton-Cheh, C., State, M. W., Levy, D., Lifton, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+independent+mutations+in+renal+salt+handling+genes+contribute+to+blood+pressure+variation.">Rare independent mutations in renal salt handling genes contribute to blood pressure variation.</a> Nat. Genet. 40, 592-599 (2008).</li><li>Ahituv, N., Kavaslar, N., Schackwitz, W., Ustaszewska, A., Martin, J., Hebert, S., Doelle, H., Ersoy, B., Kryukov, G., Schmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+sequencing+at+the+extremes+of+human+body+mass.">Medical sequencing at the extremes of human body mass.</a> Am. J. Hum. Genet. 80, 779-791 (2007).</li><li>Druley, T. E., Vallania, F. L., Wegner, D. J., Varley, K. E., Knowles, O. L., Bonds, J. A., Robison, S. W., Doniger, S. W., Hamvas, A., Cole, F. S., Fay, J. C., Mitra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+rare+allelic+variants+from+pooled+genomic+DNA.">Quantification of rare allelic variants from pooled genomic DNA.</a> Nat. Methods. 6, 263-265 (2009).</li><li>Mitra, R. D., Butty, V., Shendure, J., Housman, D., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+Genotyping+and+Haplotyping+with+Polymerase+Colonies.">Digital Genotyping and Haplotyping with Polymerase Colonies.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 5926-5931 (2003).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Insidans ve sık, karmaşık fenotipleri ve obezite 8, hiperkolesterolemi 4, hipertansiyon 7 ve diğerleri gibi hastalıkların tedavi yanıtı nadir varyasyon kişisel profillerini moderatörlüğünü olabileceğini kanıtlar artmaktadır. Etkilenen popülasyonlarda agrega bu varyantların derin tanısal ve tedavi edici etkileri olacaktır genlerin ve yolların belirlenmesi, ancak ayrı olarak etkilenen bireylerin analiz zaman olabilir ve yasaklayıcı mal olabilir. Nüfus tabanlı analiz birden fazla odakta genetik çeşitliliği araştırmak için daha verimli bir yöntem sunar. Biz popülasyonlar arasında genetik varyasyon bu tip tanımlamak için tasarlanan SPLINTER&#39;da yazılım paketi ile eşleştirilmiş bir roman havuza-DNA dizi protokolü sunarız. We were nadir görülen varyantları da dahil olmak üzere, 947 kişilik geniş bir havuza nüfus içinde küçük allelleri tanımlanması ve miktarının bu yöntemin doğruluğunu göstermekbirleştirilmiş sıralama gelen de novo olarak adlandırılan ve bireysel pyrosequencing tarafından onaylanmıştır. Bizim strateji esas olarak bir pozitif kuruluş ve her deneme içinde bir negatif kontrol ile diğer protokoller farklıdır. Bu SPLINTER diğer yaklaşımlar 1 kıyasla çok daha yüksek doğruluk ve güç elde etmek için izin verir. Alel başına 25-kat arasında optimum kapsama havuz boyutu sadece ölçeklerde doğrusal olarak bu gerekliliği gibi büyük havuzlarının analizi olanaklı hale, bağımsız olarak havuz boyutu ile sabitlenir. Bizim yaklaşımımız çok esnek ve menfaat fenotipi değil, aynı zamanda karışık hücre popülasyonları ve tümör biyopsisi doğal olarak heterojen örnekleri, uygulanabilir. Böyle exome veya genom gibi büyük bir hedef bölgelerden toplanan sıralama içinde giderek artan ilgi dikkate alındığında, kütüphane hazırlık ve SPLINTER&#39;da analizi özel yakalama ve tam exome sıralama ile uyumludur, ancak SPLINTER&#39;da paketinde uyum programı için tasarlanmış değildi büyükreferanslar dizileri. Bu nedenle, başarılı bir şekilde birleştirilmiş örnek (Ramos ve ark., Incelemede) çağırıyor varyantı takip genom diziler için, Novoalign, dinamik programlama hizalama kullanmış olurlar. Böylece, birleştirilmiş sıralama stratejisi hedef dizisinin artan miktarda büyük havuzlarına başarıyla ölçeklendirilebilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Bölüm </td></tr><tr><td> PfuUltra Yüksek Sadakat </td><td> Agilent </td><td> 600384 </td><td> 1.4 </td></tr><tr><td> Betain </td><td> SIGMA </td><td> B2629 </td><td> 1.4 </td></tr><tr><td> M13mp18 ssDNA vektör </td><td> NEB </td><td> N4040S </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> pGEM-T kolay </td><td> Promega </td><td> A1360 </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> T4 nükleotid kinaz </td><td> NEB </td><td> M0201S </td><td> 2.2 </td></tr><tr><td> T4 Ligaz </td><td> NEB </td><td> M0202S </td><td> 2.2 </td></tr><tr><td> Polietilen Glikol 8000 MW </td><td> SIGMA </td><td> P5413 </td><td> 2.2 </td></tr><tr><td> Bioruptor sonikatör </td><td> Diagenode </td><td> UCD-200-TS</td><td> 2.3 </td></tr></tbody></table>

