La veine saphène est soudainement exposée à des conditions artérielles après un pontage aortocoronarien. Comprendre sa réponse d’adaptation au stress mécanique peut aider à concevoir des outils thérapeutiques pour prévenir l’échec de la greffe veineuse. Ce protocole d’isolement des cellules endothéliales est très simple et ne nécessite qu’une incubation avec de la collagénase.
Avec une manipulation minimale des vaisseaux, il en résulte une contamination réduite par les cellules musculaires lisses et les fibroblastes. Le protocole d’isolement des SVEC humaines et de leur culture sous contrainte de cisaillement et étirement cyclique est essentiel pour comprendre la contribution des forces mécaniques dans le dysfonctionnement des cellules endothéliales associé à la défaillance de la greffe de veine saphène. La culture cellulaire endothéliale préalable est très exigeante en termes de suppléments de milieux cellulaires.
Il est obligatoire d’ajouter des facteurs de croissance pour réussir à isoler une culture, les SVEC humains. Pour isoler les cellules endothéliales de la veine saphène humaine primaire ou les SVEC humains, prélever au moins un segment de veine saphène de deux à trois centimètres de long. En travaillant sous une hotte laminaire stérile, transférer le segment veineux dans une boîte de Petri remplie de PBS préchauffé.
Pour retirer tout le sang de l’intérieur de la lumière, insérez un embout de pipette attaché à une pipette et rempli de PBS dans une extrémité de la veine et rincez-le doucement. Rincez-le jusqu’à ce que le flux de lavage devienne complètement clair. Fermez ensuite une extrémité de la veine avec une suture de coton stérile.
Remplissez soigneusement le récipient avec une solution de collagénase de type 2 milligramme par millilitre et fermez l’autre extrémité du récipient avec une suture en coton. Incuber le récipient avec une solution de collagénase dans une atmosphère humidifiée de 5% de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, coupez une extrémité du récipient sur un tube de 15 millilitres pour recueillir la solution de collagénase avant de couper l’autre extrémité.
Rincer la surface luminale avec un à deux millilitres de PBS pour recueillir toutes les cellules endothéliales détachées à l’intérieur du tube avec de la collagénase. Centrifuger le tube à 400G à température ambiante pendant cinq minutes. Après avoir retiré le surnageant, remettre en suspension la pastille cellulaire dans trois à quatre millilitres de milieu cellulaire endothélial complet contenant une solution supplémentaire d’héparine.
Plaquer les cellules dans une boîte de culture cellulaire de 60 millimètres pré-enrobée de gélatine à 3% de poids par volume. Incuber les cellules dans une atmosphère humidifiée pendant quatre jours sans changer le milieu. Après cela, changez le milieu tous les deux jours sans ajouter la supplémentation en héparine.
Examinez la plaque au microscope pour vous assurer que les globules rouges ont été retirés. Après un à quatre jours après l’extraction, selon la taille et le diamètre du segment veineux, visualisez les SVEC humains par microscopie à contraste de phase pour évaluer le degré de confluence et leur morphologie pavée. Continuez à changer le média tous les deux jours jusqu’à ce que les cellules atteignent 70% à 80% de confluence.
Enduire la lame de la chambre d’écoulement de gélatine à 0,1 % du poids par volume et incuber pendant au moins 30 minutes à 37 degrés Celsius. Pour équilibrer l’unité fluidique et l’ensemble de perfusion stérile ayant des réservoirs de 10 millimètres, incuber ceux-ci pendant la nuit dans une atmosphère humidifiée. Pour l’expérience de contrainte de cisaillement, ensemencer 200 000 cellules endothéliales en suspension dans 100 microlitres de milieu de culture dans la glissière de chambre d’écoulement recouverte de gélatine.
Pour attacher les cellules à la surface de culture, incuber les cellules pendant quatre heures. Placez le jeu de perfusion sur l’unité fluidique. Remplissez les réservoirs et l’ensemble de perfusion avec environ 12 millilitres de milieu cellulaire endothélial complet préchauffé.
Retirez les bulles d’air de l’ensemble de perfusion pour équilibrer le niveau des deux réservoirs à cinq millilitres. Placez l’unité fluidique sur le jeu de perfusion monté sans la glissière de chambre dans l’incubateur et connectez son câble électrique à la pompe régulée par ordinateur. En exécutant le protocole prédéfini dans le logiciel de contrôle de la pompe, éliminez toutes les bulles d’air des réservoirs et du jeu de perfusion.
Prenez l’unité fluidique avec la perfusion montée fixée à la hotte à flux laminaire et fixez les lames ayant une monocouche de cellule de confluence. Après avoir placé l’ensemble de l’unité avec les glissières dans l’incubateur, connectez son câble électrique à la pompe. Dans le logiciel de contrôle de la pompe, réglez la configuration de l’unité fluidique en sélectionnant le type de glissière et en réglant la viscosité du fluide.
Dans Paramètres d’écoulement, entrez la valeur de la contrainte de cisaillement et définissez la durée du cycle et le type d’écoulement. Cliquez ensuite sur le bouton de lecture pour démarrer l’expérience. N’oubliez pas de maintenir la lame avec des cellules traitées avec le même média sans exposition au débit que les témoins statiques.
Appliquez un lubrifiant à base de silicone sur le dessus et les côtés de la station de chargement équibiaxiale à 6 puits de 25 millimètres. Ensemencer 400 000 cellules en suspension dans trois millilitres dans chaque puits des plaques de culture à fond flexible à 6 puits recouvertes d’un collagène. Incuber les cellules dans de l’air humidifié jusqu’à ce qu’elles atteignent 100% de confluence.
Avant de commencer le protocole d’étirement, lavez les cellules une fois avec du PBS préchauffé et ajoutez trois millilitres de milieu de culture frais par puits. Insérez la plaque de base avec toutes les stations de chargement lubrifiées dans l’incubateur et connectez correctement le tube à l’équipement de contrôle du système de bioréacteur d’étirement de cellule de tension. Fixez chaque plaque de culture à un joint rouge fourni par le système de bioréacteur.
Ensuite, placez-les dans la plaque de base de l’incubateur. Placez les quatre plaques de culture dans la plaque de base pour obtenir une charge de vide et d’étirement appropriée. Mettez sous tension le contrôleur et le système informatique.
Ouvrez le logiciel de contrôle FlexCell et configurez le schéma souhaité, y compris le pourcentage d’allongement, la forme d’onde, la fréquence et le temps. Enregistrez le régime. Allumez le système d’aspiration, puis sélectionnez le régime et cliquez sur Démarrer sur l’écran de l’ordinateur pour exécuter l’étirement.
Vérifiez que la membrane de silicone bouge et étire les cellules. Les cellules endothéliales adhérentes ont pu être observées 4 à 10 jours après l’extraction. Ils forment initialement des amas cellulaires présentant une morphologie pavée typique.
Ils ont exprimé les marqueurs CE CD31 et VE-cadhérine. Les hSVEC, lorsqu’ils sont cultivés sous contrainte de cisaillement, sont alignés dans la direction de l’écoulement. La contrainte de cisaillement de 20 dynes par centimètre carré pendant 72 heures induit l’expression de gènes mécanosensibles typiques, KLF2, KLF4 et NOS3, indiquant l’efficacité du stimulus de cisaillement.
Le résultat de l’étirement cyclique dépendait de l’intensité appliquée aux SVEC humains. Les cellules sous faible étirement ont montré un motif cortical F-actine similaire aux cellules statiques. Sans changement dans la libération d’oxyde nitrique jusqu’à 72 heures, nos niveaux artériels d’étirement ont remodelé le cytosquelette d’actine après 24 heures et diminué la libération de NO après 72 heures.
Outre les études de stress mécanique, les chercheurs peuvent utiliser les cellules isolées pour effectuer diverses méthodes afin d’élargir les connaissances sur la fonction et le dysfonctionnement des cellules endothéliales. En suivant le protocole démontré, il est possible d’étudier tout autre type de cellules endothéliales sous contrainte de cisaillement et d’étirement.