detection of rare genomic variants from pooled sequencing using splinter

DNA dizi analizi teknolojisi belirgin son yıllarda 2 ileri olduğu gibi, herhangi bir iki kişi arasındaki genetik varyasyonun miktarını daha önce 3 düşündüklerinden daha fazla olduğu giderek daha belirgin hale gelmiştir. Buna karşılık, dizi tabanlı genotipleme 4,5 yaygın hastalığın fenotipik değişkenlik ortak dizisi çeşitlerinin önemli bir katkı tanımlamak için başarısız oldu. Birlikte ele alındığında, bu gözlemler Ortak Hastalık / ortak ve karmaşık fenotipleri &quot;kayıp kalıtım&quot; ın yerine çoğunluk nadir ve özel DNA varyantlarının 6-8 bireyin kişisel tercihe bağlı olduğunu düşündüren Rare Variant hipotez evrim yol açmıştır . Ancak, nadir değişimi karmaşık fenotipleri nasıl etkilediğini karakterize birçok genomik lokuslar çok etkilenen bireylerin analiz gerektirir ve ideal bir etkilenmemiş kohortta benzer bir anketle karşılaştırıldığında. Bugünün platformlar, bir tarafından sunulan güç sıralaması rağmenbirçok genomik lokusları ve gerekli sonraki sayısal analiz nüfus tabanlı anket birçok araştırmacı için engelleyici kalır. Bu gereksinimi karşılamak için, biz bir birleştirilmiş sıralama yaklaşımı 1,9 ve elde edilen veriler son derece doğru nadir değişken tespiti için yeni bir yazılım paketi 1 geliştirdik. Etkilenen bireylerin ve anket tek bir sıralama kütüphanede birden fazla hedef bölgelerde genetik varyasyonun derecesi, tüm nüfusun Havuzu genom yeteneği geleneksel tek-örnek sıralama metodolojisi mükemmel bir maliyet ve zaman tasarrufu sağlar. 25 kat allel başına ortalama sıralama kapsama ile, bizim özel algoritması, SPLINTER, 1 kadar havuzları yüksek duyarlılık ve özgüllük uzunluğunda dört baz çiftlerine eklemeler, silmeler ve oyuncu çağırmak için bir iç varyant arayarak kontrol stratejisi kullanıyor 500 bireylerde mutant allel. Burada toplanmış s hazırlanması için bir yöntem tarifkütüphane equencing havuzlanmış dizi analizi (SPLINTER&#39;da paketini nasıl kullanılacağı hakkında adım adım talimatları takip <a href="http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter" target="_blank">http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter</a> ). Biz 947 birey toplanmış dizi arasında bir karşılaştırma gösteriyor, bunların hepsi de kişi başına sıralama ile 20kb üzerinde de, genom dizisi yapıldı. Etiketlediniz genotipleme ve havuza örnek olarak adlandırılan yeni varyantları arasındaki uyum mükemmeldi. Bu yöntem kolay genomik lokus ve bireylerin herhangi bir sayı herhangi bir sayı kadar ölçeklendirilebilir. Çalışma kapsamında nüfus taklit oranlarda iç pozitif ve negatif amplikon kontrolleri birleşmeyle, algoritmanın optimum performans için kalibre edilebilir. Bu strateji, aynı zamanda hibridizasyon yakalama ya da tek tek spesifik barkodlar ile kullanılmak üzere modifiye edilebilir ve bu tür tümörün DNA gibi doğal olarak heterojen örnekleri, bir sekanslama için uygulanabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER at JoVE.com

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

Pooled DNA dizi büyük kohortlarında karmaşık fenotipleri ile ilişkili nadir türevlerini algılamak için hızlı ve maliyet-etkin bir stratejidir. Burada SPLINTER&#39;da yazılım paketi kullanarak 32 kanser ilişkili genlerin havuzlu, yeni nesil dizileme sayısal analiz açıklanmaktadır. Bu yöntem, ölçeklenebilir ve menfaat fenotipi için geçerlidir.

SPLINTER kullanarak Pooled Sıralama gelen Nadir Genomik Variantların Algılama

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

detection-rare-genomic-variants-from-pooled-sequencing-using

Research

JoVE Journal

Biology

15.0K Görüntüleme.  Washington University School of Medicine. Pooled DNA dizi büyük kohortlarında karmaşık fenotipleri ile ilişkili nadir türevlerini algılamak için hızlı ve maliyet-etkin bir stratejidir. Burada SPLINTER'da yazılım paketi kullanarak 32 kanser ilişkili genlerin havuzlu, yeni nesil dizileme sayısal analiz açıklanmaktadır. Bu yöntem, ölçeklenebilir ve menfaat fenotipi için geçerlidir.